DNA重組的技術(shù)基本工具

會計學1DNA重組的技術(shù)基本工具每100kg豬或牛的胰腺中僅可提取4~5g。

1979年，美國將人的胰島素基因重組到大腸桿菌內(nèi)，實現(xiàn)了細菌生產(chǎn)胰島素，大大降低了生產(chǎn)成本。治療糖尿病特效藥——

據(jù)WTO調(diào)查：

2005年全世界約有糖尿病患者1.8億人，我國約6000萬。胰島素思考：轉(zhuǎn)基因技術(shù)實現(xiàn)了一種生物的某些性狀在另一種生物中表達。這些性狀的表達與我們學過的基因的什么過程有關(guān)？密碼子在生物界是的！DNA(基因)

mRNA蛋白質(zhì)(性狀)轉(zhuǎn)錄翻譯通用第1頁/共51頁基因工程的產(chǎn)物第2頁/共51頁什么叫基因工程？

基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設(shè)計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)?；蚬こ痰母拍畹?頁/共51頁補充：對基因工程概念的理解別名：基因拼接技術(shù)，DNA重組技術(shù)操作環(huán)境：生物體外操作對象：基因操作水平：DNA分子水平基本過程：剪切→拼接→導入→表達結(jié)果：人類需要的基因產(chǎn)物第4頁/共51頁基因工程得以實現(xiàn)的理論基礎(chǔ)：（1）所有生物DNA的化學組成和結(jié)構(gòu)相同。（為不同種生物DNA拼接成功提供物質(zhì)基礎(chǔ)）（2）所有生物共用一套遺傳密碼子。（為某生物的基因能夠在其他生物細胞內(nèi)正常指導蛋白質(zhì)合成提供可能。）都是以4種脫氧核苷酸為基本單位都是雙螺旋結(jié)構(gòu)第5頁/共51頁問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細菌的毒蛋白基因在棉花細胞中表達，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。

想一想需要做哪些關(guān)鍵工作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉第6頁/共51頁基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：在以上過程中關(guān)鍵步驟或難點是什么？普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因通過運載體導入轉(zhuǎn)基因棉花含抗蟲基因轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)生伴胞晶體轉(zhuǎn)基因棉花有抗蟲特性第7頁/共51頁基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進入棉花細胞第8頁/共51頁解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進入棉花細胞“分子縫合針”——DNA連接酶“分子運輸車”——基因進入受體細胞的載體1.1、DNA重組技術(shù)的基本工具第9頁/共51頁一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”1.主要來源：⒉種類與命名：⒊作用特點：4.限制酶識別序列5.作用結(jié)果：

識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。主要從原核生物中分離純化產(chǎn)生黏性末端或平末端Goon大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成少數(shù)的識別序列由4、5或8個核苷酸組成第10頁/共51頁尋根問底你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細菌的一種防御性工具，當外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達到保護自身的目的。Goback第11頁/共51頁⒉種類與命名：

現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內(nèi)切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratiamarcesens）大腸桿菌（EscherichiacoliR）Goback練習：流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ第12頁/共51頁磷酸二酯鍵T12345A12345HHHHHOT12345A12345HHHHOH2O+第13頁/共51頁O第14頁/共51頁DNA分子切割DNA分子實質(zhì)是斷開兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。補充：脫氧核苷酸中脫氧核糖的五個碳原子和氧原子的定位。1234512OO圖1－2第15頁/共51頁限制酶DNA解旋酶區(qū)別限制性內(nèi)切酶與DNA解旋酶的區(qū)別切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵將DNA兩條鏈的氫鍵打開形成兩條單鏈限制酶DNA水解酶區(qū)別限制性內(nèi)切酶與DNA水解酶的區(qū)別切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵，形成片段的DNA.切割磷酸二酯鍵，形成單個的脫氧核苷酸。Goback第16頁/共51頁限制酶的識別序列：能被限制性內(nèi)切酶特異性識別的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。Goback第17頁/共51頁

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback第18頁/共51頁

EcoRⅠ黏性末端黏性末端重復演示Goback第19頁/共51頁什么叫黏性末端？

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，它們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。第20頁/共51頁SmaⅠ平末端平末端第21頁/共51頁……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來源的DNA片段混合將不同種來源的DNA片段連接起來生物A基因片段生物B基因片段……G

AATTC…………CTTAA

G……酶切……GAATTC…………CTTAAG…………G

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G…………G

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G……同一種第22頁/共51頁DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點尋根問底DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?1)只能將單個核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成一條互補的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來，不需要模板第23頁/共51頁

可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵第24頁/共51頁

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低T4DNA連接酶第25頁/共51頁二、“分子縫合針”

——DNA連接酶①作用:

把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來.②作用原理：催化磷酸二酯鍵形成第26頁/共51頁③類型：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點差別第27頁/共51頁三、“分子運輸車”

——基因進入受體細胞的載體⒈載體需要的條件：⑴有1~多個限制酶切點⑵對受體細胞無害⑶導入基因能在受體細胞中復制、表達⑷有某些標記基因，便于篩選⒉常用運載體：⑴細菌的質(zhì)粒⑵λ噬菌體衍生物或某些動植物病毒⑶假如目的基因?qū)胧荏w細胞后不能復制或不能轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)基因生物能有預想的效果嗎？⑴作為分子運輸車——載體，如果沒有切割位點將會怎樣？⑵霍亂菌的質(zhì)粒多個限制酶切點，你會用它來做分子運輸車嗎？

⑷目的基因有沒有進入受體細胞，如何去發(fā)現(xiàn)？

第28頁/共51頁常用的載體：質(zhì)粒能復制并帶著插入的目的基因一起復制有切割位點有標記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別第29頁/共51頁第30頁/共51頁思考與探究P7（2）為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA？

通過長期的進化，細菌中含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列；或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。第31頁/共51頁3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？提示：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質(zhì)粒（plasmid），即獨立于細菌擬核染色體DNA之外的一種可以自我復制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。是否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體使用呢？不是，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件：思考與探究P7第32頁/共51頁4、DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？

迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來會發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈DNA的酶。思考與探究P7第33頁/共51頁1.在基因工程中，切割運載體和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同種限制酶B.兩種限制酶同種連接酶D.兩種連接酶A課堂練習第34頁/共51頁2.不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是

A、能復制（）

B、有多個限制酶切點

C、具有標記基因

D、它是環(huán)狀DNAD課堂練習第35頁/共51頁3.以下說法正確的是（）

A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列

B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體

C、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接

D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來C課堂練習第36頁/共51頁再見第37頁/共51頁基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論達爾文提出生物進化論第38頁/共51頁基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論孟德爾提出基因的分離定律和自由組合定律第39頁/共51頁基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論

摩爾根證明基因在染色體上，并提出基因的連鎖互換定律。第40頁/共51頁基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

艾弗里證明DNA是遺傳物質(zhì)，DNA可從一種生物個體轉(zhuǎn)移到另一種生物個體。第41頁/共51頁基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。第42頁/共51頁基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復制第43頁/共51頁基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復制第44頁/共51頁基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實驗加以證明。第45頁/共51頁基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路1)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2)工具酶的發(fā)現(xiàn)3)DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明4)DNA體外重組的實現(xiàn)5)重組DNA表達實驗的成功