催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)多底物

催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)多底物第一頁，共四十三頁，2022年，8月28日第一節(jié)單底物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第三節(jié)多底物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第四節(jié)別構(gòu)酶動(dòng)力學(xué)第五節(jié)pH和溫度對(duì)酶催化反應(yīng)速度的影響主要內(nèi)容第四章酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第二頁，共四十三頁，2022年，8月28日第三節(jié)多底物動(dòng)力學(xué)大多數(shù)酶促反應(yīng)是多底物反應(yīng),其動(dòng)力學(xué)機(jī)理復(fù)雜。第三頁，共四十三頁，2022年，8月28日一、酶促反應(yīng)分類底物數(shù)目酶分類催化反應(yīng)比例（%）單底物單向單底物假單底物雙底物三底物異構(gòu)酶裂合酶水解酶氧化還原酶基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶連接酶

略5122627246第四頁，共四十三頁，2022年，8月28日大多數(shù)酶催化反應(yīng)是兩個(gè)或多個(gè)底物參與的反應(yīng)(以雙底物反應(yīng)物系統(tǒng)為例討論),以轉(zhuǎn)移反應(yīng)為主,占總酶促反應(yīng)的50%左右；真正的單底物反應(yīng)只有異構(gòu)反應(yīng)(異構(gòu)酶催化的反應(yīng)),只占總酶促反應(yīng)的5%,將單向的單底物反應(yīng)(裂合酶反應(yīng))計(jì)算在內(nèi),也不超20%；第五頁，共四十三頁，2022年，8月28日二、多底物的命名、表示方法以雙底物雙產(chǎn)物例:（1）底物按與酶結(jié)合次序分A、B、C、D；（2）產(chǎn)物按脫離次序分P、Q、R、S；（3）抑制劑I；（4）中間產(chǎn)物分穩(wěn)態(tài)和過渡態(tài)（非/中心過渡態(tài)）；穩(wěn)態(tài):酶與底物共價(jià)結(jié)合,可與另一底物發(fā)生雙分子反應(yīng);過渡態(tài):(1)酶活中心未完全占據(jù);(2)酶活中心已完全占據(jù).（5）穩(wěn)態(tài)中間物用E、F、G表示，過渡態(tài)用EA、EB、EAB表示，通常只假定存在著一種中心過渡態(tài)中間物（EAEP）表示其異構(gòu)化（一）Cleland命名和表示方法第六頁，共四十三頁，2022年，8月28日Cleland命名和表示方法（6）單（Uni),雙（Bi),三（Tri),四（Quad)等表示如，BiBi:雙底物雙產(chǎn)物；UniBi:單底物雙產(chǎn)物。按反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分：有序：指所有底物與酶結(jié)合必須在任何產(chǎn)物釋放之前！（1）序列有序：酶與底物結(jié)合嚴(yán)格按一定順序進(jìn)行；（2）序列隨機(jī)：底物與酶結(jié)合順序隨意；乒乓：一部分底物與酶結(jié)合后即釋放一部分產(chǎn)物再結(jié)合另一部分底物再釋放一部分產(chǎn)物！（7）酶促反應(yīng)歷程用直線表示（除隨機(jī)）（8）隨機(jī)機(jī)制用菱形表示；（9）Km表示米氏常數(shù)，Ki表示抑制常數(shù)。第七頁，共四十三頁，2022年，8月28日（二）多底物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分類本節(jié)主要討論BiBi反應(yīng)；按反應(yīng)方式歷程(是否形成三元絡(luò)合物)分為兩大類:（序列與乒乓）1、形成三元絡(luò)合物（1）序列有序機(jī)制（2）序列隨機(jī)機(jī)制第八頁，共四十三頁，2022年，8月28日底物與酶結(jié)合有一定嚴(yán)格順序，先A后B,產(chǎn)物釋放也有同樣規(guī)定次序，先P（B產(chǎn)物）后Q（A產(chǎn)物）.以NAD+、NADP+為輔酶的脫氫酶為此類機(jī)制；例：NAD++CH3CH2OHCH3CHO+NADH+H+（A）（B）（P）（Q）（1）序列有序反應(yīng)cleland表示法第九頁，共四十三頁，2022年，8月28日說明（1）中心過渡態(tài)EAB可轉(zhuǎn)變?yōu)镋PQ，也可直接分解為產(chǎn)物，或此中間物有一系列推導(dǎo)出的方程一樣；（2）若酶本身發(fā)生異構(gòu)化，則為異型序列BiBi，推導(dǎo)出的方程與（1）有所不同;（3）特殊序列有序機(jī)制：EAB形成很慢分解極快在動(dòng)力學(xué)上可忽略。為Theorell-Chance機(jī)制EEEAEQABPQ第十頁，共四十三頁，2022年，8月28日（2）序列隨機(jī)機(jī)制底物與酶結(jié)合的先后是隨機(jī)的，產(chǎn)物釋放也是隨機(jī)的。少數(shù)脫氫酶和一些轉(zhuǎn)磷酸基團(tuán)的激酶屬于這一類。如肌酸激酶反應(yīng),Cleland表示法肌酸+ATP磷酸肌酸+ADP(A)(B)(P)(Q)第十一頁，共四十三頁，2022年，8月28日2、反應(yīng)過程不形成三元絡(luò)合物即乒乓機(jī)制；雙置換反應(yīng)(double-displacementreactions)；特征:酶E與底物A生成復(fù)合體，產(chǎn)物P的脫離在另一底物B加入之前。E+AEAEPFEQE+QFBPB第十二頁，共四十三頁，2022年，8月28日乒乓機(jī)制圖解A和Q競爭自由酶E形式,B和P競爭修飾酶E’即第十三頁，共四十三頁，2022年，8月28日屬于乒乓機(jī)制的酶大多數(shù)是具有輔酶的，如轉(zhuǎn)氨酶等(催化從氨基酸轉(zhuǎn)移氨基到酮酸)，一些糖苷轉(zhuǎn)移酶也是；如轉(zhuǎn)氨酶先與氨基酸（A）作用產(chǎn)生EA釋放酮酸（產(chǎn)物P），期間輔酶結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變酶E變成酶F，F(xiàn)再與底物B（另一酮酸）作用釋放產(chǎn)物（相應(yīng)氨基酸）第十四頁，共四十三頁，2022年，8月28日三、雙底物反應(yīng)恒態(tài)動(dòng)力學(xué)對(duì)特定反應(yīng)歷程要得到其穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)一般步驟:(1)寫出反應(yīng)歷程的方程式(2)再寫出包含各種酶形式的微分方程,建立穩(wěn)態(tài)后各種酶存在的形式濃度變化可做等于0(3)根據(jù)質(zhì)量守恒條件去尋找各種酶存在形式的濃度代數(shù)解,最終得到酶促反應(yīng)的速度方程1956年King和Altman在矩陣?yán)碚摶A(chǔ)上提出了一個(gè)簡便方法后經(jīng)Wong和Hanes加以規(guī)則化1、King-Altman方法推導(dǎo)速度方程第十五頁，共四十三頁，2022年，8月28日King-Altman方法大體步驟(1)寫出反應(yīng)歷程,安排成封閉的幾何圖形圖1式1的K-A圖式1第十六頁，共四十三頁，2022年，8月28日(2)寫出n-1線的所有可能的圖形n代表角數(shù)(即酶的存在形式!),m為完整圖形的線數(shù),則它的n-1線圖形總數(shù)為圖2：圖1的n-1線圖形第十七頁，共四十三頁，2022年，8月28日封閉圈問題！當(dāng)反應(yīng)歷程構(gòu)成的基本圖形不止一個(gè)封閉圈時(shí),在寫n-1線圖時(shí),應(yīng)把含有封團(tuán)圈的圖形扣除!第十八頁，共四十三頁，2022年，8月28日(3)按K-A圖形寫出各種酶存在的濃度和總酶濃度的比例,基本表達(dá)式:爭對(duì)每種酶形式,按圖2表示的n-1線圖中3個(gè)形式分別寫出其形成過程,可得到:[E0]為總酶濃度,有(1)(2)第十九頁，共四十三頁，2022年，8月28日(4)可方便寫出速度方程(3)將(1)、（2）式代入（3）可得式，簡化之得第二十頁，共四十三頁，2022年，8月28日這個(gè)方程式和用數(shù)學(xué)法推導(dǎo)出的單底物單產(chǎn)物速度方程形式相同。兩例中酶的形式數(shù)不同，結(jié)果相同，這是因?yàn)榉磻?yīng)歷程中EAEP為中心復(fù)合物。圖解法推導(dǎo)時(shí)中心復(fù)合物是可以當(dāng)作一個(gè)酶形式來處理的，雖然此處它們被當(dāng)作兩個(gè)酶形式來處理的，但導(dǎo)出的公式和做為一個(gè)酶形式來處理是完全相同的。說明:第二十一頁，共四十三頁，2022年，8月28日初速度方程所得到的速度方程的一般形式及初速度方程和以前數(shù)學(xué)推導(dǎo)的結(jié)果完全相同。第二十二頁，共四十三頁，2022年，8月28日2.Alberty表達(dá)式許多雙底物酶促反應(yīng)在固原定一個(gè)底物濃度而改變另一個(gè)底物濃度時(shí)服從米氏方程式；對(duì)許多雙底物酶促反應(yīng)，在總酶濃度固定并遠(yuǎn)小于兩個(gè)底物濃度時(shí)，Alberty根據(jù)K-A圖形法推導(dǎo)出其方程一般形式為：goback第二十三頁，共四十三頁，2022年，8月28日討論1、[B0]濃度很高時(shí)，簡化為：與米氏方程一樣！水解酶類的酶促反應(yīng)就如此；2、[B0]固定但未飽和:

這也是米氏方程一種形式！3、序列有序機(jī)制時(shí),混合常數(shù)為KASKBm,非KAmKBm;4、序列隨機(jī)機(jī)制中則都適用;5、乒乓機(jī)制初速度內(nèi)P極低,逆過程忽略,KAS=0,簡化為:第二十四頁，共四十三頁，2022年，8月28日雙倒數(shù)圖討論由上分析,當(dāng)固定一底物濃度改變另一底物濃度時(shí)遵守米氏方程;相應(yīng)雙倒數(shù)圖為線性,分酶完全飽和和半飽和。1/[A0]1/v0斜率=KAm/vmax1/vmax1/[A0]1/v0斜率=(KAm+KAsKBm/[B0])/vmax(1+KBm/B0)/vmax[B0]飽和時(shí)1/v0~1/[A0]B0固定≈KBm時(shí)1/v0~1/[A0](b)(a)[A0]固定或飽和亦然！第二十五頁，共四十三頁，2022年，8月28日附1：Alberty方程系數(shù)求解（不飽和）用二次作圖法！1、先雙倒數(shù)作圖：1/v~1/[A0],此時(shí)固定不同的[B0]例：甘油脫氫酶催化甘油的反應(yīng)是依賴NAD+的有序BiBi反應(yīng)：1/v1/[A0][B0]NAD+

+GlyNADH+DHAGDHAB第二十六頁，共四十三頁，2022年，8月28日2、再分別以截矩對(duì)1/[B0]作圖：1/[B0]1/[B0]~1/[B0]其二次作圖的豎軸截矩為1/Vm，斜率為KmB/Vm，橫軸截矩為KmB1/VmKmB/Vm以斜率對(duì)1/[B0]作圖：亦然！??！KmB第二十七頁，共四十三頁，2022年，8月28日附2：穩(wěn)態(tài)法推導(dǎo)多底物反應(yīng)方程例用穩(wěn)態(tài)法推導(dǎo)，可獲得穩(wěn)態(tài)法方程:①序列機(jī)制的底物動(dòng)力學(xué)的推導(dǎo)第二十八頁，共四十三頁，2022年，8月28日序列隨機(jī)機(jī)制穩(wěn)態(tài)推導(dǎo)kA[E][A]=k-A[EA]k1A[EB][A]=k-1A[EBA]k1B[EA][B]=k-1B[EBA]設(shè)第二十九頁，共四十三頁，2022年，8月28日[E0]=[E]+[EA]+[EB]+[EAB]V=k[EAB]Vm=k[E0]各項(xiàng)代入約去[EAB]，上下同乘[A][B]（I）與Alberty表達(dá)式完全相同!第三十頁，共四十三頁，2022年，8月28日酶對(duì)底物A的米氏常數(shù)(B飽和時(shí))酶對(duì)底物B的米氏常數(shù)(A飽和時(shí))[A][B]都達(dá)飽和時(shí)最大反應(yīng)速度為底物A與E結(jié)合的解離常數(shù)

當(dāng)

則得式（II），與米氏方程相同:Vm（II）（I）第三十一頁，共四十三頁，2022年，8月28日②乒乓機(jī)制推導(dǎo)由于產(chǎn)物P濃度極低,逆過程可忽略,式（I）中KsA=0故其速度方程為:第三十二頁，共四十三頁，2022年，8月28日3.Dalziel表達(dá)式Dalziel關(guān)于雙底物的一般表達(dá)式：第三十三頁，共四十三頁，2022年，8月28日動(dòng)力學(xué)系數(shù)Φ求解①一次作圖原方程變換如下式：固定不同[B0]，作[E0]/v0~1/[A0]得一系列直線：[B0]1/[A0][E0]/v0斜率第三十四頁，共四十三頁，2022年，8月28日②再二次作圖：分別用一次作圖截矩、一次作圖斜率對(duì)1/[B0]作圖：1/[B0]一次作圖截矩截矩=

Ф0斜率=ФB1/[B0]一次作圖斜率截矩=ΦA(chǔ)斜率=ΦA(chǔ)B第三十五頁，共四十三頁，2022年，8月28日實(shí)例甲醛脫氫酶FADH催化甲酸轉(zhuǎn)化為甲醛.此反應(yīng)為雙底物酶促反應(yīng),式中Ф為動(dòng)力學(xué)系數(shù);[E0]為酶濃度;[A0]、[B0]為底物A、B濃度.將方程寫成以下形式根據(jù)Dalziel提出的雙底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式,采用兩步法作圖即可求得反應(yīng)過程的動(dòng)力學(xué)常數(shù).截距Y1,斜率Y2AB第三十六頁，共四十三頁，2022年，8月28日先固定B(甲酸)的濃度,以[E0]/V~1/[A]作圖,得到截距Y1和斜率Y2;在不同B的濃度下可得到不同的Y1和Y2(圖1A;再以Y1~1/[B]和Y2~1/[B]進(jìn)行二次作圖(圖1B),即可求得Ф0,ФA,ФB,Ф

AB。圖1A37℃,pH7.0下游離甲醛脫氫酶酶促反應(yīng)圖圖1B圖1A截距Y1～1/[HCOOH]、斜率Y2～1/[HCOOH]關(guān)系圖最后通過Dalziel方程和Alberty方程之間的常數(shù)轉(zhuǎn)換關(guān)系求得反應(yīng)的米氏常數(shù).第三十七頁，共四十三頁，2022年，8月28日Dalziel與Alberty比較比較兩方程雙倒數(shù)形式,有:vmax=[E0]/Ф,得:[E0]=vmaxФ,將其代入Dalziel方程雙倒數(shù)形式中可得：再與Alberty雙倒數(shù)方程比較有：KAm=ФA/ФKBm=ФB/Ф,KAs=ФAB/ФB

1,

Dalziel方程可轉(zhuǎn)化為Alberty方程，并可求得相應(yīng)常數(shù)之間關(guān)系:第三十八頁，共四十三頁，2022年，8月28日2,Dalziel表達(dá)式比Alberty表達(dá)式中常數(shù)形式更直觀Dalziel形式（4-61）Alberty形式（4-62）EEA[P]FEB[Q]k1[A0]k3[B0]k-1k-3k2k4穩(wěn)態(tài)乒乓BiBiKing-Altman圖