免疫組織化學

免疫組織化學第一頁，共六十頁，2022年，8月28日1.1概念

免疫組織化學（immunohistochemistry）:

將化學反應中呈色反應與免疫學抗原抗體反應結合起來，用標記的特異性抗體（或抗原）對細胞及組織內(nèi)抗原（或抗體）的分布進行組織或細胞內(nèi)原位檢測的一門技術。第一節(jié)概述

第二頁，共六十頁，2022年，8月28日1.2與組織化學的關系

從廣義上理解：免疫組織化學為組織化學的分支。不同點：

組織化學的局限性：只能識別細胞或組織中核酸、蛋白質、酶、多糖、脂肪等，對免疫活化的大分子不能特異識別；方法上繁鎖，不易掌握。第三頁，共六十頁，2022年，8月28日

免疫組化的優(yōu)點：能識別細胞或組織中蛋白質、脂、多糖類及小分子肽類。只要理論上具有抗原性，可以制備出相應抗體，就可以示蹤定位，因此其待檢物質廣泛；方法上“一通百通”。1.3免疫組化在生物學中的應用

第四頁，共六十頁，2022年，8月28日第二節(jié)

免疫組織化學的理論基礎

第五頁，共六十頁，2022年，8月28日2.1抗原2.1.1定義抗原(antigen，Ag)是一類在合適條件下，能刺激機體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應答，并能與免疫應答產(chǎn)生的效應物質（包括抗體和效應細胞）在體內(nèi)和（或）體外發(fā)生特異性結合反應的物質，它具有免疫原性和反應原性。第六頁，共六十頁，2022年，8月28日免疫原性指的是它能刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應答；反應原性指的是它能與抗體或致敏淋巴細胞特異性地結合而發(fā)生反應。第七頁，共六十頁，2022年，8月28日2.1.2分類

完全抗原:兼有免疫原性和反應原性的物質稱完全抗原。大多數(shù)蛋白質是良好的完全抗原。

半抗原:只有反應原性而無免疫原性的物質稱半抗原或不完全抗原，絕大多數(shù)低分子量的多糖和所有的類脂均屬半抗原。第八頁，共六十頁，2022年，8月28日2.1.3抗原的特異性抗原具有與相應抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生反應的特異性。這是由抗原分子表面具有化學活性的基團—抗原決定簇的性質、數(shù)目和空間構型決定的?？乖瓫Q定簇能被免疫活性細胞所識別，能與相應抗體的可變區(qū)結合。

第九頁，共六十頁，2022年，8月28日2.1.4抗原的異物性

抗原化學結構必須與宿主自身物質的化學結構相異。

①異種物質。如鴨血清蛋白對于兔為強抗原，對于雞則為弱抗原。②同種異體物質。如人類的ABO血型的抗原物質；③自身抗原。如被血——睪屏障所嚴密封閉的精子所含的物質。

第十頁，共六十頁，2022年，8月28日2.2抗體

2.2.1定義抗體(antibody)是機體在抗原物質刺激后，通過體液免疫應答，由漿細胞合成并分泌的僅與該抗原發(fā)生特異性地結合的球蛋白，稱免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)，存在于血液、淋巴液和組織液中。第十一頁，共六十頁，2022年，8月28日2.2.2結構抗體的基本結構由四條肽鏈對稱排列組成，即兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈。可變區(qū)與穩(wěn)定區(qū)第十二頁，共六十頁，2022年，8月28日第十三頁，共六十頁，2022年，8月28日

抗原與抗體的結合具有高度特異性，抗體結合抗原的不同特異性，取決于輕鏈和重鏈的可變區(qū)氨基酸的種類和順序的不同。2.2.3特異性第十四頁，共六十頁，2022年，8月28日2.2.4抗體的分類目前，根據(jù)制備的原理和方法可分為多克隆抗體、單克隆抗體及基因工程抗體三類。

第十五頁，共六十頁，2022年，8月28日

多克隆抗體（第一代抗體）

將一種天然抗原經(jīng)各種途徑免疫動物，由于抗原性物質具有多種決定簇，故可刺激產(chǎn)生多種抗體形成細胞克隆，合成和分泌抗各種決定簇的抗體分泌到血清中，故在其血清中實際上是含多種抗體的混合物，稱這種用體內(nèi)免疫法所獲得的免疫血清為多克隆抗體（多數(shù)抗血清系由家兔制得）。第十六頁，共六十頁，2022年，8月28日

單克隆抗體（第二代抗體）

由識別一種抗原決定簇的細胞克隆所產(chǎn)生的均一性抗體，稱為單克隆抗體，具有特異性強、純度高的特點。應用雜交瘤技術可獲得幾乎所有抗原的單克隆抗體（多數(shù)單克隆抗體由小鼠制備）。第十七頁，共六十頁，2022年，8月28日

基因工程抗體（第三代抗體）

將對基因結構與功能的了解與DNA重組技術相結合，根據(jù)研究者的意圖在基因水平對分子進行切割、拼接或修飾，甚至是人工全合成后導入受體細胞表達，產(chǎn)生新型抗體。第十八頁，共六十頁，2022年，8月28日第三節(jié)

免疫組化染色方法及原理

第十九頁，共六十頁，2022年，8月28日3.1.1標記抗體法（熒光素標抗體法或酶標抗體法。1941年Coons建立了熒光素標記肺炎雙球菌粘多糖抗體。60年代Nakane建立了酶標記抗體技術第二十頁，共六十頁，2022年，8月28日3.1.1.1直接標記法

直接用熒光素或辣根過氧化物酶標記特異性抗體，與組織切片中相關抗原結合，用熒光/普通顯微鏡識別熒光所在的部位或酶顯色的部位，以確定抗原所在的部位。該方法簡單，但購買標記特異性抗體較困難，目前已經(jīng)較少使用。

第二十一頁，共六十頁，2022年，8月28日第二十二頁，共六十頁，2022年，8月28日直接標記法第二十三頁，共六十頁，2022年，8月28日3.1.1.2間接標記法

將未標記的特異抗體（第一抗體）與組織中抗原相結合，為了觀察其結合部位，用熒光素或HRP標記第二抗體即標記在抗第一抗體的免疫球蛋白上再與第一抗體結合，如第一抗體為兔血清，第二抗體必須為其他動物抗兔的免疫球蛋白抗體。第二十四頁，共六十頁，2022年，8月28日

間接標記法第二十五頁，共六十頁，2022年，8月28日優(yōu)點：只要不同的第一抗體均來自同一種屬，同標記的第二抗體結合就能用來顯示其不同特異性抗原的存在，這樣可避免了直接法中標記每一種第一抗體的麻煩，并且提高了方法的敏感度。缺點：酶與抗體間的共價連結可損害部分抗體和酶的活性、抗血清中的非特異性抗體被酶標記后，與組織成分結合，可致背景染色等。第二十六頁，共六十頁，2022年，8月28日第二十七頁，共六十頁，2022年，8月28日第二十八頁，共六十頁，2022年，8月28日3.1.2非標記抗體酶法70年代Sternberger改良并建立了辣根過氧化物酶---抗過氧化物酶復合物法（PAP）技術。

第二十九頁，共六十頁，2022年，8月28日

辣根過氧化物酶（HRP）是從辣根中提取的，分子量為40000，等電點3～9，最適PH為5，它的底物是3，3ˊ-二氨基聯(lián)苯胺（DAB），HRP使DAB氧化形成棕黃色產(chǎn)物，可在光鏡和電鏡下觀察。

HRPDAB+H2O2棕黃色產(chǎn)物第三十頁，共六十頁，2022年，8月28日PAP法基本原理:

第三十一頁，共六十頁，2022年，8月28日3.1.3親和免疫細胞化學技術卵白素（Avidin）:又稱抗生物素、親和素，具有4個與生物素親和力極強的結合點。鏈霉親和素（streptavidin）是一種從鏈霉菌培養(yǎng)物中提取的蛋白質，和親和素一樣，也有4個生物素結合位點。生物素（Biotin）:維生素H，是一種小分子的維生素。第三十二頁，共六十頁，2022年，8月28日抗生物素具有4個與生物素親和力極強的結合點，這種親和力較抗原抗體的親和力高100萬倍，而且不影響彼此的生物學活性，同時生物素與抗生物素都具有與其他示蹤物質如熒光素、鐵蛋白和HRP相結合能力，由此建立了抗生物素－生物素免疫染色系統(tǒng)，包括抗生物素－生物素－過氧化酶復合物技術（ABC）及鏈霉親合素—生物素－過氧化酶（或堿性磷酸酶）合復技術（SABC）。第三十三頁，共六十頁，2022年，8月28日3.1.3.1ABC法：親合素-生物素-過氧化物酶復合物法

第三十四頁，共六十頁，2022年，8月28日3.1.3.2BRAB法：橋連抗生物素－生物素法：第三十五頁，共六十頁，2022年，8月28日3.1.3.3LSAB法：

標記鏈霉抗生物素－生物素法，又稱鏈霉親合素酶結合法（strepavidinperoxidaseconjgatedmethod,S-P法）,即采用生物素標記的第二抗體與鏈霉抗生物素蛋白連接的過氧化物酶來測定細胞和組織中的抗原。第三十六頁，共六十頁，2022年，8月28日第三十七頁，共六十頁，2022年，8月28日第四節(jié)

免疫組織化學的基本技術（1）

第三十八頁，共六十頁，2022年，8月28日4.1組織材料的處理

固定液的選擇及固定的時間長短對實驗結果有很大的影響。一般采用10%中性福爾馬林液（石蠟切片）和丙酮（冰凍切片）固定。組織材料的處理是獲得良好免疫組化結果的前提，必須保證要檢測的細胞或組織取材新鮮，固定及時，形態(tài)保存完好，抗原物質的抗原性不丟失，不擴散和不被破壞。第三十九頁，共六十頁，2022年，8月28日4.2切片前的準備工作

4.2.1載玻片、蓋玻片處理

清潔液浸泡24小時后依次自來水、雙蒸餾水洗，95%酒精浸泡2小時，擦拭干凈。防脫片處理：將干燥、干凈的玻片放入多聚賴氨酸溶液中浸泡5分鐘，60℃烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥備用。第四十頁，共六十頁，2022年，8月28日4.2.2常用試劑配制

0.05%-0.1%胰蛋白酶取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml0.05%或0.1%PH7.8的無水氯化鈣水溶液中，溶解即可。4%胃蛋白酶取4g胃蛋白酶加入到100ml0.1mol/LHCL即可。第四十一頁，共六十頁，2022年，8月28日0.01mol/LPH6.0檸檬酸緩沖液取檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7.2H2O)10g、檸檬酸（C6H8O7.2H2O）1.5g，加雙蒸餾水至1000ml即可。10%中性福爾馬林固定液

40%甲醛與0.01mol/LPH7.4PBS按1：9配制。DAB（3，3-二氮聯(lián)苯胺）染色液取DAB2.5mg充分溶解于5mlPBS后過濾，使用前加入3%H2O215μl即可。第四十二頁，共六十頁，2022年，8月28日0.01mol/LPH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)

原液:

A液:0.2mol/LNa2HPO4.12H2O取72g加雙蒸餾水至1000ml即可。

B液:0.2mol/LNaH2PO4.2H2O取15.6g加雙蒸餾水至500ml即可。工作液：取A液415ml、B液85ml、NaCL85g加雙蒸餾水至10000ml,用0.1N的NaOH調(diào)PH值至7.4即可。第四十三頁，共六十頁，2022年，8月28日4.2.3石蠟切片免疫組化染色步驟(S-P法)

石蠟切片脫蠟至水。3%H2O2室溫孵育5～10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，（如需采用抗原修復，可在此步后進行）。5～10%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~～2小時或4℃過夜。

第四十四頁，共六十頁，2022年，8月28日PBS沖洗，5分鐘×3次。滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗或二抗工作液，37℃孵育10~30分鐘；

PBS沖洗，5分鐘×3次。滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素或工作液，37℃孵育10~30分鐘；PBS沖洗，5分鐘×3次。顯色劑顯色（DAB）。自來水充分沖洗，復染，封片。第四十五頁，共六十頁，2022年，8月28日4.2.4冰凍切片免疫組化染色步驟

冰凍切片4～8μm，室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘×3次。用3%過氧化氫孵育5～10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗，5分鐘×2次。下接免疫組化染色操作步驟。第四十六頁，共六十頁，2022年，8月28日4.2.5抗原修復

4.2.5.1蛋白酶消化

胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%～0.1%，消化時間為37℃、10～40分鐘，主要用于細胞內(nèi)抗原的顯示。胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時間為37℃、30～180分鐘，主要用于細胞間質抗原的顯示。第四十七頁，共六十頁，2022年，8月28日4.2.5.2抗原熱修復可根據(jù)實驗室的具有條件，選用微波爐抗原修復、高壓鍋抗原修復或水浴高溫抗原。第四十八頁，共六十頁，2022年，8月28日

石蠟切片微波爐抗原修復：切片脫蠟至水后，3%H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有檸檬酸緩沖液的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92℃～98℃之間并持續(xù)10～15分鐘。取出容器，室溫冷卻10～20分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復原有的空間構型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。第四十九頁，共六十頁，2022年，8月28日第五節(jié)

免疫組織化學的基本技術（2）

第五十頁，共六十頁，2022年，8月28日5.1免疫組化結果的判斷

免疫組化的呈色深淺可反映抗原存在的數(shù)量，可作為定性、定位和定量的依據(jù)。

第五十一頁，共六十頁，2022年，8月28日5.1.1陽性反應的染色特征

陽性反應染色分布有四種類型：細胞間質、胞漿、細胞核、細胞膜表面。

陽性細胞分布呈灶性和彌漫性。由于細胞內(nèi)含抗原量不同，所以染色強度不一。如果細胞之間染色強度相同，常提示其反應為非特異性。陽性細胞染色定位于單個細胞，且與陰性細胞相互交雜分布；而非特異性染色常不限于單個細胞，而是累及一片細胞。切片邊緣、刀痕或皺褶區(qū)域，壞死或擠壓的細胞區(qū)，常表現(xiàn)為相同的陽性染色強度，不能用于判斷陽性。第五十二頁，共六十頁，2022年，8月28日5.1.2假陽性及其處理

所用的抗體與其它無關的抗原有交叉反應，特異性差，特別是使用多克隆抗血清時較易出現(xiàn)；組織細胞內(nèi)含有DAB沉淀相類似的色素。假過氧化物酶活性：組織中存在紅細胞時，即不加過氧化物酶，也可出現(xiàn)陽性結果。第五十三頁，共六十頁，2022年，8月28日內(nèi)源性過氧化物酶活性：過氧化物酶體等存在過氧化物酶，能夠與H2O2

～DAB反應，導致假陽性。游離醛基：用小分子賴氨酸、白蛋白等預先孵育切片，可封閉之。疏水鍵和離子鍵：用