免疫組織化學技術(shù)

免疫組織化學技術(shù)第一頁，共三十頁，2022年，8月28日概念：應用免疫學及組織化學原理，對組織切片或細胞標本中的某些多肽和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進行原位定性、定位或定量研究的技術(shù)稱為免疫組織化學技術(shù)或免疫細胞化學技術(shù)?；具^程：被檢抗原/半抗原提取→免疫動物→特異性抗體→標記抗體→抗原抗體反應部位出現(xiàn)有色沉淀能與對應抗體結(jié)合出現(xiàn)抗原-抗體反應、又不能單獨激發(fā)人或動物體產(chǎn)生抗體的抗原。它只有反應原性，不具免疫原性，又稱不完全抗原。大多數(shù)多糖和所有的類脂都屬于半抗原。第二頁，共三十頁，2022年，8月28日免疫酶組織化學免疫熒光組織化學免疫膠體金組織化學親和免疫組織化學（抗原信號放大系統(tǒng)）優(yōu)點：特異性強，敏感度高，應用廣泛。第三頁，共三十頁，2022年，8月28日第一節(jié)免疫組織化學基本原理一、直接法用酶或其它標記物標記的特異性抗體直接與標本中的相應抗原結(jié)合，再與酶的底物作用產(chǎn)生有色產(chǎn)物沉積，在抗原抗體反應的部位即可檢測。

第四頁，共三十頁，2022年，8月28日優(yōu)點：簡單快速，特異性強，非特異性反應低；缺點：敏感性差；抗原量要求高；很難獲得各種市售標記抗體。（腫瘤蛋白標記物：低豐度蛋白）在免疫熒光和免疫酶技術(shù)中因材料處理不當或用量不當產(chǎn)生的背景著色反應。第五頁，共三十頁，2022年，8月28日

第一抗體（兔）不標記，使用與一抗種屬相同抗體的Fc段（有種屬特異性）作為抗原免疫動物（羊），制備抗抗體，即第二抗體（羊抗兔），并標記第二抗體。二、間接法染色時，順次以第一抗體和標記的第二抗體處理標本，在抗原存在部位形成抗原-第一抗體-標記第二抗體復合物，以達到檢測該抗原的目的。第六頁，共三十頁，2022年，8月28日優(yōu)點：間接法因第二抗體的放大作用敏感性大大增高（放大原理=抗原：抗體1：6）；缺點：可能出現(xiàn)非特異性反應；子宮內(nèi)膜巨噬細胞移動抑制因子MIF第七頁，共三十頁，2022年，8月28日三、親和免疫組織化學(一)親和素-生物素-過氧化物酶復合物法(avidin-biotin-peroxidasecomplexmethod，ABC法)特點:以親和素作為“橋”將生物素結(jié)合的酶和生物素化的抗體連接起來，使抗原與抗體反應信號放大，以增加敏感性。

1.原理:生物素

(biotin)為含硫的雜環(huán)單羧酸，生物素分子量為244.31，pI為3.5，咪唑酮環(huán)（又稱Ureido環(huán)）(I環(huán))是與親合素結(jié)合的主要部位；Ⅱ環(huán)為噻吩環(huán)有一個戊酸側(cè)鏈，末端羧基是標記抗體和酶的唯一結(jié)構(gòu)。III第八頁，共三十頁，2022年，8月28日親和素

(avidin)又稱抗生物素蛋白，是一種糖蛋白。天然(卵白)親合素為堿性蛋白，分子量為6.8KD，pI10～10.5；在pH9～13緩沖液中性質(zhì)均穩(wěn)定。由4個相同的亞單位構(gòu)成4聚體；每個親合素亞單位通過其結(jié)構(gòu)中的色氨酸殘基與生物素中的Ureido環(huán)（I環(huán)）結(jié)合。因此，1個親合素分子存在4個與生物素分子結(jié)合位點第九頁，共三十頁，2022年，8月28日ABC法第十頁，共三十頁，2022年，8月28日親和素-生物素-過氧化物酶復合物法ABC法原理第十一頁，共三十頁，2022年，8月28日2.免疫組織化學酶類標記物

免疫組化標記物的酶以共價鍵結(jié)合在抗體上，ABC法則采用生物素-親和素系統(tǒng)，制成酶標抗體，再借助酶對底物的特異催化作用，生成有色不溶沉淀，在光鏡下進行各種抗原成分觀察。常用酶類：辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidase，HRP),

堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，AP)第十二頁，共三十頁，2022年，8月28日用于標記的酶的特性酶催化反應形成的產(chǎn)物易于在光鏡下觀察酶反應終產(chǎn)物是穩(wěn)定的沉淀，不會從酶活性部位向四周彌散而影響組織學定位較易獲得純的酶分子中性PH值時，酶分子穩(wěn)定酶連接在抗體上，二者活性均不受影響第十三頁，共三十頁，2022年，8月28日HRP底物:過氧化物：過氧化氫供氫體：二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)3-氨基-9乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbozole,AEC)DAB+H2O2棕色；

AEC+H2O2紫紅色AP磷酸酯水解酶，溴氯羥吲哚磷酸鹽(底物）/硝基藍四唑(BCIP/NBT)

溴氯羥吲哚磷酸鹽(底物）/硝基四紫唑

(BCIP/INT)

NBT/BCIP藍紫色

INT/BCIP棕紅色或橘黃色

HRPHRPAPAP第十四頁，共三十頁，2022年，8月28日ABC法的優(yōu)點：敏感性更高ABC法的缺點：①親和素(雞蛋白)中含有10%糖類，導致背景著色②親和素的等電點約10左右，帶較多的負電荷，導致纖維組織著色。③內(nèi)源性生物素導致背景著色④親和素中有4個結(jié)合點，其中一半與連接抗體結(jié)合，另一半與復合物結(jié)合，可降低其敏感性。鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物法(streptavidin-biotin-peroxidasecomplexmethod，SABC法)第十五頁，共三十頁，2022年，8月28日

(二)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶法

（Streptavidin-peroxidasemethod，SP法）鏈霉親和素替代ABC法中的親和素-生物素復合物，形成鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶法，SP法第十六頁，共三十頁，2022年，8月28日Ag1Ab2AbDABABCmethodDABSPmethodA-B-ComplexSa-P-ComplexPABPSa放大系統(tǒng)→←第十七頁，共三十頁，2022年，8月28日鏈霉親和素SA（鏈霉菌抗生物素蛋白）約6.5KD，由4條相同肽鏈構(gòu)成，每條肽鏈可結(jié)合1個生物素分子。每個SA有4個生物素結(jié)合位點，結(jié)合常數(shù)與A相同為1015mol/L，約為抗原抗體間ka（105～1011mol/L)的1萬倍以上。SA最高的活性可達18u，較A高（15u）；SA的四個亞基可以全部和二抗上的生物素結(jié)合。鏈霉親和素組織穿透性強，反應速度快。等電點為5.5~6.7，接近中性，所帶的負電荷少；鏈霉親和素不含糖基。敏感性更高，特異性更強。SP法的優(yōu)點第十八頁，共三十頁，2022年，8月28日第二節(jié)、免疫組織化學染色步驟一、免疫組化染色步驟（一）石蠟切片1.烤片：58℃2-６h；目的：帶蠟的組織切片牢固黏在載玻片上注意：高溫加速組織中抗原氧化第十九頁，共三十頁，2022年，8月28日2.脫臘和水化：二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡15min脫蠟→100﹪酒精Ⅰ、Ⅱ中分別浸泡5min→95﹪、90﹪、80﹪、70﹪酒精各浸泡2min→PBS洗3次×3min,置蒸餾水中待用；第二十頁，共三十頁，2022年，8月28日3.抗原修復：甲醛形成醛鍵、羧甲基等封閉部分抗原決定簇；蛋白分子交聯(lián)隱蔽了抗原決定簇。

加熱修復：①高壓修復：pH6.0的0.1mol／L檸檬酸緩沖液高壓鍋內(nèi)煮沸，切片置于其中,高壓修復1.5min，室溫冷卻，蒸餾水和PBS各沖洗2次×3min；注意：時間過長背景加深；新鮮檸檬酸緩沖液；緩沖液足量第二十一頁，共三十頁，2022年，8月28日②微波修復：pH6.0的0.1mol／L檸檬酸緩沖液微波煮沸，切片置于其中，中高檔微波處理15-20min，室溫冷卻，蒸餾水和PBS各沖洗2次×3min；第二十二頁，共三十頁，2022年，8月28日③蒸汽修復:

內(nèi)，盛自來水的鋁制容器加熱至水沸騰,放入含pH6.0的0.1mol／L檸檬酸緩沖液和切片的容器.繼續(xù)沸騰10-15min,室溫冷卻.(強烈推薦)第二十三頁，共三十頁，2022年，8月28日胰蛋白酶消化：細胞內(nèi)抗原

0.1%胰酶溶液（0.1%氯化鈣pH7.8），37℃，15-30min，,PBS沖洗3次×3min；胃蛋白酶消化：細胞間質(zhì)抗原0.4%，37℃，30-180min

注意:酶溶液新鮮配制;或分裝凍存;要預熱建議：仔細閱讀抗體說明書，是否需要進行抗原修復，選擇合適的抗原修復方法和時間。單一方法無效,可聯(lián)合應用,適合于免疫組化雙重標記或多重標記.

第二十四頁，共三十頁，2022年，8月28日4.細胞膜打孔0.1﹪-0.3％tritonX-100浸泡，RT，25min，PBS沖洗3次×5min

原理:tritonX-100為脂溶性去垢劑注意：檢測膜抗原可省略此步驟；石蠟切片和冰凍切片可以省略此步驟。

使抗體滲透進入細胞的方法（1）TritonX-100：使細胞膜脂類溶解（2）Np-40：使細胞膜蛋白質(zhì)破環(huán)（3）Saponin皂苷：使細胞膜膽固醇溶解第二十五頁，共三十頁，2022年，8月28日5.滅活內(nèi)源性酶及封閉內(nèi)源性生物素（1）滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3﹪甲醇-H2O2浸泡，RT，30min，PBS沖洗3次×5min；（2）滅活堿性磷酸酶：以每毫升24mg左旋咪唑加入底物液中，保持PH7.6－8.2。酸性磷酸酶用0.05M酒石酸抑制。（3）滅活內(nèi)源性生物素：

有些組織(腺上皮、腦和胚胎組織)內(nèi)源性生物素含量比較高，特別在使用高溫加熱修復方法暴露抗原決定簇后，組織內(nèi)源性生物素大量暴露，容易造成假陽性。內(nèi)源性生物素阻斷試劑盒：阻斷劑A液（0.01%親和素）1滴，RT，10min，PBS沖洗3次×2min；加B液（d-生物素）1滴，RT，10分鐘，PBS沖洗3次×2min。第二十六頁，共三十頁，2022年，8月28日6.非免疫血清封閉：原因：富含正電荷的膠原和結(jié)締組織吸附抗體目的：吸附帶正電荷的蛋白操作：與二抗種屬相同的非免疫血清或2-5﹪BSA（牛血清白蛋白），RT，10min，不洗；

注意：結(jié)合不牢固，不能沖洗

建議：可試用不同動物的非免疫血清（不要與一抗種屬相同）第二十七頁，共三十頁，2022年，8月28日7.加入一抗4℃過夜，或37℃孵育1-2h，PBS沖洗3次×5min多克隆抗體兔多抗價格低，效價高非特異性反應高，效價不穩(wěn)定單克隆抗體小鼠單抗大鼠單抗兔單抗特異性強，無交叉反應，效價穩(wěn)定價格高，效價低濃縮型抗體摸索效價市售抗體稀釋液，或含1-3%非免疫血清PBS即用型抗體無需摸索效價第二十八頁，共三十頁，2022年，8月28日8.加入生物素標記IgG(二抗），RT,10分鐘，PBS沖洗3次×5min；注意：與一抗匹配9.加入鏈霉親和素-生物素-辣根過氧化物酶/堿性磷酸酶（SABC-POD，或SABC-AP