免疫原和抗體的制備

免疫原和抗體的制備第一頁，共五十四頁，2022年，8月28日概要第一代抗體：多克隆抗體第二代抗體：單克隆抗體第三代抗體：基因工程抗體第二頁，共五十四頁，2022年，8月28日第一部分多克隆抗體制備英文全稱：polyclonalantibody,PcAb定義：它是由多種抗原決定簇刺激多株B細(xì)胞增殖分化所產(chǎn)生的抗體，是多種抗體的混合物。如何制備？是通過給動物接種抗原所獲得的免疫血清或抗血清。第三頁，共五十四頁，2022年，8月28日人體BBBBAgAgAgAg免疫血清制備機(jī)制人體第四頁，共五十四頁，2022年，8月28日免疫原(及佐劑)的制備免疫動物試血抗血清的保存抗血清的鑒定采血收集血清抗血清的純化第五頁，共五十四頁，2022年，8月28日一、免疫原的制備免疫原(immunogen)是能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體并能與抗體發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)一)顆粒性抗原的制備二)可溶性抗原制備及鑒定三)半抗原免疫原的制備第六頁，共五十四頁，2022年，8月28日細(xì)胞抗原：綿羊紅細(xì)胞細(xì)菌抗原：菌體抗原、鞭毛抗原寄生蟲體抗原：蟲卵一）顆粒性抗原的制備特點：制作方法較為簡單；懸液呈渾濁狀或乳濁狀；免疫時多用靜脈注射，不需佐劑第七頁，共五十四頁，2022年，8月28日

綿羊紅細(xì)胞的制備流程圖搖動15-20min

4℃可保存3周取適量NS洗滌3次2000r/min10minNS稀釋至2～5%第八頁，共五十四頁，2022年，8月28日

細(xì)菌菌體抗原的制備流程圖液體培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)37℃24h100℃水浴2～2.5h

殺菌無菌試驗NS稀釋成8～10億/mlO菌體抗原第九頁，共五十四頁，2022年，8月28日來源:

組織、細(xì)胞或血液，其成分較復(fù)雜。

二、可溶性抗原制備及鑒定可溶性抗原:蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、酶類、補(bǔ)體、脂多糖、細(xì)菌外毒素和核酸二）可溶性抗原制備及鑒定第十頁，共五十四頁，2022年，8月28日制備流程：細(xì)胞的破碎抗原的分離及純化器官組織：組織細(xì)胞：血液：抗原的鑒定組織碎塊預(yù)處理返回第十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日1、組織材料的預(yù)處理組織必須是新鮮或低溫保存的去除包膜或結(jié)締組織臟器進(jìn)行灌洗洗去血跡及污物NS內(nèi)含0.5g／LNaN3冷浴中組織剪碎組織碎塊第十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日1)高速搗碎法2)研磨法3)超聲破碎法4)反復(fù)凍融法5)酶處理法6)表面活性劑處理2、細(xì)胞破碎技術(shù)及評價物理法化學(xué)法第十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日上清液澄清組織碎塊裝入搗碎機(jī)簡內(nèi)高速粉碎制成組織勻漿液2000r／min取上清液去除細(xì)胞碎片及微小組織離心特點：①操作簡單，無需貴重儀器；②多用于內(nèi)臟組織的破碎。1)高速搗碎法1000r／min15000r／min第十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日原理：利用超聲波的機(jī)械振動產(chǎn)生的壓力足以使細(xì)胞破碎。方法：使用的頻率從1kHz～20kHz不等的超聲波處理細(xì)胞，間歇進(jìn)行，避免長期超聲產(chǎn)熱，導(dǎo)致抗原破壞。2)超聲破碎法特點：①操作簡單，重復(fù)性較好，節(jié)省時間；②多用于組織細(xì)胞和細(xì)菌的破碎。第十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日

2.凍融法原理：因速凍緩融，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成及胞內(nèi)外溶劑濃度突然改變而破壞細(xì)胞。3)反復(fù)凍融法方法：將待破碎的細(xì)胞置-20℃冰箱內(nèi)凍結(jié)，然后室溫融化，如此反復(fù)3-4次，大部分組織細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆?？杀蝗谄?。特點：此法適用于組織細(xì)胞，對微生物細(xì)胞作用較差。第十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日

常用酶類：溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶等

1.酶處理法4)酶處理法方法：在一定的條件下，能消化細(xì)菌和組織細(xì)胞。

特點：①此法適用多種微生物；②具有作用條件溫和；③內(nèi)含物成分不易受到破壞；④細(xì)胞壁損壞的程度可以控制。第十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日原理：在適當(dāng)?shù)臏囟取H及低離子強(qiáng)度的條件下，表面活性劑能與脂蛋白形成微泡，使膜的滲透性改變或使之溶解。5)表面活性劑處理常用的有：十二烷基硫酸鈉(SDS,陰離子型)、二乙胺十六烷基溴（陽離子型）、聚山梨酯（非離子型）、新潔爾滅等。應(yīng)用：①破碎細(xì)菌，且作用比較溫和；②提取核酸時，常用此法破碎細(xì)胞。返回第十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日3、蛋白質(zhì)抗原的提取與純化蛋白質(zhì)親和層析離子交換層析凝膠過濾鹽析沉淀超速離心分離法蛋白質(zhì)、多糖、脂類、核酸第十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日

1)．超速離心法

原理:利用各顆粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的顆粒,處于不同密度的梯度層內(nèi)，達(dá)到彼此分離的目的。

1)超速離心法特點：用差速離心或梯度密度離心法純化抗原，極難將某一抗原成分分離出來。

應(yīng)用：用于少部分大分子抗原IgM、C1q、甲狀腺球蛋白、載脂蛋白A、B等。不適于中、小分子量蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)速大于20000r/min第二十頁，共五十四頁，2022年，8月28日2)鹽析法方法：用50、33%的硫酸銨分次提取，即可獲得丙種球蛋白(含IgG95%以上)。特點：簡單方便，純度不高，粗提球蛋白。應(yīng)用：在大量制備中先用此法粗提，再純化。原理：白蛋白可溶于半飽和的硫酸銨溶液中，而球蛋白則沉淀析出；該達(dá)到飽和時，白蛋白也析出，因此不同飽和度的硫酸銨或硫酸鈉，可將白蛋白和球蛋白分離。第二十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日

3．凝膠層析法（凝膠過濾法）原理：利用凝膠的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大分子在凝膠顆粒間很快通過，小分子進(jìn)入網(wǎng)孔，難于洗脫，將抗原分為大、中、小三種。屬區(qū)帶分離法。3)凝膠層析法（凝膠過濾法）特點：是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。

第二十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日

原理：利用帶離子基團(tuán)的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)抗原。各種蛋白質(zhì)的等電點不同，所帶電荷不同，與纖維素結(jié)合的能力有差別。當(dāng)梯度洗脫時，逐步增加流動相的離子強(qiáng)度，使加入的離子與蛋白質(zhì)競爭纖維素上的電荷位置，從而使血清中的蛋白質(zhì)分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等幾個部分而被洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的。4)離子交換層析法第二十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日5)親和層析法（蛋白A純化IgG）蛋白A瓊脂糖上樣靜置30分鐘注：上樣速度慢第二十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日優(yōu)點：純度高、獲得物不失活性，簡便快捷。返回結(jié)合緩沖液沖洗洗脫緩沖液沖洗第二十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日純化抗原的鑒定1).含量鑒定

2).理化性質(zhì)鑒定①凝膠層析技術(shù)測定

②聚丙烯酰胺凝膠電泳

③凝膠管狀電泳

④超速離心3).純度鑒定

常用醋酸纖維膜電泳

4).免疫活性鑒定

常用雙向瓊脂擴(kuò)散試驗4、純化抗原的鑒定返回第二十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日

四、佐劑英文全稱：immunoadjuvant概念：

與抗原同時或預(yù)先注射于機(jī)體，能增加機(jī)體免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。

二、免疫佐劑第二十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日化合物:氫氧化鋁、明礬、礦物油、吐溫-80、弗氏不完全佐劑以及人工合成的多聚肌苷酸∶胞苷酸(polyI∶C)、脂質(zhì)體生物制劑:處理改造的細(xì)菌及代謝產(chǎn)物，如卡介苗、短小棒狀桿菌、百日咳桿菌及CTB、LPS和類脂A、胞壁酰二肽等；細(xì)胞因子及熱休克蛋白一)佐劑的種類第二十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日用于人體的佐劑：氫氧化鋁、明礬、polyI∶C、胞壁酰二肽、細(xì)胞因子、熱休克蛋白常用于動物實驗的佐劑：弗氏佐劑(Freund’sadjuvant)

一)佐劑的種類第二十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.氫氧化鋁佐劑：5%硫酸鋁5%氫氧化鈉氫氧化鋁沉淀制成懸液即為佐劑強(qiáng)烈攪拌NS洗二次NS等體積抗原免疫接種（二）常見佐劑第三十頁，共五十四頁，2022年，8月28日2.明礬佐劑10%硫酸鉀鋁氫氧化鈉校正pH值至6.5沉淀乳狀懸液*明礬佐劑抗原常用用于肌肉注射，皮下注射易引起肉芽種和膿腫。NS攪拌NS洗二次離心抗原備用防腐劑第三十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日混合1~5:1作用大于不完全佐劑;局部形成肉芽種和潰瘍;不能用于人體弗氏完全佐劑3.弗氏佐劑(Freundadjuvant)液體石蠟＋弗氏不完全佐劑卡介苗終濃度2～20mg/ml羊毛脂抗原抗原1:11:1完全乳化鑒定一滴乳劑乳劑不散浮于液面水中第三十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日乳化方式：研磨法：

易乳化，但抗原或佐劑用量大。攪拌混合法：

無菌操作，節(jié)省抗原或佐劑，但不易乳化完全。第三十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日4.脂質(zhì)體其與抗原合用，可更有效地激發(fā)機(jī)體的免疫功能，增強(qiáng)免疫反應(yīng)。IL－2、IL－1、IFN等都是良好的佐劑。包封抗原后，可使抗原延緩釋放，并且脂質(zhì)體有刺激機(jī)體免疫反應(yīng)的作用。5.細(xì)胞因子第三十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.改變抗原的物理性狀，使抗原在體內(nèi)滯留或延緩釋放，延長抗原與免疫細(xì)胞作用的時間，從而增強(qiáng)抗原免疫原性。2.抗原在佐劑的輔助作用下，更易被巨噬細(xì)胞有效吞噬和有效的加工處理和呈遞。3.刺激單核－巨噬細(xì)胞活化，釋放細(xì)胞因子調(diào)節(jié)和增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的應(yīng)答能力。4.刺激淋巴細(xì)胞增生分化，從而增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答能力。（三）作用機(jī)制第三十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日應(yīng)用佐劑的缺點①佐劑?；煊形⒘科渌镔|(zhì)，這些物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)后也可引起抗體的產(chǎn)主，影響抗血清的特異性；（四）應(yīng)用佐劑的缺點②注射佐劑可引起局部形成肉芽腫和無菌性膿腫；③反復(fù)注射，易發(fā)生超敏反應(yīng)，使局部組織壞死，甚至引起動物死亡。第三十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日

三、免疫動物一）、動物的選擇

1.抗原與免疫動物種屬差異越遠(yuǎn)越好；2.動物個體選擇:

適齡、健壯、無感染正常動物、體重合乎要求；3.抗原性質(zhì):酶類—豚鼠；甾體激素—家兔

4.血清用途:

R型:等價帶寬,適于診斷試劑.用家兔免疫產(chǎn)生.

H型:等價帶窄,適于免疫治療.用馬免疫產(chǎn)生.5.抗血清需要量選擇:第三十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日

三、免疫動物二）、免疫方法

1.免疫劑量：1)不能過大或過小，否則產(chǎn)生免疫耐受；2)首次免疫劑量不宜過大3)大:0.5-1mg/只小只2.免疫途徑：3.免疫間隔時間：

第三十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日2.免疫途徑1）.皮內(nèi)或皮下注射：

a.采用多點注射(8-10點)；

b.半抗原宜皮內(nèi)多點注射；

c.皮內(nèi)注射易引起細(xì)胞反應(yīng)，對提高抗體效價有利，但皮內(nèi)注射較困難(因佐劑加入后粘度大)。2）.腹腔和靜脈注射:

多用于顆粒性抗原和加強(qiáng)免疫。3）.淋巴結(jié)內(nèi)注射:

適宜于微量抗原(先用完全佐劑在足掌作基礎(chǔ)免疫)。第三十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日3.免疫時間第二次第三次第一次第四次1）.間隔約10-20天（宜長、否則導(dǎo)致免疫耐受）；2）二次以后每次間隔7~10天（過長→刺激變?nèi)酢贵w效價不高。）第四十頁，共五十四頁，2022年，8月28日3)一般接種5-8次4)半抗原的免疫間隔要求較長(30~40天)。如8次免疫后仍不產(chǎn)生抗體，則應(yīng)更換動物。第四十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日四、試血效價測定

采血(末次免疫5-7天及時采血)

補(bǔ)充免疫效價不合格

效價合格

免疫3-5次第四十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日五、采血頸動脈采血法：家兔、綿羊、山羊

心臟采血法：

家兔、豚鼠、大鼠、雞

靜脈采血法：

家兔、山羊、綿羊

第四十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日六、免疫血清的純化免疫血清是成分復(fù)雜的混合物，除有特異性和非特異性抗體，還有各種蛋白成分。純化目的是除去這些不相關(guān)成分，防止抗血清中其他雜抗體及蛋白干擾試驗結(jié)果。第四十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日抗血清IgG類抗體（不純）硫酸銨鹽析多次（粗提）特異性IgG抗體凝膠過濾離子交換層析親和層析吸附法親和層析第四十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.效價的鑒定：即為抗體含量的測定

根據(jù)抗原性質(zhì)不同，可采取不同抗體效價測定方法。顆粒性抗原可采用凝集試驗?？扇苄钥乖Ｓ妹庖唠p擴(kuò)散法。2.抗體的純度鑒定：SDS－PAGE。

若只出現(xiàn)一條蛋白電泳區(qū)帶說明抗體純化已達(dá)到要求，而出現(xiàn)多條蛋白區(qū)帶則表明抗血清中混有雜蛋白，必須進(jìn)一步純化。七、抗體的鑒定第四十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日3.特異性鑒定：抗體對相應(yīng)或相似抗原識別能力

一般用特異性抗原及其相似的抗原與待鑒定抗體進(jìn)行免疫雙擴(kuò)散試驗。如果出現(xiàn)交叉反應(yīng)，說明有雜抗體存在?？蓱?yīng)用相應(yīng)抗原吸收雜抗體，即可得到單價特異性抗體。4.抗體親和力鑒定：親和力高則靈敏度好親和力測定主要有平衡透析法、酶聯(lián)免疫法和放射分析法。親和力的高低是由抗原分子和抗體分子的結(jié)合位點、抗原決定簇之間立體構(gòu)型的合適度決定的。七、抗體的鑒定第四十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日八、免疫血清的保存1.4℃保存：可保存3～6個月2.低溫保存：-20～-40℃，可保存2～3年抗體的保存濃度為20～30mg/ml為宜，加入1/10000的硫柳汞或1/1000的疊氮鈉防腐，并加入等體積的中性甘油，分裝小瓶，置-20℃以下低溫保存。3.冰凍干燥保存：可保存5～10年第四十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日舉例：抗人白蛋白的制備1、抗原的準(zhǔn)備：分別抽取數(shù)人全血，分離血清并混勻；分離制備白蛋白(請問可用哪些方法？)2、佐劑的準(zhǔn)備：

福氏不完全佐劑：稱取羊毛脂5g，逐滴加入石蠟油20ml高壓滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

福氏完全佐劑：于不完全佐劑中加入2~20mg/ml卡介苗，研缽中缽磨乳化后即成為完全佐劑，冰箱保存?zhèn)溆?。第四十九頁，共五十四頁?022年，8月28日3、抗原-福氏完全佐劑的制備：

取混合人全血清，用生理鹽水作1：4稀釋。將稀釋血清與完全佐劑1：1體積的比例混