分子生物學的生物合成轉錄

分子生物學的生物合成轉錄1第一頁，共六十頁，2022年，8月28日轉錄(transcription)生物體以DNA為模板合成RNA的過程。轉錄RNADNA此過程把DNA的堿基序列轉抄成RNA。5′3′3′5′編碼鏈3′5′模板鏈2第二頁，共六十頁，2022年，8月28日復制和轉錄的區(qū)別3第三頁，共六十頁，2022年，8月28日參與轉錄的物質原料:NTP模板:DNA酶:RNA聚合酶RNApolymerase,RNA-pol其他蛋白質因子bAOCH2POPP~~ATPOCH2POPP~~UUTPGOCH2POPP~~GTPCOCH2POPP~~CTP4第四頁，共六十頁，2022年，8月28日第一節(jié)模板和酶TemplatesandEnzymes5第五頁，共六十頁，2022年，8月28日一、轉錄模板DNA分子上能轉錄出RNA的區(qū)段，稱為結構基因(structuralgene)。DNA雙鏈中按堿基配對規(guī)律能指引轉錄生成RNA的一股單鏈，稱為模板鏈(templatestrand)，也稱作信息鏈、轉錄鏈、有意義鏈或Watson鏈。相對的另一股單鏈是編碼鏈(codingstrand)，也稱為非轉錄鏈、反義鏈或Crick鏈。6第六頁，共六十頁，2022年，8月28日不對稱轉錄

(asymmetrictranscription)轉錄對DNA鏈的選擇性稱為不對稱轉錄。有兩方面的含義：在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈用作模板指引轉錄，另一股鏈不轉錄；模板鏈并非永遠在同一條單鏈上。7第七頁，共六十頁，2022年，8月28日二、RNA聚合酶（一）原核生物的RNA聚合酶目前研究比較透徹的是E.coli的RNA聚合酶。其它原核生物的RNA聚合酶在結構、組成、功能上都與E.coli的RNA聚合酶相似。所有原核生物RNA聚合酶都受利福平或利福霉素抑制。8第八頁，共六十頁，2022年，8月28日真核生物的RNA聚合酶轉錄產物對鵝膏蕈堿反應耐受極敏感中度敏感ⅢⅡⅠ45SrRNAHnRNA5S-rRNAtRNAsnRNARNA聚合酶9第九頁，共六十頁，2022年，8月28日（二）真核生物的RNA聚合酶已發(fā)現(xiàn)三種RNA聚合酶分別稱為RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，專一性地轉錄不同的基因，生成不同的產物i。鵝膏蕈堿是真核生物RNA聚合酶的特異性抑制劑，但敏感性不同。10第十頁，共六十頁，2022年，8月28日三、模板上酶的辨認、結合原核生物一個轉錄區(qū)段可視為一個轉錄單位，稱為操縱子(operon)，包括若干個結構基因及其上游(upstream)的調控序列。結構基因調控序列操縱子：轉錄單位或轉錄區(qū)段啟動子RNA-PolRNA聚合酶結合模板DNA的部位，稱為啟動子(promoter)。11第十一頁，共六十頁，2022年，8月28日對啟動子的研究方法

RNA-Pol保護法1）分離某段基因并與純RNA-pol混合；2）加入核酸外切酶（胰DNA酶）水解DNA；3）分離被RNA聚合酶結合而未被水解的基因片段；4）測定并分析保護區(qū)（40-60bp）的堿基序列；12第十二頁，共六十頁，2022年，8月28日RNA-pol的移動TTGACAAACTGTTATAATATATTARNA-pol-40-35-30-25-20-15-10-50+5+10+15+20+25啟動子保守序列開始轉錄轉錄起始點13第十三頁，共六十頁，2022年，8月28日真核生物啟動子保守序列順式作用元件-GCGC---CAAT---TATA結構基因轉錄起始TATA盒CAAT盒GC盒增強子14第十四頁，共六十頁，2022年，8月28日第二節(jié)轉錄過程TheProcessofTranscription15第十五頁，共六十頁，2022年，8月28日一、原核生物的轉錄過程（一）轉錄起始就是RNA-Pol結合到DNA模板上的起始區(qū)域，DNA雙鏈局部解開，一條鏈作模板面加入第一個、第二個NTP，RNA-Pol催化形成第一個磷酸二酯鍵。轉錄起始復合物形成。RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH316第十六頁，共六十頁，2022年，8月28日（二）轉錄延長亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構，與模板結合松弛，沿著DNA模板前移；在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。(NMP)n

+

NTP(NMP)n+1

+PPi17第十七頁，共六十頁，2022年，8月28日1、轉錄空泡RNA-Pol（核心酶）-DNA-RNA形成的轉錄復合物RNA聚合酶可以覆蓋40bp以上長度的DNA轉錄解鏈范圍小于20bp雜化雙鏈長度約12bpNMP逐個加入遇到模板為A時加入的是U不是TRNA-Pol向下游移動時RNA分子的5′pppG······的結構仍然保留18第十八頁，共六十頁，2022年，8月28日35￠DNARNA聚合酶核糖體RNA2、原核生物轉錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象19第十九頁，共六十頁，2022年，8月28日（三）轉錄終止指RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來不再前進，轉錄產物RNA鏈從轉錄復合物上脫落下來。分類1、依賴Rho(ρ)因子的轉錄終止2、非依賴Rho因子的轉錄終止20第二十頁，共六十頁，2022年，8月28日2.非依賴Rho因子的轉錄終止DNA模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列，轉錄出RNA后，RNA產物形成特殊的結構來終止轉錄。莖環(huán)(stem-loop)/發(fā)夾(hairpin)結構。舉例：大腸桿菌核蛋白體蛋白基因大腸桿菌色氨酸操縱子21第二十一頁，共六十頁，2022年，8月28日二、真核生物的轉錄起始（一）轉錄起始真核生物的轉錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化。轉錄起始時，RNA-pol不直接結合模板，其起始過程比原核生物復雜。22第二十二頁，共六十頁，2022年，8月28日3.轉錄起始前復合物

(pre-initiationcomplex,PIC)真核生物RNA-pol不與DNA分子直接結合，而需依靠眾多的轉錄因子。23第二十三頁，共六十頁，2022年，8月28日4.模板理論(piecingtheory)拼板理論認為：一個真核生物基因的轉錄需要3至5個轉錄因子。轉錄因子之間互相結合，生成有活性，有專一性的復合物，再與RNA聚合酶搭配而有針對性地結合、轉錄相應的基因。24第二十四頁，共六十頁，2022年，8月28日（二）轉錄延長RNA-pol前移處處都遇上核小體，二者大小差別不大。轉錄延長過程中可以觀察到核小體移位（僅見于試管內轉錄）和解聚現(xiàn)象。真核生物轉錄延長過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉錄與翻譯同步的現(xiàn)象。25第二十五頁，共六十頁，2022年，8月28日（三）真核生物的轉錄終止真核生物轉錄終止和轉錄后修飾密切相關。1．真核生物DNA上有轉錄終止的信號，稱為轉錄終止的修飾點。已知真核生物DNA讀碼框架的3′端均含富含AT的序列（如AATAAA或ATTAAA等）；相隔0-30bp后又出現(xiàn)TTTT順序（通常是3-5個T）；該結構可能與轉錄終止及3′端加polyA有關。2．轉錄越過轉錄修飾點后的RNA在修飾點被切斷，隨即“加尾”、“戴帽”。余下RNA繼續(xù)轉錄，但產物很快被酶水解。26第二十六頁，共六十頁，2022年，8月28日真核生物的轉錄終止及加尾修飾3′processing5′mGpppG－－－AAUAAA－Poly（A）Nuclease3′－－AATAAA－－GTGTGTG5′－－PAUSE－－3′－－5′3′－－5′－－－－3′－－5′Release5′－－AAUAAA－－GUGUGUGRNA-polⅡ轉錄終止修飾點RNA-polⅡ27第二十七頁，共六十頁，2022年，8月28日第三節(jié)真核生物的轉錄后修飾Post-transcriptionalModification28第二十八頁，共六十頁，2022年，8月28日幾種主要的修飾方式1.剪接(splicing)2.剪切(cleavage)3.

修飾(modification)4.

添加(addition)29第二十九頁，共六十頁，2022年，8月28日一、真核生物mRNA的轉錄后加工（一）首、尾的修飾5端形成帽子結構(m7GpppGp—)3端加上多聚腺苷酸尾巴(polyAtail)30第三十頁，共六十頁，2022年，8月28日PolyA的形成mRNA5′m7GpppGAAUAAA3′H2O核苷酸片段核酸內切酶nATPnPPiPoly(A)聚合酶mRNA5′m7GpppGAAUAAAOH3′mRNA5′m7GpppGAAUAAAAAA(A)nOH3′31第三十一頁，共六十頁，2022年，8月28日（二）mRNA的剪接1.hnRNA和snRNA核內的初級mRNA稱為雜化核RNA(hetero-nuclearRNA,hnRNA)mRNA來自hnRNA（去掉中間片段）snRNA(smallnuclearRNA)核內的蛋白質小分子核糖核酸蛋白體（并接體,splicesome）snRNA32第三十二頁，共六十頁，2022年，8月28日mRNA來自hnRNA核酸序列分析證明：mRNA是去掉大部分中間片段的hnRNA。核酸雜交實驗證明：hnRNA與DNA模板鏈可以完全配對；而mRNA與DNA模板鏈雜交則出現(xiàn)部分配對的局部雙鏈區(qū)域和中間相當多的鼓泡狀突出的單鏈區(qū)段。因此提出真核生物基因的斷裂性的概念。33第三十三頁，共六十頁，2022年，8月28日核酸雜交實驗3′5′模板DNAhnRNA3′5′全長互補3′5′模板DNA成熟mRNA3′5′局部互補鼓泡狀突出34第三十四頁，共六十頁，2022年，8月28日核酸雜交實驗雞卵清蛋白成熟mRNA（虛線部分）與基因DNA（實線部分）分子雜交后電鏡所見。7個內含子（鼓泡狀突出部分）將8個外顯子分開。成熟mRNA模板DNA35第三十五頁，共六十頁，2022年，8月28日斷裂基因(splitegene)真核生物結構基因，由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質，這些基因稱為斷裂基因。編碼區(qū)A、B、C、DABCD非編碼區(qū)36第三十六頁，共六十頁，2022年，8月28日2.外顯子(exon)和內含子(intron)外顯子在斷裂基因及其初級轉錄產物上出現(xiàn)，并表達為成熟RNA的核酸序列。內含子隔斷基因的線性表達而在剪接過程中被除去的核酸序列。37第三十七頁，共六十頁，2022年，8月28日胰島素基因、轉錄產物、翻譯產物胰島素基因（編碼鏈）5′3′intronintronSBCCAPre成熟mRNASBCAPre轉錄后加工產物前胰島素原翻譯產物翻譯后加工修飾產物信號肽前導序列B亞基C肽A亞基SBCAPre胰島素SSSSBA38第三十八頁，共六十頁，2022年，8月28日斷裂基因及其轉錄、轉錄后修飾

注：涂黑處為前導順序（L）和外顯子（1、2、3、4、5、6、7）7.7kb卵清蛋白基因hnRNAGpppGAAA···AAA首尾修飾的hnRNAGpppGAAA···AAA剪接中的套索RNAL1276543GpppGAAA···AAA胞漿mRNA39第三十九頁，共六十頁，2022年，8月28日3.內含子的分類根據(jù)基因的類型和剪接的方式，通常把內含子分為4類。I：主要存在于線粒體、葉綠體及某些低等真核生物的rRNA基因；II：也發(fā)現(xiàn)于線粒體、葉綠體，轉錄產物是mRNA；III：是常見的形成套索結構后剪接，大多數(shù)mRNA基因有此類內含子；IV：是tRNA基因及其初級轉錄產物中的內含子，剪接過程需酶及ATP。40第四十頁，共六十頁，2022年，8月28日4.mRNA的剪接除去hnRNA中的內含子，將外顯子連接為成熟的RNA的過程稱為剪接。剪接的模式：內含子區(qū)段彎曲，使相鄰的兩個外顯子互相靠近而利于剪接，稱為套索RNA（lariatRNA）內含子結構特點：大多數(shù)內含子都以5′-GU…開始，而其末端則為…AG-OH-3′。5′-GU……AG-OH-3′稱為剪接接口（splicingjunction）或邊界序列。剪接后，GU或AG不一定被剪除。41第四十一頁，共六十頁，2022年，8月28日snRNA（smallnuclearRNA）核內小RNA由百余個至300個核苷酸組成，分子中以U含量最豐富，故以U作分類命名?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有snRNAU1、U2、U3、U4、U5、U6等類別。小分子核糖核蛋白體（smallnuclearribonucleoprotein，snRNP）：由snRNA和核內蛋白質組成，作為RNA剪接的場所。剪接體或并接體（splicesome）：由snRNP與hnRNA結合形成套索并拉近上、下游外顯子距離的復合體。剪接體本身有剪接酶活性。剪接體可以結合在hnRNA內含子區(qū)段并使內含子彎曲、兩斷接近，利于剪接。42第四十二頁，共六十頁，2022年，8月28日剪接過程（A.Klessig模式）（1）首先snRNP與hnRNA結合：snRNP上的U1-snRNA和U2-snRNA分別靠堿基互補關系去辨認、結合hnRNA上內含子的5′-GU和AG-OH-3′末端。U4、U5、U6加入形成完整的剪接體。2個外顯子之間的內含子因為與剪接體的結合而彎曲，使兩個末端互相靠近形成套索，上下游的外顯子互相靠近，有利于進行轉酯反應。內含子靠近3′端有一個甲基化的嘌呤核苷酸：如3mG，是形成套索的關鍵所在。43第四十三頁，共六十頁，2022年，8月28日U1-snRNAUC-CAUACAUApppmGU1-snRNPU2-snRNAAUGAUGUpppmGU2-snRNPsnRNP與hnRNA的結合內含子可以彎成套索UACUACA-AGAG-GUAUGU外顯子1外顯子2hnRNA5′3′44第四十四頁，共六十頁，2022年，8月28日②③UACUACA-AGUGU4U5U6E1E2U1U2UACUACA-AGUGU6E1E2U1、U4、U545第四十五頁，共六十頁，2022年，8月28日（2）mRNA的剪接過程除掉內含子、連接外顯子：兩次轉酯反應（transesterification）UpAGpUU-OH（pppG、ppG）pG-OH（輔酶）pAGpUUpUpAG-OH轉酯反應1（親電子攻擊）轉酯反應2pGpG外顯子1外顯子2內含子46第四十六頁，共六十頁，2022年，8月28日肝臟apoB100（分子量為500000）5.mRNA的編輯(mRNAediting)?RNA編輯作用說明，基因的編碼序列經過轉錄后加工，是可有多用途分化的，因此也稱為分化加工(differentialRNAprocessing)。人類apoB基因mRNA（14500個核苷酸）mRNA編輯腸道細胞apoB48（分子量為240000）47第四十七頁，共六十頁，2022年，8月28日二、tRNA前體的后加工（一）tRNA前體的后加工的內容1．切除多余的順序（1）含單個tRNA的tRNA前體：在5′端和3′端各有一段多余順序；（2）含二個tRNA的tRNA前體：5′端和3′端有長短不一的多余順序，在兩個tRNA之間還有數(shù)目不等的核苷酸隔開。（3）有的真核tRNA前體的反密碼子環(huán)區(qū)含有一個居間順序。48第四十八頁，共六十頁，2022年，8月28日RNA-polⅢ轉錄的基因及其初級產物TloopDHU-loopCAC虛線部分要在轉錄后加工剪除同時在3′末端加上“—CCA”TGGCNNAGTGCGGTTCGANNCC49第四十九頁，共六十頁，2022年，8月28日二、tRNA的轉錄后加工TGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNATGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNAtRNA前體RNApolⅢRNApolⅢtRNA前體50第五十頁，共六十頁，2022年，8月28日tRNA的剪接是酶促反應切除以下實驗可以推論和證實tRNA的剪接是需要酶的：成熟的tRNA能競爭性地抑制tRNA的剪接，這是酶促反應的特征之一。tRNA的成熟過程對溫度敏感。內含子的核酸內切酶由tRNA基因內含子編碼反應需要ATP供能RNaseP及內切酶tRNA核苷酸轉移酶及連接酶ATPA-OHCC51第五十一頁，共六十頁，2022年，8月28日2．各種稀有堿基的生成（1）甲基化：如tRNA甲基轉移酶催化的反應：嘌呤→甲基嘌呤。（2）還原反應：U→DHU。（3）核苷內轉位反應：尿嘧啶核苷→假尿嘧啶核苷（ψ：psai）。（4）脫氨基反應：A→I。3．在3′-末端出去個別