基因工程常規(guī)技術(shù)核酸提取純化

基因工程常規(guī)技術(shù)核酸提取純化1第一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日第4章

基因工程常規(guī)技術(shù)第二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日由于提取DNA的目的、種類(lèi)、所用的生物、組織材料、實(shí)驗(yàn)條件等不同，DNA的提純有很多方法。其中最常用的是堿抽提法DNA的提取與純化3第三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日一、質(zhì)粒DNA的提取

較為常用的有堿抽提法、煮沸法和去污劑裂解法。前兩種方法比較劇烈，適用于較小的質(zhì)粒（<15kb）,去污劑法比較溫和，一般用于分離大質(zhì)粒。4第四頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日plasmidDNAGenomicDNA5第五頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日大腸桿菌基因組DNA6第六頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日分離方法的原理：質(zhì)粒DNA與細(xì)菌DNA物理性質(zhì)上的一些差異，其中最明顯的是分子大小。最大的質(zhì)粒是大腸桿菌染色體的8％，絕大多數(shù)質(zhì)粒遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于它7第七頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快。原理DNA雙鏈變性DNA單鏈復(fù)性強(qiáng)堿中性1.堿抽提法提取質(zhì)粒DNA8第八頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日染色體線性DNA或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時(shí)候沉淀下去。變性9第九頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日菌液收集及裂解細(xì)菌收集通過(guò)離心進(jìn)行，不同的質(zhì)?？截悢?shù)，菌液的需求量不同。10第十頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)菌的裂解是在堿性環(huán)境下進(jìn)行的，不同的宿主菌細(xì)胞壁厚薄有差異：革蘭氏陽(yáng)性菌——不用特殊處理，堿裂解即可有效破壁革蘭氏陰性菌——溶菌酶酵母和絲狀真菌——破壁酶或玻璃珠研磨11第十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日所用的試劑作用①溶菌酶能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1，4糖苷鍵。在堿性條件（pH>8）下有活性。②葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力（震蕩）的作用而降解。12第十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日③EDTAMg2+、Ca2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH：強(qiáng)堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。SDS：溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成“蛋白-SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNA酶）變性沉淀。13第十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日冰醋酸把醋酸鉀溶液的pH調(diào)到4.8。用來(lái)中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性。高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。⑥乙醇DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。⑤KAc-HAc緩沖液14第十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日⑦RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE緩沖液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。15第十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。但苯酚會(huì)殘留在DNA溶液中。（現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化DNA)。⑨酚-氯仿選用以上試劑有商業(yè)試劑盒；也可以自己配制。16第十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日堿抽提法提取質(zhì)粒DNA的步驟SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。第一步：溶菌50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA一次配置100ml，滅菌后4度保存。17第十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日溶液II破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和DNA變性。第二步：破膜，蛋白質(zhì)和DNA變性SolutionII的配制(現(xiàn)用現(xiàn)配，室溫使用)：第三步：中和溶液III使DNA復(fù)性、并促使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和染色體DNA、RNA沉淀。SolutionIII的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS3M乙酸鉀（用冰乙酸調(diào)pH至4.8）18第十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日上清液中含有閉合質(zhì)粒DNA。第四步：離心除去沉淀0.6倍體積的異丙醇或2倍體積的無(wú)水乙醇。第五步：純化DNA上清液過(guò)柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA19第十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日2.使用試劑盒提取質(zhì)粒DNA市售的質(zhì)粒提取試劑盒大都采用堿抽提法，不同之處在于純化方式。目前比較常用的純化系統(tǒng)是硅基質(zhì)吸附材料。20第二十頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日原理：在高鹽環(huán)境下質(zhì)粒DNA能夠結(jié)合到硅基質(zhì)上，然后用低鹽緩沖液或水將質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)上洗脫下來(lái)。得到的質(zhì)?？梢杂糜诿盖?、PCR、測(cè)序、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)下游實(shí)驗(yàn)。21第二十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日天根生化質(zhì)粒提取試劑盒提取流程22第二十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日23第二十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日最重要的是：菌株的遺傳背景，質(zhì)粒自身的拷貝數(shù)。一般要使用endA基因發(fā)生突變的大腸桿菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。（1）受體菌株endA基因編碼核酸內(nèi)切酶Ⅰ，在Mg2+的存在下可將雙鏈DNA消化成7bp的寡核苷酸片斷。影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素24第二十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日這是直接決定DNA產(chǎn)量的重要因素之一。（3）質(zhì)粒大小分子量大的質(zhì)粒，拷貝數(shù)少。（2）質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)粒本身的性質(zhì)所決定。25第二十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日若干常用質(zhì)粒的理論產(chǎn)量質(zhì)粒名分子大小bp拷貝數(shù)質(zhì)粒產(chǎn)量g/mlpGEMpUCpBR322ColE1pACYCpSC101270027004400450040009000300-700500-700>25>15≈10≈61.8-4.12.9-4.1>0.32>0.15≈0.09≈0.1226第二十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日一般過(guò)程及原理：1.細(xì)菌基因組DNA的制備（1）細(xì)胞裂解物理方法：以機(jī)械力的方法打破細(xì)胞外的屏障化學(xué)方法：將細(xì)胞暴露在能夠?qū)?xì)胞整體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響的化學(xué)藥物中，包括一種能夠攻擊細(xì)胞壁的成分和一種能夠除去細(xì)胞膜的成分常用于大腸桿菌的裂解液成分：10%SDS、EDTA和溶菌酶二、基因組DNA的提取27第二十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日（2）DNA純化細(xì)菌提取物包含：DNA;大量的蛋白質(zhì)和RNA（屬于多余成分）去蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方法：加入苯酚;或1:1的苯酚與氯仿的混合物。原理：能沉淀出蛋白質(zhì)但仍保留核酸(DNA和RNA)在水溶液中。28第二十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日結(jié)果：細(xì)胞提取物和有機(jī)溶劑逐漸混合并離心后，沉淀出的蛋白質(zhì)分子會(huì)聚集在水溶液和有機(jī)溶劑分層的兩相界面處形成白色的凝集物,水溶液中的核酸分子就能夠用吸管分離出來(lái)。29第二十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日30第三十頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日一些RNA分子，特別是mRNA，會(huì)在苯酚處理過(guò)程中被除去，但是絕大多數(shù)的RNA都和DNA一起保留在水溶液中。最有效的除去RNA的方法：

使用核糖核酸酶，它能夠迅速降解RNA分子，把它們變成單核苷酸31第三十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日常用：無(wú)水乙醇、異丙醇乙醇沉淀法的額外優(yōu)點(diǎn)是將短鏈和單體核酸成分留在了溶液中。核糖核酸酶處理產(chǎn)生的核苷酸因此在這一步得到了去除。（3）沉淀DNA32第三十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日33第三十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日34第三十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日一般過(guò)程及原理：動(dòng)物組織剪成小塊，勻漿或置液氮中凍結(jié)后研磨成細(xì)粉末。組織培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化松散后直接使用。（1）組織粉碎2.哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA的抽提35第三十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50oC溫育。（2）細(xì)胞裂解（3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。SDS是離子型去垢劑（detergent），可以使細(xì)胞膜崩解。（5）除去RNA污染RNase。無(wú)水乙醇（可以加入1/10體積的3M乙酸銨輔助沉淀）異丙醇（4）沉淀DNA36第三十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日一般過(guò)程及原理：（1）組織粉碎用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉末。3.從植物組織中制備DNA（2）細(xì)胞裂解用2%CTAB/2-ME(十六烷基三甲基溴化銨/2巰基乙醇）。或1%SDS和蛋白酶K。65oC溫育1h左右。2%CTAB抽提緩沖液：CTAB10g；5MNaCl140ml；0.5MEDTA25ml；1MTris-Cl（pH8.0）50ml；加ddH2O定容至500ml。37第三十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日用0.6倍體積的異丙醇（3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。（4）沉淀DNA（5）除去RNA污染用RNaseA。（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）。38第三十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日三、噬菌體DNA的提取

噬菌體DNA一般都是從噬菌體顆粒中制得，不從被侵染細(xì)胞中制得，因此不存在被細(xì)菌DNA污染的問(wèn)題。但除去噬菌體衣殼過(guò)程中需要用到專(zhuān)門(mén)技術(shù)。一個(gè)例外：M13噬菌體的雙鏈復(fù)制模式，像細(xì)菌質(zhì)粒一樣，M13噬菌體DNA也能夠從被侵染的大腸桿菌中獲得。39第三十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日噬菌體顆粒能夠從被侵染細(xì)菌的細(xì)胞外培養(yǎng)基中大量獲得。當(dāng)這樣的培養(yǎng)物被離心時(shí)，細(xì)菌聚集成小球沉淀在離心管的底部，把噬菌體顆粒留在了懸液中,噬菌體顆粒接著被從懸液中收集起來(lái)。噬菌體DNA需要經(jīng)過(guò)一個(gè)去除蛋白的步驟以除去蛋白衣殼后才能夠得到。40第四十頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日41第四十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日溶源性λ噬菌體的制備：被侵染培養(yǎng)物主要是由含有已經(jīng)整合到細(xì)菌染色體的前噬菌體的細(xì)胞所組成，在這種環(huán)境下，細(xì)胞外的λ噬菌體濃度非常低。為了得到高產(chǎn)量的細(xì)胞外λ噬菌體，培養(yǎng)物必須被誘導(dǎo)，以使所有細(xì)菌進(jìn)入侵染循環(huán)中的溶解階段，導(dǎo)致細(xì)胞死亡并將λ噬菌體顆粒釋放到培養(yǎng)基中1.λ噬菌體DNA的抽提42第四十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日43第四十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日非溶源性λ噬菌體的制備絕大多數(shù)的噬菌體都是溶源性噬菌體，但很多源自λ噬菌體的克隆載體都經(jīng)過(guò)了改造，切除了一些基因以消除細(xì)菌的溶源性。因此這些噬菌體就不能夠整合到細(xì)菌基因組中，并且只能夠通過(guò)細(xì)菌溶解循環(huán)來(lái)侵染細(xì)胞。44第四十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日存在的問(wèn)題：噬菌體在細(xì)胞分裂達(dá)到其最大分裂速度之前加入，所有細(xì)胞都會(huì)立刻溶解，這樣得到的噬菌體濃度非常低。另一方面，如果細(xì)胞密度太高的情況下加入噬菌體，培養(yǎng)物不能夠徹底溶解，所得的噬菌體濃度也比較低。45第四十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日46第四十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日噬菌體顆粒在上清液中一般過(guò)程及原理：（1）離心收集噬菌體顆粒（2）聚乙二醇(PEG)沉淀噬菌體顆粒聚乙二醇是一種長(zhǎng)鏈多聚化合物，在鹽存在下，能夠吸收水分，使像噬菌體顆粒這樣的大分子聚集沉淀（3）重懸噬菌體顆粒收集并在一個(gè)適當(dāng)?shù)男◇w積中重新溶解47第四十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日（4）CsCl密度梯度離心48第四十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日（5）透析除去CsCl49第四十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日（6）除去蛋白質(zhì)有機(jī)溶劑法、酶法（7）沉淀DNA無(wú)水乙醇、異丙醇50第五十頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日2.M13噬菌體DNA的抽提被侵染培養(yǎng)物的生長(zhǎng)；離心沉淀細(xì)菌；PEG沉淀噬菌體顆粒；苯酚抽提分離噬菌體蛋白外殼；乙醇沉淀濃縮制得DNA。一般過(guò)程及原理：51第五十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日52第五十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日1.紫外光譜法DNA（或RNA）在260nm波長(zhǎng)處有特異的紫外吸收峰。用微量比色杯（10l）在紫外分光光度計(jì)直接測(cè)定。原理：蛋白質(zhì)在280nm處有吸收峰四、DNA的定量和純度測(cè)定53第五十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日54第五十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日溴化乙錠（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能發(fā)紅色熒光。2.瓊脂糖凝膠電泳估計(jì)原理：與已知濃度的DNA電泳帶熒光強(qiáng)度對(duì)比，就可以估計(jì)出DNA含量。55第五十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日一般使用瓊脂糖凝膠電泳，與已知分子量的DNA標(biāo)準(zhǔn)混合液對(duì)比得知。DNA分子量Marker有許多公司的商品，使用非常方便。如DNA的HindⅢ酶切物等。五、DNA分子量的估計(jì)MarkerMarker56第五十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日DNAladder28kb2500bp2300bp1300bp900bp750bp200bp5000bp20kb1000bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp100bpDNAMarker57第五十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日58第五十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日總RNA的提取與純化

不同豐度組織名稱(chēng)樣品量總RNA含量高豐度肝臟1mg2-4μg脾臟1mg心臟1mg中豐度大腦1mg0.05-2μg胚胎1mg腎臟1mg肺1mg低豐度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高豐度成纖細(xì)胞1050.5-1μg人白細(xì)胞105中豐度酵母1050.5-1.5μg擬南芥葉片1mg0.2-0.5μg低豐度煙草葉片1mg0.05-0.1μg玉米葉片1mgRNA分布59第五十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日RNA提取注意事項(xiàng)制備RNA的關(guān)鍵—防止內(nèi)外源RNase的作用RNase的特點(diǎn)：抗酸抗堿,具很廣pH作用范圍;

抗高溫嚴(yán)寒(0-65℃均具活性）

抗變性劑60第六十頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日RNA提取注意事項(xiàng)體內(nèi)RNase樣品取材要新鮮，并且在液氮或-70℃冰箱中凍存。RNA提取試劑的選擇，TRIzolReagent或試劑盒。勻漿器或是研缽；破碎細(xì)胞要快速；盡量在低溫下進(jìn)行。體外RNase空氣中的RNase試劑中帶有的RNase實(shí)驗(yàn)耗材實(shí)驗(yàn)者本身61第六十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日解決辦法：

外源RNase—高溫，焦碳酸二乙酯(DEPC)處理所有溶液，（Tris·HCl除外）和器皿，操作者帶手套

內(nèi)源RNase—高溫抽提，強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，RNase抑制劑，蛋白酶K等

62第六十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日DEPC有刺激性，對(duì)眼睛氣道粘膜有強(qiáng)刺激，在操作中應(yīng)盡量在通風(fēng)的條件下進(jìn)行，DEPC毒性并不是很強(qiáng)，但吸入的毒性是最強(qiáng)的，使用時(shí)戴口罩，不小心占到手上注意立即沖洗。高溫高壓121℃，15min，DEPC即降解成二氧化碳和水63第六十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日總RNA的提取與純化

一般流程：

1、樣本前處理2、細(xì)胞裂解釋放RNA

3、RNA的純化及獲得4、RNA質(zhì)量檢測(cè)

64第六十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日樣品前處理新鮮血液，不超過(guò)4小時(shí)新鮮的幼嫩組織生長(zhǎng)旺盛期的細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的新鮮組織65第六十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞裂解釋放RNA異硫氰酸胍/酚－TRIzol總RNA提取試劑胍鹽/β-巰基乙醇—RNAprep系列RNA提取試劑盒獨(dú)特配方--RNApla