外源基因的表達及其優(yōu)化策略

外源基因的表達及其優(yōu)化策略第一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日本章重點掌握內(nèi)容基因表達的關鍵要素及要求影響外源基因表達的因素表達產(chǎn)物的純化甲醇酵母表達系統(tǒng)第二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第一節(jié)影響外源基因表達的因素基因表達：從DNA分子有序地將其所承載的遺傳信息，通過密碼子和反密碼子系統(tǒng)，轉(zhuǎn)變?yōu)橛商囟ò被犴樞驑嫵傻亩嚯幕虻鞍踪|(zhì)分子過程，從而決定生物有機體遺傳表型。第三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

基因表達是指結構基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程?；蚬こ讨校蚋咝П磉_研究是指外源基因在某種細胞中的表達活動，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個基因表達體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達產(chǎn)物。第四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

基因表達

遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞過程。中心法則centraldogma第五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日克隆基因的表達

外源基因在宿主細胞中表達

外源基因

表達載體

重組載體

導入宿主細胞

在宿主細胞中表達出蛋白質(zhì)

提取蛋白

宿主細胞：

原核細胞或真核細胞第六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

一、影響外源基因表達的因素主要有：

閱讀框架

順式作用元件

翻譯過程

表達體系第七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

（一）閱讀框架(openreadingframe)對外源基因表達的影響

（二）順式作用元件(cis-actingelement)對基因表達的影響順式作用元件是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結合位點，如啟動子、增強子和沉默子

1.對基因轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控

2.對基因轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控

3.對DNA結構的影響第八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日（二）順式作用元件(cis-actingelement)對基因表達的影響1.對基因轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控

1)啟動子：RNA聚合酶及轉(zhuǎn)錄起始點周圍的一組轉(zhuǎn)錄控制組件TATAboxGCboxCAATBox提高轉(zhuǎn)錄準確性與頻率

2)增強子：遠離轉(zhuǎn)錄起始點（上游或下游）、決定組織特異性表達、增強啟動子轉(zhuǎn)錄活性的特異DNA序列

3)沉默子：負調(diào)節(jié)元件，對基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用第九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

（二）順式作用元件對基因表達的影響

2.對基因轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控

1)終止子：給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列

2)衰減子：操縱子的前導區(qū)(操縱子內(nèi)開始轉(zhuǎn)錄到結構基因編碼開始位置之間的一段DNA)內(nèi)類似于終止子結構的一段DNA序列

3.對DNA結構的影響

1)核基質(zhì)結合區(qū)：造成一種分割作用，使每個轉(zhuǎn)錄單元保持相對的獨立性

2)絕緣子：阻止臨近調(diào)控元件，對所界定基因的啟動子起增強或者阻遏的作用

3)基因座控制區(qū)：以組織特異性及拷貝數(shù)依賴的方式將相關基因的表達增強到生理學水平的異位染色質(zhì)位點第十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

（三）翻譯過程對表達的影響

1.翻譯起始對基因表達的影響

2.密碼子偏愛性對基因表達的影響

3.翻譯終止對基因表達的影響（四）表達系統(tǒng)對表達產(chǎn)物的影響第十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

外源基因表達系統(tǒng)由基因表達載體和相應的受體細胞兩部分組成。宿主細胞分為兩大類：第一類為原核細胞：大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等；第二類為真核細胞：

酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。

目前使用最廣泛的宿主菌是大腸桿菌和釀酒酵母，已建立了許多適合它們的克隆載體和DNA導入方法。許多外源基因已獲得成功表達。第十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日用原核生物作宿主。

AdividingE.coli

原核或噬菌體啟動子

MCS

SD序列

終止子

第十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢

全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架

基因克隆表達系統(tǒng)成熟完善

繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定

被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物第十四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征大腸桿菌表達外源基因的劣勢

缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復性功能缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構象不正確的異源蛋白真核與原核生物結構上存在差別第十五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

一、原核生物細胞表達的特點

1.原核生物只有一種RNA聚合酶識別原核細胞的啟動子，催化所有RNA的合成。

2.原核生物的表達是以操縱子為單位的。Z編碼-半乳糖苷酶；Y編碼-半乳糖苷透過酶；A編碼-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶。第十六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

一、原核生物細胞表達的特點

3.原核生物的轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，也是連續(xù)進行的。

4.原核細胞中缺乏真核細胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。

5.原核生物基因的控制主要在轉(zhuǎn)錄水平，這種控制要比對基因產(chǎn)物直接控制要慢。第十七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進行第十八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

一、原核生物細胞表達的特點

6.在大腸桿菌mRNA的核糖體結合位點上，含有一個翻譯起始密碼子及同16SRNA3’末端堿基互補的序列，即SD序列。

Shine-Dalgarno（S-D）sequence:含有一個啟始密碼子和一段同核糖體16SRNA3’末端堿基互補的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。第十九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

二、外源基因在原核細胞中表達具備條件

1.通過表達載體將外源基因?qū)胨拗骶⒅笇拗骶拿赶到y(tǒng)合成外源蛋白。

2.外源基因不能帶有間隔順序(內(nèi)含子)，因而必須用cDNA或全化學合成基因，而不能用基因組DNA。

3.必須利用原核細胞的強啟動子和SD序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達。

4.外源基因與表達載體連接后，必須形成正確的開放閱讀框架(ORF)。

5.利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達，防止外源基因的表達產(chǎn)物對宿主菌的毒害。

第二十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

原核生物基因表達載體的組成特征

啟動子

核糖體結合位點(SD序列)

終止子

選擇標記基因

復制子原核生物基因表達的受體系統(tǒng)

大腸桿菌受體系統(tǒng)、芽孢桿菌受體系統(tǒng)

鏈霉菌受體系統(tǒng)、藍藻受體系統(tǒng)第二十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日大腸桿菌表達載體的基本成分第二十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日三、原核生物基因表達的調(diào)控

1.啟動子是DNA上的能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列。

（1）啟動子序列

大腸桿菌的所有啟動子中都有兩段一致順序（consensussequence）。

-35Box和

-10Box

第二十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日不同啟動子的consensussequences

第二十四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日三、原核生物基因表達的調(diào)控

1.啟動子

（1）啟動子序列

-35box：RNA聚合酶

亞基的識別位點

。

5’-TTGACA-3’

-10box（PribnowBox）：5’-TATAAT-3’

TTGACA

TATAAT轉(zhuǎn)錄起始位點

17bp

5’

核糖體結合位點

第二十五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日原核啟動子共有序列的功能

三、原核生物基因表達的調(diào)控

1.啟動子

（1）啟動子序列第二十六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

三、原核生物基因表達的調(diào)控

1.啟動子

（2）翻譯的起始位點

a)核糖體結合位點（

ribosomebindingsite,RBS）

Shine-Dalgarno（SD）

sequence：

mRNA上與核糖體16sRNA結合的序列。

S-D序列距離AUG的距離也影響翻譯

b)起始密碼：位于SD序列下游

AUG（91%）、GUG（8%）、UUG（1%）第二十七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日三、原核生物基因表達的調(diào)控

2.RNA多聚酶大腸桿菌只有一種類型的RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄tRNA，rRNA和mRNA。

第二十八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日三、原核生物基因表達的調(diào)控

3.

轉(zhuǎn)錄終止子在表達載體克隆位點的下游一般設計一段轉(zhuǎn)錄終止子。

啟動子

操縱區(qū)S-D序列

目的基因

終止子

第二十九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日三、原核生物基因表達的調(diào)控

3.轉(zhuǎn)錄終止子

原理：

莖環(huán)結構反向回文順序被轉(zhuǎn)錄后，立即形成一個莖環(huán)結構，使轉(zhuǎn)錄物與模板之間配對的堿基數(shù)降低，整個減弱了RNA與DNA的互作

多聚A/U由于莖環(huán)3’段緊接一串A/U的配對，穩(wěn)定性比較差，有利于轉(zhuǎn)錄物脫落而不利于轉(zhuǎn)錄延續(xù)。

第三十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日三、原核生物基因表達的調(diào)控

3.轉(zhuǎn)錄終止子第三十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日三、原核生物基因表達的調(diào)控

3.轉(zhuǎn)錄終止子第三十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日三、原核生物基因表達的調(diào)控

4.翻譯終止密碼大腸桿菌偏愛UAAU。一般安置上全部的三個終止密碼防止核糖體跳躍（skipping）。

5.翻譯增強子（Translationenhancer）能夠顯著增強外源基因在大腸桿菌細胞中的表達效率的特殊序列。

T7噬菌體基因10前導序列（簡稱g10-L序列）;

大腸桿菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的區(qū)段第三十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日四、常用大腸桿菌表達載體1.非融合型表達載體載體表達出的外源基因蛋白質(zhì)不與細菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起。S-D序列ATG-外源基因-TAG優(yōu)點：產(chǎn)物結構接近于真核細胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)結構。缺點：容易被宿主菌的蛋白酶所破壞。第三十四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日四、常用大腸桿菌表達載體

1.非融合型表達載體

pKK223-3載體：結構組成：

1）強啟動子:tac（trp-lac）

2）操縱基因：乳糖操縱子系統(tǒng)。

trp的-35區(qū)

lacUV5的-10區(qū)

lac操縱基因

第三十五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

四、常用大腸桿菌表達載體

1.非融合型表達載體

pKK223-3載體：結構組成：

3）調(diào)節(jié)基因：宿主菌染色體上的乳糖操縱子系統(tǒng)。

如JM105菌。

4）終止子：rrnB的強終止子

S-D序列和插入位點區(qū)：S-D

插入位點區(qū)

LacI

第三十六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日四、常用大腸桿菌表達載體

1.非融合型表達載體

pKK223-3載體：結構組成：

6）載體的其余部分：來自pBR322質(zhì)粒。

7）表達誘導物：IPTG（乳糖的類似物，不會被降解）tacP

LacO

S-D

插入位點區(qū)

rrnBT

宿主lacI

阻遏物

IPTG

第三十七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日四、常用大腸桿菌表達載體

1.非融合型表達載體

pKK223-3載體：條件：必須選擇一個有l(wèi)acI的宿主菌。第三十八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日四、常用大腸桿菌表達載體

2.分泌型表達載體載體表達出的外源蛋白質(zhì)與細菌的分泌信號肽連在一起，可被宿主菌分泌到細胞周質(zhì)中。

如：pINIII系列：pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,第三十九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日四、常用大腸桿菌表達載體

2.分泌型表達載體

pINIII系列組成結構

1）強啟動子：Ipp（脂蛋白基因啟動子）和lacUV5啟動子。

2）調(diào)節(jié)基因：lacI。

3）S-D序列和起始密碼ATG。

4）分泌信號肽：大腸桿菌外膜蛋白基因ompa。

5）插入位點區(qū)（多克隆位點）。Ipp

lacP

lacO

S-D/ATG

ompa

插入位點

第四十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日pINIII-comA1

四、常用大腸桿菌表達載體

2.分泌型表達載體第四十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

四、常用大腸桿菌表達載體

3.融合蛋白表達載體系統(tǒng)表達出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接在一起的。如：pGEX系列優(yōu)點：便于融合蛋白的分離和純化。

組成結構：

1）啟動子：tac

2）操縱基因：lacP

3）調(diào)節(jié)基因：lacI

4）S-D序列

5）ori：pBR322ori6）融合肽：GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）第四十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

四、常用大腸桿菌表達載體

3.融合蛋白表達載體系統(tǒng)

pGEX系列l(wèi)acI

taclacO

S-D/ATG

GST

插入位點

TGA

lacP

GST融合蛋白用GlutathioneSepharose親和層析柱分離純化。產(chǎn)物提純:第四十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

四、常用大腸桿菌表達載體

3.融合蛋白表達載體系統(tǒng)

pGEX系列

產(chǎn)物分離:用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白從GST上切下來。

第四十四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日pGEX-2X的插入?yún)^(qū)pGEX-1X的插入?yún)^(qū)pGEX-3X的插入?yún)^(qū)四、常用大腸桿菌表達載體

3.融合蛋白表達載體系統(tǒng)

pGEX系列插入?yún)^(qū)第四十五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日四、常用大腸桿菌表達載體

4.其他融合蛋白系統(tǒng)

His-tag（組氨酸標簽）在外源多肽的N端或C端接上6個組氨酸（His）。

His-tag能與Ni2+柱結合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脫下來，可以純化蛋白質(zhì)。第四十六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日五、外源基因在大腸桿菌中的表達形式位于細胞質(zhì)細胞周質(zhì)細胞外表達產(chǎn)物形式包涵體蛋白融合蛋白整合型外源蛋白分泌型外源蛋白第四十七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日細胞質(zhì)中表達:

外源基因在大腸桿菌寄主細胞質(zhì)中高效表達時，常會發(fā)生一種特殊的生理現(xiàn)象，形成包涵體。包涵體：存在于細胞質(zhì)中的一種由不可溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結構物。第四十八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)的合成是在細胞之中進行的

目標蛋白在細胞質(zhì)中表達的主要優(yōu)點是：

表達質(zhì)粒的構建比較簡單；能夠達到很高的目標蛋白表達量，一般可以達到占細胞總蛋白的20%～40%。

目標蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達的形式有二種：

在細胞內(nèi)表現(xiàn)為不溶性的包涵體顆粒

包涵體存在于大腸桿菌細胞質(zhì)中

在細胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì)

可溶性的目標蛋白質(zhì)除可存在于細胞質(zhì)中外，還可借助于本身的功能序列和大腸桿菌蛋白質(zhì)加工、運輸體系，最終分泌到周質(zhì)空間，或外泌到培養(yǎng)液中。第四十九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日周質(zhì)中表達：

周質(zhì)：在大腸桿菌一類革蘭氏陰性菌中，位于內(nèi)膜和外膜之間的細胞結構部分。在周質(zhì)中表達的蛋白，需要信號肽序列才能從細胞質(zhì)中穿過細胞質(zhì)內(nèi)膜進入周質(zhì)。第五十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日胞外表達：

使克隆在大腸桿菌細胞中表達的外源蛋白質(zhì)，分泌到胞外培養(yǎng)基中進行分離純化。途徑：

1.用大腸桿菌細胞固有的途徑，使真正屬于分泌型的蛋白質(zhì)直接分泌到胞外培養(yǎng)基中。（不是特別有效的程序）

2.誘導大腸桿菌細胞的外膜發(fā)生有限的滲漏，導致胞內(nèi)的蛋白質(zhì)向胞外培養(yǎng)基方向分泌。（可以分離到中等產(chǎn)量的蛋白質(zhì)）第五十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日五、外源基因在大腸桿菌中的表達形式

1.包涵體蛋白

本質(zhì)：細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的不斷聚集

包括：1.折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用；

2.非折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用；

3.蛋白質(zhì)的中間體結構。

優(yōu)點：易于分離純化第五十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日包涵體及其性質(zhì)在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結構，這種水不溶性的結構稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。

包涵體基本由蛋白質(zhì)組成，其中大部分是外源基因的表達產(chǎn)物，具有正確的AA序列，但空間構想往往是錯誤的，因而沒有活性，此外，它還含有受體細胞本身高效表達的蛋白產(chǎn)物（如RNA聚合酶、外膜蛋白等），以及質(zhì)粒的編碼蛋白，其第三種組分是DNA、RNA、脂多糖等非蛋白分子。第五十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日包涵體表達形式的優(yōu)點在一定程度上保持表達產(chǎn)物的結構穩(wěn)定

能夠避免細胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標蛋白的富集

簡化外源基因表達產(chǎn)物的分離操作

包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來能夠表達對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應的目標蛋白。第五十四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日包涵體表達形式的缺點

以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復性操作，才能回收得到具有正確空間構象（因而具有生物活性）的目標蛋白，因此包涵體變復性操作的效率對目標產(chǎn)物的收率至關重要。

經(jīng)過復性處理的目標蛋白不一定能完全恢復原來的生物學活性，有時甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其當目標蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時，體外復性蛋白質(zhì)的成功率相當?shù)?，一般不超過30%

復性處理工藝可使目標蛋白的制備成本上升。第五十五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日形成包涵體的原因：

缺少真核生物中翻譯后修飾所需的酶，使中間體大量積累。

缺乏蛋白質(zhì)折疊過程中需要的某些酶和輔因子，或環(huán)境不適無法

形成正確的次級鍵。

表達水平（重組異源蛋白過量表達）。

細菌的遺傳性狀。

異源蛋白氨基酸序列（含硫氨基酸越多越容易）。第五十六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日減少形成包涵體的策略：

降低重組菌的生長溫度

添加可促進重組蛋白質(zhì)可溶性表達的生長添加劑（高濃度多醇類、蔗糖）

供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)基（供氧、pH等）第五十七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日包涵體的分離：

菌體破碎（高壓勻漿、高速碾磨、低溫反復凍融等）

離心收集（高速離心）

清洗（去污劑和低濃度變性劑洗滌以除去脂類和膜蛋白）第五十八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日包涵體的變性與復性操作

包涵體的溶解與變性包涵體的溶解與變性的主要任務是拆開錯配的二硫鍵和次級鍵。在人工條件下，使包涵體溶解并重新進入復性途徑中。

能有效促進包涵體溶解變性的試劑和條件包括：

清洗劑SDS、正十二醇肌氨酸

促溶劑鹽酸胍、尿素

混合溶劑如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強極端pH

廉價，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應第五十九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日包涵體的變性與復性操作包涵體的復性與重折疊

包涵體的復性與重折疊的主要任務：

將多肽鏈中被拆開的游離巰基重新折疊通過次級鍵的形成使蛋白質(zhì)復性第六十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日伸展態(tài)后期中間體中間體聚集體（聚集過程）天然態(tài)（復性過程）快慢慢

包涵體蛋白質(zhì)的折疊復性效率取決于正確折疊過程與聚集過程之間的競爭，涉及兩種疏水作用：分子內(nèi)疏水相互作用，可促進正確折疊；部分折疊肽鏈分子間的疏水相互作用，會導致蛋白質(zhì)聚集。第六十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日一個有效、理想的折疊復性方法應具備的特點：活性蛋白質(zhì)的回收率高正確復性的產(chǎn)物易于與錯誤折疊的蛋白質(zhì)分離折疊復性后應得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品

折疊復性方法易于放大

復性過程耗時較少第六十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

五、外源基因在大腸桿菌中的表達形式

2.融合蛋白

將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個基因的閱讀框，這種方式表達的蛋白.

優(yōu)點：穩(wěn)定性加強；具有較高的水溶性和一定的生物活性；能高效表達；易于分離純化.第六十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日融合基因：通常是指通過自發(fā)突變事件形成的或是應用DNA重組技術構建的一類具有來自兩個或兩個以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。融合蛋白質(zhì)：由克隆在一起的兩個或數(shù)個不同基因的編碼序列組成的融合基因，轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生的單一的多肽序列。其中通常受體細菌蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。第六十四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

融合蛋白質(zhì)配偶體：指融合蛋白質(zhì)中與目標蛋白質(zhì)連接的別種蛋白質(zhì)組分。

常見的配偶體：葡萄球菌蛋白質(zhì)A(SPA)、鏈球菌蛋白質(zhì)G(SPG)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結合蛋白(MBP)和硫氧還蛋白(Trx)。第六十五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日融合蛋白表達系統(tǒng)的構建的三個原則：

首先，受體細菌結構基因應能高效表達，且其表達產(chǎn)物可以通過親和層析進行特異性簡單純化。

其次，外源基因應插在受體菌結構基因的下游區(qū)域，并為融合蛋白提供終止密碼子。另外，兩個結構基因拼接位點處的序列設計十分重要，它直接決定了融合蛋白的裂解方法。

最后，當兩個蛋白編碼序列融合在一起時，外源基因的表達取決于其正確的翻譯閱讀框架。

第六十六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日生命科學學院第六十七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日用融合載體組合表達融合蛋白質(zhì)：

以Ecoli.lacZ為靶基因的組合最典型，含三個不同載體，每個載體都有一個lacZ啟動子和SD序列，且在lacZ基因下游部位具有一EcoRⅠ識別序列(GAATTC)5’上游存在著不同數(shù)量的G-C堿基對。三種情況必有一個保持著正確的讀碼結構，產(chǎn)生出真實的融合蛋白質(zhì)。第六十八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日生命科學學院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達第六十九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第七十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達第七十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日大腸桿菌甘露醇-1-磷酸脫氫酶基因(mtld)引物引物1：5‘GTTGGATCCATGAAAGCATTACATTTTGGCG3’引入BamHI酶切位點引物2：5‘TGGGAGCTCATTATTGCATTGCTTTATAAGCG3’引入SacI酶切位點全長1149bp，382個氨基酸，45kD第七十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日融合蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)的優(yōu)點：

第一個顯著特點是穩(wěn)定性大大增加。

第二個特點是融合蛋白質(zhì)的多肽片段有可能構成信號肽序列指導蛋白質(zhì)分配到細胞的正確部位。

第三個特點是分離純化簡單。可根據(jù)受體細菌蛋白的特異性抗體、配體底物等迅速純化融合蛋白質(zhì)。第七十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日融合蛋白質(zhì)的純化

基本原理：利用與融合蛋白質(zhì)配偶體相對應的配體作為吸附劑，制備親和層析柱，通過配偶體與配體之間的相互作用，過柱的融合蛋白質(zhì)被滯留下來，其它蛋白質(zhì)則流出柱外，經(jīng)洗脫處理，便可回收到純化的融合蛋白質(zhì)。第七十四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

異源蛋白質(zhì)的回收：

將其中大腸桿菌多肽組分切除掉。融合蛋白的位點專一性斷裂方法有兩種。化學斷裂法：最佳試劑為溴化氰，作用于甲硫氨酸側鏈進行硫醚基反應，后水解斷裂。蛋白質(zhì)酶法：每種蛋白酶均具有相應的斷裂位點決定簇。試劑識別位點酶識別位點溴化氰Met-XXa因子Ile-Glu-Gly-Arg-X甲酸Asp-Pro凝血酶Gly-Pro-Arg-X羥胺Asn-Gly胰蛋白酶Arg-X枯草蛋白酶Gly-Ala-His-Arg-X第七十五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達第七十六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

五、外源基因在大腸桿菌中的表達形式

3.整合型外源蛋白

外源蛋白的基因序列在宿主細胞染色體的同源序列的介導下，整合到宿主細胞的染色體上，進行表達的方式。

4.分泌型外源蛋白

編碼的外源蛋白在某種機制下分泌到細胞外的這類蛋白。

優(yōu)點：

簡化純化處理工藝；減少外源蛋白降解的概率；有利于形成正確地空間構想，獲得較好的生物活性或免疫原性第七十七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)的外泌表達型

把所表達的目標蛋白外泌到細胞外的培養(yǎng)基中可以進一步減少蛋白水解酶的降解，也有利于分離純化。目前成功的例子主要是采用以下方案:

（1）與大腸桿菌本身的外泌蛋白基因融合表達（2）與一些能提高細胞外膜通透性的因子融合或共表達（3）改變培養(yǎng)基的成分歸納現(xiàn)有的研究結果顯示這些方法僅對外泌分子量較小的蛋白有效，而且外泌效率一般都比較低。第七十八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

六、提高外源基因表達效率的方法

1.選擇強啟動子序列，如tac

等

2.調(diào)整S-D序列與AUG堿的距離

一般為5-9bp

距離過長或過短都影響真核基因的表達。根據(jù)不同的啟動子選擇不同的距離

3.改變起始密碼下面的幾組密碼子

能提高翻譯的起始效率

4.增加mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性第七十九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

六、提高外源基因表達效率的方法

5.減輕宿主細胞的代謝負荷

合理地調(diào)節(jié)代謝負荷與外源基因高效表達的關系

（1）誘導表達

將宿主生長代謝與外源基因表達分開

一般采用溫度誘導或藥物誘導

PL啟動子是溫度誘導型:

cI857

PL

外源基因

PO

第八十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日六、提高外源基因表達效率的方法

5.減輕宿主細胞的代謝負荷

（1）誘導表達

tac啟動子是藥物誘導型

調(diào)節(jié)基因lacI（位于宿主基因組內(nèi)或載體上）始終產(chǎn)生阻遏物。

無IPTG

阻遏物與lac操縱基因結合，抑制外源基因轉(zhuǎn)錄。宿主大量生長。

有IPTG

阻遏物與IPTG結合，lac操縱基因解放，外源基因大量轉(zhuǎn)錄。宿主生長受抑制。第八十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日AmpR

PlasmidpGEX-KGGSTlacIq

PtacPromoterAmpr

IPTG第八十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日六、提高外源基因表達效率的方法

5.減輕宿主細胞的代謝負荷

（2）表達載體誘導復制

將宿主的生長與載體的復制分開。

當宿主大量生長后，再誘導載體制粒的復制，增加拷貝數(shù)。

當需要宿主大量生長時，抑制載體質(zhì)粒的復制。

第八十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

六、提高外源基因表達效率的方法

6.提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性

防止被宿主的酶降解。（1）設計成融合蛋白

這是避免被降解的最好措施。

N末端：由原核基因編碼一段多肽，

C末端：是完整的真核外源基因。

質(zhì)粒基因產(chǎn)物

目的基因產(chǎn)物

N

C

切割

第八十四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

六、提高外源基因表達效率的方法

6.提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性

（2）

使用突變菌株，保護外源蛋白不被降解

減少宿主菌本身的蛋白酶的表達。

1)使用次黃嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，減少宿主菌的蛋白酶合成。

2)大腸桿菌的htpR基因突變也減少蛋白酶的降解作用。

3)T4噬菌體的pin基因產(chǎn)物能抑制細菌的蛋白酶。可把pin增加到載體上。第八十五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日六、提高外源基因表達效率的方法

6.提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性

（3）表達分泌蛋白細胞質(zhì)外膜內(nèi)膜周間質(zhì)質(zhì)粒染色體“外排”：蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)跨過內(nèi)外膜到培養(yǎng)液中?！胺置凇保旱鞍踪|(zhì)從細胞質(zhì)跨過內(nèi)膜到周間質(zhì)中。第八十六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

六、提高外源基因表達效率的方法

6.提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性

（3）表達分泌蛋白

細菌蛋白分泌的條件：

有信號肽:位于N端，一般為15-30aa。真核與原核的結構相似,功能相似，可以互換。

堿性氨基酸N疏水氨基酸核心區(qū)切割位點

Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信號肽酶外源蛋白第八十七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日六、提高外源基因表達效率的方法

6.提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性

（3）表達分泌蛋白

細菌蛋白分泌的條件：

蛋白質(zhì)內(nèi)有與分泌相關的aa序列:為蛋白指明目的地。

細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運機制:信號肽酶I、信號肽酶II等近20多種蛋白質(zhì)的參與。

真核細胞中的分泌蛋白能在大腸桿菌中很好地分泌表達；

但非分泌蛋白很難在大腸桿菌中分泌。第八十八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日七、表達產(chǎn)物的檢測

1.westernblotting

前提是：表達產(chǎn)物是已知蛋白第八十九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

七、表達產(chǎn)物的檢測

2.HPLC高效液相層析

第九十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

七、表達產(chǎn)物的檢測

3.聚丙烯酰胺凝膠電泳第九十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日七、表達產(chǎn)物的檢測

4.等電聚焦電泳第九十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日七、表達產(chǎn)物的檢測

5.雙向電泳第九十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日七、表達產(chǎn)物的檢測

6.免疫電泳

7.放射免疫測定

8.酶聯(lián)免疫吸附試驗第九十四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達

原核表達系統(tǒng)與真核表達系統(tǒng)的區(qū)別？

1.原核表達系統(tǒng)的表達系統(tǒng)是原核細胞;真核表達系統(tǒng)則是在真核細胞里例如酵母細胞,昆蟲細胞,哺乳動物細胞中表達。

2.兩種表達系統(tǒng)都是通過含有原核或者真核啟動子以及其他其他表達相關元件的質(zhì)粒系統(tǒng)來實現(xiàn)外源基因的表達。

3.原核表達系統(tǒng)與真核表達系統(tǒng)相比,表達量效率便于優(yōu)化調(diào)整,表達量高.但用來表達真核來源的外源基因時,由于蛋白折疊和糖鏈修飾不同,因此其應用受限.真核表達系統(tǒng)表達量相對較低,雖然酵母和昆蟲系統(tǒng)表達量相對較高,但是在表達哺乳細胞來源基因同樣存在折疊和糖鏈修飾的不足。

第九十五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

一、真核生物基因表達與調(diào)控的特點

1.基因組DNA的存在形式可影響基因表達

2.轉(zhuǎn)錄與翻譯不偶聯(lián)

3.調(diào)控是多層次的

4.具有組織和細胞類型特異性

5.對信號分子反應不同第九十六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

二、真核生物基因表達載體的組成特征

第九十七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

二、真核生物基因表達載體的組成特征

1.原核DNA序列

2.啟動子

組成型啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子、雜合啟動子

3.增強子

4.終止子

5.內(nèi)含子

6.polyA加尾信號

7.選擇標記基因和報告基因第九十八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

三、真核表達的受體系統(tǒng)（一）酵母表達系統(tǒng)酵母是一類最簡單的真核生物,其生長代謝與原核生物相似；但在基因表達與調(diào)控方面類似于高等生物。

1、酵母菌作為表達外源基因受體菌的特征

酵母菌是一群以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖的單細胞真核生物。如果說大腸桿菌是外源基因最成熟的原核生物表達系統(tǒng)，則酵母菌是最成熟的真核生物表達系統(tǒng)。第九十九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日2、酵母菌表達外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，基因表達調(diào)控機理比較清楚，遺傳操作簡便能將外源基因表達產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中具有原核細菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術成熟、工藝簡單、成本低廉不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國FDA認定為安全的基因工程受體系統(tǒng)（GRAS）酵母菌是最簡單的真核模式生物第一百頁，共一百三十頁，2022年，8月28日3、常用的宿主釀酒酵母宿主菌巴斯德畢赤酵母宿主菌乳酸克努維酵母宿主菌多型漢森酵母宿主菌

其中釀酒酵母的遺傳學和分子生物學研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達外源基因最理想。

由畢赤酵母表達應用于臨床的蛋白目前有胰島素，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、腫瘤壞死因子(TNF)、表皮生長因子(EGF)、人血清白蛋白，以及多種抗體等。第一百零一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日4、酵母基因表達載體

酵母載體可以攜帶外源基因在酵母細胞內(nèi)保存和復制，并隨酵母分裂傳遞到子代DNA和RNA單位。酵母菌中的野生型質(zhì)粒酵母菌克隆表達質(zhì)粒的構建第一百零二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日DNA復制起始區(qū)（含兩類復制起始序列）選擇標記（營養(yǎng)缺陷型或顯性選擇標記）有絲分裂穩(wěn)定區(qū)表達盒(啟動子、分泌信號序列、終止子等)第一百零三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日酵母基因表達載體的種類：

YRp類（yeastreplicationplasmid自主復制型質(zhì)粒）YEp類（yeastepisomalplasmid附加體質(zhì)粒）YIp類（yeastintegrativeplasmid整合型質(zhì)粒）

YCp類（yeastcentromericplasmid著絲粒質(zhì)粒）

YAC酵母人工染色體第一百零四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日含有ARS的YRp質(zhì)粒的構建：

ARS為酵母菌中的自主復制序列，，染色體上每30--40kb就有一個ARS元件。酵母菌自主復制型質(zhì)粒的構建組成包括復制子、標記基因、提供克隆位點的大腸桿菌質(zhì)粒DNA。以ARS為復制子的質(zhì)粒稱為YRp以2μ質(zhì)粒上的復制元件為復制子的質(zhì)粒稱為Yep上述兩類質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達200個，但培養(yǎng)幾代后，質(zhì)粒的丟失率高達50%--70%，主要是由于分配不均勻所致。第一百零五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質(zhì)粒的構建:在大腸桿菌質(zhì)粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標記基因，構建出來的質(zhì)粒稱為YIp。目的基因表達盒通常插在染色體DNA特定序列中，這樣目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區(qū)域。第一百零六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日含有CEN的YCp質(zhì)粒的構建:

CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關的序列

將CENDNA插入含ARS的質(zhì)粒中，獲得的新載體稱YCpYCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數(shù)只有1--5個第一百零七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日5、酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（1）酵母菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法

早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，在Ca2+和PEG的存在下，轉(zhuǎn)化細胞可達原生質(zhì)體總數(shù)的1--2%。但該程序操作周期長，而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率的嚴重制約。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的一個顯著特點是，一個受體細胞可同時接納多個質(zhì)粒分子，而且這種共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25--33%。第一百零八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日（2）堿金屬離子介導的酵母菌完整細胞的轉(zhuǎn)化釀酒酵母的完整細胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）、PEG、熱休克處理后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA，而且具有下列特性：吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極為罕見第一百零九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日（3）酵母菌電擊轉(zhuǎn)化法

酵母菌原生質(zhì)體和完整細胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA，但在此過程中應避免使用PEG，它對受電擊的細胞具有較很大的負作用。電擊轉(zhuǎn)化的優(yōu)點是不依賴于受體細胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍廣，而且轉(zhuǎn)化率可高達105/μgDNA。第一百一十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日6、酵母菌表達系統(tǒng)的選擇（1）釀酒酵母表達系統(tǒng)

釀酒酵母基因表達系統(tǒng)最為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫酶基因ADH所屬的啟動子，多種重組外源蛋白獲得成功表達。

釀酒酵母表達系統(tǒng)的最大問題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白（人血清白蛋白等）與受體細胞緊密結合，而不能大量分泌；且發(fā)酵過程中產(chǎn)生乙醇。第一百一十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日（2）乳酸克魯維酵母表達系統(tǒng)

乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產(chǎn)的高效表達穩(wěn)定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也能穩(wěn)定遺傳40代以上。乳酸克魯維酵母表達分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達系統(tǒng)。第一百一十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日1、畢赤酵母是需氧酵母菌，在有氧條件下能高密度生長，因此有利于擴大生產(chǎn)獲得高濃度細胞，從而進行高效表達2、通過質(zhì)粒整合到畢赤酵母基因組的外源基因結構穩(wěn)定，不易丟失；且外源基因能以高拷貝數(shù)整合到畢赤酵母基因組中，能夠篩選到高表達菌株3、畢赤酵母甲醇氧化酶(alcoholoxidase，AOX)基因的強啟動子特別適用于外源基因的調(diào)控表達（3）巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)第一百一十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日4、畢赤酵母自身分泌到培養(yǎng)基中蛋白很少，使得分泌性的外源蛋白容易從培養(yǎng)基的基質(zhì)中分離5、畢赤酵母對外源蛋白產(chǎn)物進行N-乙酰糖基化修飾的結構為高甘露糖型，糖鏈平均為8～14個甘露糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含1，3連接的甘露糖殘基(有強的免疫原性)，因而適用于臨床應用6、使用方便、簡單，而且成本較低第一百一十四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日生長迅速乙醇氧化酶基因AOX1所屬強啟動子表達的可誘導性已有百余種具有經(jīng)濟價值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得成功表達。第一百一十五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日甲醇酵母表達系統(tǒng)⒈甲醇酵母的生物學AOX1andAOX2Mut+andMuts⒉