環(huán)工微生物實驗指導(dǎo)書

10環(huán)境工程微生物學(xué)試驗指導(dǎo)書環(huán)保試驗室2023年728日試驗一 光學(xué)顯微鏡的操作及測微尺的使用一、試驗?zāi)康陌盐展鈱W(xué)顯微鏡的構(gòu)造、原理，學(xué)習(xí)顯微鏡的操作方法和保養(yǎng)觀看細(xì)菌的形態(tài)，并學(xué)會測量細(xì)菌的大小。二、試驗原理顯微鏡的構(gòu)造和各局部的作用顯微鏡分機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩局部(1—1)。(1)機(jī)械局部①鏡筒：鏡筒上端裝目鏡，下端接轉(zhuǎn)換器。鏡簡有單筒距者使用。345個孔。不同規(guī)格的物鏡分別安裝在各孔上。③載物臺：載物臺是放置標(biāo)本的平臺，中心有一圓孔，片。有的載物臺上裝有自動推物器。④鏡臂：鏡臂支撐鏡筒、載物臺、聚光器和調(diào)整器。鏡臂有固定式和活動式(可轉(zhuǎn)變傾斜度)兩種。⑤鏡座：鏡座為馬蹄形，支撐整臺顯微鏡，其上有反光鏡。(調(diào)焦距)各一個?？烧{(diào)整物鏡和所需觀看的物體之間的距離。(2)光學(xué)局部①目鏡：一般使用的顯微鏡具有235l015x5倍、l015倍。觀看微生物時常用放大l015倍的目鏡。②物鏡：物鏡裝在轉(zhuǎn)換器上，可分低倍鏡、高倍鏡和10、40、100。物鏡的性能由數(shù)值孔徑(numericalaperture，N．A．)打算，數(shù)值孔徑n.si/n乘上光線投射到物鏡上的最大夾角α物鏡的角度越大，顯微鏡的效能越大，該角度的大小打算于物鏡的直徑和焦距。n是影響數(shù)值孔徑的因素，顯微鏡的總放大倍數(shù)為物鏡放大倍數(shù)和目鏡放大倍數(shù)的乘積。⑦聚光器：聚光器安裝在載物臺的下面．反光鏡反射來的光線通過聚光器被聚攏成光錐照耀到標(biāo)本上，可增加照明度，造成適宜的光錐角度，提高物鏡的區(qū)分力。聚光器可上、下調(diào)整，以求得最適光度。案光器還附有虹彩光圈，推動把手可隨便調(diào)整透進(jìn)光的強(qiáng)弱。合理調(diào)整案光器的高度和光圈的大小，可得到適當(dāng)?shù)墓庹蘸颓宄膱D像。④反光鏡：反光鏡裝在鏡座上，有平、凹兩面，光源為自然光時用平面鏡，光源為燈使用的是電光源。⑤濾光片：可見光由各種顏色的光組成，不同顏色的光線波長不同。如只需某一波長濾光片有紫、青、藍(lán)、綠、黃、橙、紅等各種顏色，分別透過不同波長的可見光，可依據(jù)標(biāo)本本身的顏色，在聚光器下加相應(yīng)的濾光片。三、試驗裝置與設(shè)備試驗設(shè)備生物顯微鏡。測微尺四、試驗步驟顯微鏡使用方法(1)低倍鏡的使用法置顯微鏡于固定的桌上。旋動轉(zhuǎn)換器，將低倍鏡移到鎊筒正下方，和鏡筒對直。轉(zhuǎn)動反光鏡向著光源處，同時用眼對準(zhǔn)目鏡認(rèn)真觀看，使視野亮度均勻。將標(biāo)本片放在載物臺上，使觀看的目的物置于圓孔正中。將粗調(diào)整器向下旋轉(zhuǎn)(或載物臺向上旋轉(zhuǎn))，眼睛注視物鏡，以防物鏡和載玻片相碰。0.5cm處時停頓旋轉(zhuǎn)。左眼向目鏡里觀看，將租調(diào)整器向上旋轉(zhuǎn)，假設(shè)見到目的物．但不格外清楚，可用細(xì)調(diào)整器調(diào)整，至目的物清楚為止。假設(shè)粗調(diào)整器旋轉(zhuǎn)得太快，使超過焦點(diǎn)，必需從第e步重調(diào)，不應(yīng)正視目鏡狀況下調(diào)粗調(diào)整器，以防沒把握的旋轉(zhuǎn)使物鏡與載玻片相碰撞壞。觀看時兩眼同時睜開，如用左眼看顯微鏡，有眼看桌上紙張，便可一面看一面畫出所看到的物像。高倍鏡的使用法①使用高倍鏡前，先用低倍鏡觀看，覺察目的物后將它移至視野正處。②旋動轉(zhuǎn)換器換高倍鏡，假設(shè)高倍鏡觸及載玻片應(yīng)馬上停頓旋動，說明原來低倍鏡就沒有調(diào)準(zhǔn)焦距，目的物并沒有找到，要用低倍鏡重調(diào)。假設(shè)調(diào)對了,換高倍鏡時根本可以看到目的物假設(shè)有點(diǎn)模糊，用細(xì)調(diào)整器就清楚可見。油鏡的使用方法①假設(shè)用高倍鏡目的物未能看清，可用油鏡。高倍鏡檢查標(biāo)本片，將目的物移到視野正中。②在載玻片上滴一滴香柏油(或液體石蠟)，將油鏡移至正中使油鏡鏡頭浸沒在油中，剛好貼近載玻片。用細(xì)調(diào)整器微微向上調(diào)(切記不用粗調(diào)整器)即可。③用油鏡觀看完畢，用擦鏡紙將鏡頭上的油擦凈、紙蘸少許二甲苯擦試鏡頭，再用擦鏡紙揩干。顯微鏡的保護(hù)法①顯微鏡應(yīng)放在枯燥的地方，使用時需避開猛烈的日光照耀。②物鏡和目鏡不清潔時，應(yīng)當(dāng)用擦鏡紙或軟綢揩干。③用完顯微鏡后，應(yīng)當(dāng)馬上放到鏡匣中。目測微尺、物測微尺及其使用方法5mm50格(100格)用時放在目鏡內(nèi)。物測微尺物測微只是一厚玻片。中心有一圓形蓋玻片。中心刻有1mm長的標(biāo)尺，等分為10010um，用以標(biāo)定目測微尺在不同放大倍數(shù)下每格的實際長度。目測微尺的標(biāo)定將目測微尺裝入目鏡的隔板上，使刻度朝下；把物測微尺放在載條線重合，順著刻度找出另一條重合線。再求出高倍鏡下目測微尺每格的長度。菌體大小的測量將物測微尺取下，換上標(biāo)本片，選擇適當(dāng)?shù)奈镧R測量目的物大小，分別找出菌體的長和寬占目測微尺的格數(shù)l格的長度算出菌體的長度和寬度。細(xì)菌個體形態(tài)的觀看嚴(yán)格按光學(xué)顯微鏡的操作方法，依低倍、高倍及油鏡的次序觀看各示范片，并用鉛筆分別繪出其形態(tài)圖。選擇一種細(xì)菌，量出其尺寸。五、試驗結(jié)果1．結(jié)果分別繪出在顯微鏡下觀看到的細(xì)菌形態(tài)，及細(xì)菌的尺寸。六、試驗結(jié)果爭論(1)?(2)用油鏡觀看時．為什么要在載玻片上滿加香柏油?(3)為什么目測微尺必需用物測微尺標(biāo)定?在某一放大倍數(shù)下，標(biāo)定了目測微尺，假設(shè)放大倍數(shù)轉(zhuǎn)變，它還需重標(biāo)定嗎?試驗二原生動物及微型后生動物的觀看一、試驗?zāi)康慕钚晕勰嗉俺Ｒ娢⑸锏母行陨?，把握微生物活體觀看技術(shù)；把握依據(jù)微生物種類數(shù)量判別活性污泥的狀況。二、試驗原理據(jù)其種類和數(shù)量可判定活性污泥的活性。三、試驗裝置與設(shè)備顯微鏡?；钚晕勰?。取自污水處理廠曝氣池。l00mL四、試驗步驟肉眼觀看取曝氣他的混合液置于100ml性能(30min制片取活性污泥法曝氣池混合液一小滴，放在干凈的載玻片中心(如混合液中污泥較少，可加蓋玻片時應(yīng)使其中心已接觸到水滴后才放下，否則會在片內(nèi)形成氣泡，影響觀看。鏡檢在顯微鏡下低倍或高倍下觀看生物相。污泥茵膠團(tuán)絮絨體外形、大小、稠密度等。絲狀微生物伸出絮絨體外的多寡。微型動物微型動物的識別參閱教材。五、試驗結(jié)果列舉鏡檢的主要生物相，并繪制其生物圖。六、試驗結(jié)果爭論依據(jù)試驗觀看狀況，試對污水廠活性污泥質(zhì)量及運(yùn)行狀況作初步評價。試驗三 微生物細(xì)胞的計數(shù)一、試驗?zāi)康陌盐昭蛴嫈?shù)板的原理和使用方法；能嫻熟使用血球計數(shù)半對微生物細(xì)胞懸液進(jìn)展細(xì)胞計數(shù)。二、試驗原理血球計數(shù)板(圖3-1)是由一塊比一般玻片厚的特制玻片制成的。玻片中心刻有四條槽，中心兩條槽之間的平面比其他平面略低，中心有一小槽，槽的兩邊的平面上備刻有9個大方格，中間的一個大方格為計數(shù)室，它的長相寬各為1mm0.1mm0.1mm3。計數(shù)室有兩種規(guī)格：16254002516400(1)16x25細(xì)胞數(shù)／m1＝〔100/100〕x400xl0xl000x(2)25x16細(xì)胞數(shù)／m1＝〔80小格細(xì)胞數(shù)/80〕x400xl0xl000x三、試驗裝置與設(shè)備顯微鏡、血球計數(shù)板、移液管、酵母菌液。四、試驗步驟稀釋樣品。為了便于計數(shù)，將樣品適當(dāng)稀釋，使每格約含5個細(xì)胞。取干凈的血球計數(shù)板，用厚蓋玻片蓋住中心的計數(shù)室，用移液管吸取少許充分格勻的待測苗液于蓋玻片的邊緣，菌液則自行滲入計數(shù)室，靜置5—10min、下旋動細(xì)調(diào)整器，以便看到計數(shù)室內(nèi)不同深度的菌體?，F(xiàn)以16x25l0025x1680母菌只計格的上方及左方線上的酵母茵，或只計下方及右方線上的酵母菌。31m1五、試驗結(jié)果將試驗結(jié)果計入下表：重復(fù)試驗重復(fù)試驗45菌液濃度〔個/ml〕菌數(shù)123平均六、試驗結(jié)果爭論試驗四微生物純種分別及初步鑒定〔綜合性試驗〕一、試驗?zāi)康脑摼C合性試驗包括以下內(nèi)容：培育基的配制與高壓蒸汽滅菌：目的是讓學(xué)生建立微生物養(yǎng)分的概念，把握養(yǎng)分瓊脂培育基的制備方法和滅菌原理、方法，初步建立微生物試驗的“無菌操作觀念細(xì)菌純種分別、培育和接種技術(shù)：目的是讓學(xué)生把握從環(huán)境中分別微生物純種，把握純種菌種的培育接種技術(shù)〕進(jìn)一步樹立無菌觀念，學(xué)會無菌操作的試驗技術(shù)。細(xì)菌純種的菌體、菌落形態(tài)的觀看：目的是讓學(xué)生建立對細(xì)菌菌落的感性生疏，把握對細(xì)菌菌落形態(tài)的描述方法，并通過菌落特征初步對細(xì)菌進(jìn)展分類。微生物的染色：目的是讓學(xué)生把握細(xì)菌革蘭氏染色的原理及方法，對細(xì)菌進(jìn)展革蘭氏染色的陰陽性鑒定。過氧化氫酶的定性測定：通過此試驗對純種分別的細(xì)菌進(jìn)展過氧化氫酶的陰陽性判定，加深對細(xì)菌胞外酶催化生物化學(xué)反響的感性生疏。二、試驗裝置與設(shè)備培育基的配制與高壓蒸汽滅菌：(1)培育皿(直徑90mm)、試管、吸管、錐形瓶、燒杯(2)紗布、棉花、報紙、牛皮紙。pH10％HCl、10％NaOH。牛肉膏、蛋白胨、氯化納、瓊脂、蒸餾水。(5)高壓蒸汽滅菌器、烘箱、冰箱、電爐等。細(xì)菌純種分別、培育、接種技術(shù)、菌落觀看：(190cm)101ml210m11(2190mLl9mL5(3)接種環(huán)、酒精燈、恒溫箱。3.革蘭氏染色顯微鏡、香柏油(或液體石蠟)、二甲苯、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、酒精燈。草酸銨結(jié)晶紫染液、革氏碘液、95％乙醇、番紅染液。三、試驗步驟培育基的配制與高壓蒸汽滅菌：玻璃器皿的洗滌與包裝洗滌玻璃器皿在使用前必需洗滌干凈。培育皿、試管、錐形瓶等可用去污粉或肥然晾干或放入烘箱中烘干備用。包裝①培育皿由一底一蓋組成一套，按試驗所需的套數(shù)一起用皮紙包裝。l-1.5cm〔4—5cm30疊包裝紙包住移液管的尖端(圖4-1)，用左手將移液管壓緊，在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，紙條螺旋③試管和錐形瓶等的管日或瓶口均需用棉塞堵塞。棉塞不宜過松或過緊，以手提棉塞，管、瓶不掉下為準(zhǔn)。棉塞的2／3應(yīng)在管內(nèi)或瓶口內(nèi)，上端露出少許，以便拔塞。棉塞的大小及外形應(yīng)如圖4—2所示。待滅菌的試管和瓶子的口都要用牛皮紙包裹，并用線繩捆扎后存放在鐵絲簍內(nèi)(用紙包裹是為了避開滅菌時冷凝水淋濕棉塞)，以備滅菌。培育基的制備(1)步驟①配制溶液：取肯定容量的燒杯盛入定量無菌水，按培育基配方(見附錄三)逐一稱取各種成分，依次參加水中溶解，難溶的物質(zhì)，例如蛋白陳、肉膏等可加熱促進(jìn)溶解，待全部溶解后，加水補(bǔ)充加熱蒸發(fā)的水量。加熱對應(yīng)不斷攪拌以防原料在杯底燒焦。②調(diào)整PHPH試紙測定培育基溶液的pH。按要求以l0％Hcl10％NaoHPH。③過濾：用紗布、濾紙或棉花過濾均可。如培育基內(nèi)雜質(zhì)很少，可省略過濾。4-3基沾污管口或瓶口，避開浸濕棉塞引起雜菌污染)，裝入試管的培育基量1/4—1/3。⑤斜面培育基的制作：將裝有瓊脂培育基的已滅菌的試管趁熱取出，斜置于木棒(或橡皮管)上，使試管內(nèi)的培育基斜面長度為試管長度的l/3—1/24-4)。(2)養(yǎng)分瓊脂培育基的制備①培育基配方：牛肉膏0.75g，蛋白陳1.5g，0.75g，瓊脂3g，蒸餾水150mL，pH7.6。0.1MPa20min。②操作：300ml150m1足蒸發(fā)損失的水量。用10％NaOH調(diào)整pH7.6，本試驗省略過濾。將培育基分裝5250ml無菌水的制備250m190(99)ml518mm×180mm9mld．滅菌菌有些不同，它是用物理、化學(xué)因素殺死局部或全部微生物的養(yǎng)分細(xì)胞及一局部芽抱。滅菌的操作過程①使用前，先在滅菌鍋內(nèi)參加適量的水．然后把滅菌的物品放入鍋內(nèi)，蓋上鍋蓋，對稱地擰緊螺栓，以防漏氣。②在滅菌鍋底部加熱、同時翻開排氣閥、待自徘氣閥冒熱氣3—5min后關(guān)閉。至壓力表所示壓力升至所需壓力時開頭計時。通過調(diào)整熱源，而維持肯定的疙力。到達(dá)滅菌時間后，停頓加熱。③待鍋內(nèi)蒸汽全部排完后〔壓力表示零)，方可翻開排氣閥，翻開鍋蓋，取出滅菌物。力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培育基而發(fā)生污染。372細(xì)菌純種分別、培育、接種技術(shù)、菌落觀看：平板劃線分別法5010-15ml倒入無菌培育皿內(nèi)，使凝固成平板。時左手持培育皿，以中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋稍傾斜4-53048h觀看結(jié)果。接種斜面培育基接種前將桌面擦凈，將所需的物品整齊有序地放在桌上。將試管貼上標(biāo)簽，注明接種日期、接種人、組別、姓名等。點(diǎn)燃酒精燈。先將棉塞擰松動，以便接種時拔出。在火焰旁，右手持經(jīng)酒精燈滅菌冷卻的接種環(huán)(環(huán)以上但凡可能進(jìn)入試管的局部都應(yīng)灼燒)，同時左手持培育皿，以中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋稍傾斜，許菌種，將接種環(huán)停留在無菌范圍內(nèi)，放下平板，拿起待接種試管，用右手小指、無名指和燒掉。將挑取菌種的接種環(huán)伸入試管底部，在斜面上由底部向上劃曲線。抽出接種環(huán)管塞上棉塞并插在試管架上，最終再次燒紅接種環(huán)，則接種完畢，置于30℃恒溫箱中培育24-36h菌落形態(tài)特征的觀看由于微生物個體外表構(gòu)造、分裂方式、運(yùn)動力量、生理特性及產(chǎn)生色素的力量等各不相的菌落特征，可粗略區(qū)分是何種類型的微生物。應(yīng)留意菌落的外形、大小、外表構(gòu)造、邊緣構(gòu)造、菌叢高度、顏色、透亮度、氣味、粘滯性、質(zhì)地軟硬狀況、外表光滑與粗糙狀況等。通常，細(xì)菌菌落多為光滑型，潮濕，質(zhì)地軟、外表構(gòu)造特征很多，具各種顏色。但也有枯燥粗糙的，甚至呈霉?fàn)畹黄鸾q毛。酵母菌菌落呈圓形，大小接近細(xì)菌，外表光滑，質(zhì)地軟，顏色多為白色和紅色。放線菌的菌落硬度較大，枯燥致密，且與基質(zhì)結(jié)合嚴(yán)密，不易被針挑取。菌落外表呈粉狀或皺折，呈龜裂狀，具有各種顏色，且正面和反面顏色不同。霉菌菌落長成絨狀或棉狀，能集中生長，疏松，用接種環(huán)很易挑取。對微生物在斜面培育基上生長的特征進(jìn)展具體的觀看，觀看菌落生長旺盛程度、外形、顏色及光澤等。革蘭氏染色