生化分離技術(shù)

生化分離工程第二章生化分離技術(shù)破碎緩沖液一般為0.1-0.2mol/L，pH為7－8的磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液（與細胞內(nèi)環(huán)境相似）抗氧化劑：含二硫鍵的蛋白質(zhì)，細胞內(nèi)：高度還原；外界氧化環(huán)境。eg.二硫蘇糖醇DTT，2-巰基乙醇2-BME，半胱氨酸Cys、谷胱甘肽GSH（還原型）酶抑制劑：針對性添加，絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF、巰基蛋白酶抑制劑碘乙酸、金屬蛋白酶EDTA，etcPVP：植物組織的破碎過程化中常用聚乙烯吡咯烷酮PVP吸收酚類物質(zhì)（酚類物質(zhì)會與蛋白質(zhì)結(jié)合形成沉淀）細胞破碎（Celldisruption）細胞的結(jié)構(gòu)動物/植物和微生物：前者沒有細胞壁，只有脂質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成的柔軟的細胞膜，易于破碎細菌：革蘭氏陽性菌的細胞壁比陰性菌的細胞壁堅固Why？較難破碎。酵母或其他真菌：胞壁由葡聚糖、甘露聚糖等多糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，比革蘭氏陽性菌的胞壁厚G+：典型金黃色葡萄球菌，肽聚糖60-95%G-：典型E.Coli，肽聚糖10%不同類型細菌的細胞壁結(jié)構(gòu)成分：細胞壁組成G+G-肽聚糖60-95%10%磷壁酸有0類脂質(zhì)一般無約20%蛋白質(zhì)0較高酵母菌：由甘露聚糖、蛋白質(zhì)和葡聚糖組成的“三明治”結(jié)構(gòu)，其中葡聚糖主要維持細胞壁強度4.1細胞破碎技術(shù)細胞破碎的目的：使細胞壁和細胞膜受到不同程度的破壞（增大通透性）或破碎，釋放其中的目標產(chǎn)物機械法非機械法珠磨法、壓榨法高壓勻漿、超聲破碎、撞擊法固體剪切作用液體剪切作用1）酶溶法2）化學(xué)法3）物理法干燥處理溶胞作用超臨界細胞破碎1、機械方法破碎1）珠磨法（beadmilling）：細胞懸浮液與極小的研磨劑如玻璃小珠、石英砂等一起高速攪拌，細胞與研磨劑之間相互碰撞、剪切，使細胞達到某種程度破碎，釋放內(nèi)含物可采用間歇式或連續(xù)操作珠磨機增加裝珠量、延長破碎時間、提高轉(zhuǎn)速等手段可提高破碎率→總能耗增加且須注意換熱適用于多數(shù)微生物細胞，esp.有大量菌絲體的微生物（藻類和真菌菌絲）和質(zhì)地堅硬（亞細胞器）的微生物細胞2）高壓勻漿法

（high-pressurehomogenization

）破碎原理：利用高壓使懸浮液通過針形閥，從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細胞在受到高速撞擊后，急劇釋放到低壓環(huán)境破碎作用力：突然減壓和高速沖撞閥座閥撞擊環(huán)操作參數(shù)少且易于確定，實驗室及工業(yè)生產(chǎn)中均可適用于酵母和多數(shù)細胞的破碎對易造成堵塞的團狀或絲狀真菌及一些易損傷勻漿閥、質(zhì)地堅硬的亞細胞器一般不適用3）超聲波破碎（ultrasonication）機理：高于20kHz的超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用，空穴由于超聲波的沖擊而產(chǎn)生和閉合，產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。缺點：A、影響因素多，細胞種類、濃度和處理時間、探頭材料和形狀；B、有效能量的利用率低；C、產(chǎn)熱大，需控溫；D、不易放大，僅應(yīng)用于實驗室規(guī)模的細胞破碎。機械破碎法總結(jié)以上幾種機械破碎法的作用機理不盡相同，有各自的適用范圍（包括菌體細胞、細胞發(fā)酵液的特性）和處理規(guī)模（實驗室或工業(yè)用）方法珠磨高壓勻漿超聲破碎使用規(guī)模實驗室、工業(yè)用實驗室、工業(yè)用實驗室適用對象酵母、藻類及絲狀真菌酵母菌、細菌細菌2、細胞物理破碎方法1）滲透壓沖擊法（osmoticshock）最為溫和的一類細胞破碎方法，適用于易于破碎的細胞，eg.動物細胞和革蘭氏陰性菌。細胞于高滲介質(zhì)中？脫水達到平衡后，迅速將其轉(zhuǎn)置于低滲透壓的水或緩沖液中，水進入細胞使胞壁和胞膜破裂2）凍結(jié)－融化法（FreezingandThawing）細胞急劇凍結(jié)后在室溫緩慢融化，反復(fù)操作多次使細胞破壞，對于存在于細胞質(zhì)周圍靠近細胞膜的胞內(nèi)產(chǎn)物釋放較為有效3、化學(xué)法破碎用某些化學(xué)試劑溶解細胞壁或抽提細胞中某些組分酸堿、某些表面活性劑及脂溶性有機溶劑都可改變細胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇性地滲透出來→化學(xué)滲透法利用酸堿調(diào)pH；有機溶劑甲苯；表面活性劑十二烷基磺酸鈉、TritonX-100；螯合劑乙二胺四乙酸EDTA等優(yōu)點：細胞外型完整、碎片少、粘度低，料液易澄清A、價格昂貴，引起新的污染；B、一般只有有限的破碎，比機械破碎速度低、效率差，常需與機械法連用。4、生物法破碎原理：利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到部分或完全破壞后再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性溶菌酶lysozyme適用于G＋的細胞壁，若配合EDTA、TritonX-100則可有效作用于G－的胞壁；真核細胞需用不同的酶：酵母細胞需用葡聚糖酶或甘露聚糖酶；破壞植物細胞壁需用纖維素酶優(yōu)點：產(chǎn)品釋放的選擇性高、產(chǎn)品破壞少、對溫度及pH等外界條件要求低，不殘留細胞碎片等，不同的細胞壁結(jié)構(gòu)決定了需要不同的酶4、生物法破碎自溶：通過調(diào)節(jié)溫度、pH或添加有機溶劑等激活劑，誘使細胞產(chǎn)生溶解自身酶的方法溶菌酶是酶法溶胞中最常用的方法但其高成本和有限的適用性使該法不可能實現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用，esp.G-的酶溶更受到了限制5、超臨界細胞破碎技術(shù)超臨界流體：溫度和壓力處于臨界條件之上的流體，具有類似于氣體的性質(zhì)（低黏度）和類似于液體的高密度，具有較好的流動性能、傳質(zhì)性能和溶解性能利用超臨界CO2做介質(zhì)，高壓CO2易于滲透到細胞內(nèi)。突然降壓后，因細胞內(nèi)外較大的壓差使細胞急劇膨脹而發(fā)生破裂可破碎細胞壁較厚的細胞如酵母甚至對粘稠的酵母漿都有很好的破碎效果破碎方法的選擇選擇的一般原則A、提取產(chǎn)物在細胞質(zhì)內(nèi)，用機械法破碎B、提取產(chǎn)物在細胞膜附近，用化學(xué)法C、提取產(chǎn)物與細胞膜或細胞壁結(jié)合，可采用化學(xué)法和機械法結(jié)合的方法破碎過程中應(yīng)注意的問題A、多種破碎方法相結(jié)合可產(chǎn)生很大優(yōu)勢B、對下游分離技術(shù)的影響：破碎顆粒清除，產(chǎn)物分離純化C、在上游發(fā)酵階段，考慮到發(fā)酵過程和環(huán)境對破碎難易程度影響D、菌種的培育及改造，胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物沉淀分離法：

通過調(diào)整溶液的理化參數(shù)來改變?nèi)軇┖腿苜|(zhì)的能量平衡，產(chǎn)生沉淀，從而將生化成分從溶液中分離。具有濃縮和分離的雙重作用。在蛋白質(zhì)、酶、多肽、核酸和其他細胞組分的回收和分離中應(yīng)用的很多。鹽析沉淀法有機溶劑沉淀等電點沉淀法成鹽沉淀法高分子聚合物沉淀選擇性變性沉淀法二、鹽析沉淀法

鹽析法：

在高濃度中性鹽存在下，欲分離物質(zhì)在中性鹽水溶液中的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀。早在19世紀鹽析法就被用于從血液中分離蛋白質(zhì)，目前該方法仍廣泛用來回收或分離蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)。（一）基本原理

蛋白質(zhì)的溶解特性取決于其組成、構(gòu)象、周圍環(huán)境的物理化學(xué)性質(zhì)以及溶劑的可利用度。

這些性質(zhì)就本質(zhì)而言是水分子間的氫鍵和蛋白質(zhì)表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以易受溶液溫度、pH值、介電常數(shù)和離子強度等參數(shù)的影響。蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，表面：大部分是親水基團內(nèi)部：大部分是疏水基團蛋白質(zhì)呈穩(wěn)定的分散狀態(tài)兩性物質(zhì)，一定pH下表面帶有一定的電荷，靜電斥力作用使分子間相互排斥蛋白質(zhì)周圍的水分子有序排列，在表面形成水化膜，這一層能保護蛋白質(zhì)粒子避免因碰撞而聚沉。當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽時：低鹽--鹽溶(低鹽情況下，隨著中性鹽離子強度的增加，蛋白質(zhì)溶解度增大)高鹽--鹽析(高鹽濃度時，蛋白質(zhì)溶解度隨之減小)鹽離子部分中和蛋白質(zhì)的電性，使分子間排斥作用減弱中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，鹽離子在水中發(fā)生水化作用從而使蛋白質(zhì)脫去水化膜，暴露出疏水區(qū)域蛋白質(zhì)在水中的溶解度不僅與中性鹽離子的濃度有關(guān)，還與離子所帶電荷數(shù)有關(guān)，高價離子影響更顯著。通常用離子強度表示對鹽析的影響。（三）影響鹽析的各種因素

無機鹽的加入量蛋白質(zhì)的濃度溫度pH操作方式

6.鹽析法的優(yōu)缺點（1）優(yōu)點：①室溫下沉淀物在硫酸銨鹽析溶液中長時間放置不會失活，且無機鹽不容易引起蛋白質(zhì)變性失活；②非蛋白的雜質(zhì)很少被夾帶沉淀；③適用范圍廣，幾乎所有蛋白質(zhì)和酶都能采用④設(shè)備簡單，操作方便。（2）缺點：①沉淀物中含有大量鹽析劑②硫酸銨容易分解產(chǎn)生氨的惡臭味，產(chǎn)品不能直接用于醫(yī)藥上鹽析法可以作為初始的提取方法，再與多種精制手段結(jié)合起來，如采用超濾、凝膠色譜、透析等方法將無機鹽去除，就可制得高純度產(chǎn)品。二、有機溶劑沉淀法

在蛋白質(zhì)等生物大分子的水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑，能顯著降低蛋白質(zhì)等生物大分子的溶解度，使其沉淀析出。不同蛋白質(zhì)沉淀時所需有機溶劑的濃度不同，因此調(diào)節(jié)有機溶劑的濃度，可以使混合物中的蛋白質(zhì)分段析出，達到分離純化的目的。不僅適于蛋白質(zhì)的分離純化，還常用于酶、核酸、多糖等的分離純化。常用于生物大分子沉淀的有機溶劑：甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮等，其中乙醇是工業(yè)上最常用的（二）影響沉淀效果的因素

溫度pH濃度蛋白質(zhì)濃度5.有機溶劑沉淀法的優(yōu)缺點（1）優(yōu)點：①乙醇等有機溶劑易揮發(fā)除去，不會殘留于成品中，產(chǎn)品更純凈（不需要脫鹽處理）；②有機溶劑密度低，沉淀物與母液間的密度差較大，分離容易，適于用離心分離收集沉淀物。（2）缺點：①容易使蛋白質(zhì)變性，操作需要在低溫下進行，使用上有一定的局限；②采用大量有機溶劑，成本較高。為節(jié)省用量，通常將蛋白質(zhì)溶液適當(dāng)濃縮，并回收溶劑。③有機溶劑易燃易爆，工業(yè)生產(chǎn)上車間和設(shè)備都應(yīng)有防護措施。

1.等電點沉淀法兩性物質(zhì)在pH=pI時，分子表面凈電荷為零，分子間靜電排斥作用減弱，因此吸引力增大，能相互聚集，發(fā)生沉淀。不同的兩性物質(zhì)，pI不同，如不同蛋白質(zhì)。根據(jù)這一特性，用依次改變?nèi)芤簆H的方法可將不同的蛋白質(zhì)分別沉淀析出，達到分離純化的目的。H+OH-+++++++++++pH<pI,帶正電，有水膜，是穩(wěn)定的親水膠體_________pH>pI,帶負電，有水膜，是穩(wěn)定的親水膠體_+++++____pH=pI時,有水膜，是不穩(wěn)定的親水膠體中性鹽破壞水膜+++++++++++中性鹽破壞水膜_+++++____中性鹽破壞水膜_________中性鹽中和電荷SO42-中性鹽中和電荷NH4+或Na+蛋白質(zhì)的鹽析機制示意圖蛋白質(zhì)沉淀

只適用于水化程度不大、在pI時溶解度很低的兩性物質(zhì)，如酪蛋白。

對于親水性很強的兩性物質(zhì)，在pI及pI附近仍有