第7章2-HPLC儀器裝置

Chapter7第三節(jié)儀器裝置一、概述1.對(duì)分析型商品型儀器有兩種組合形式：1）完全緊湊的整體系統(tǒng)；2）獨(dú)立部件的組合系統(tǒng)。2、注意事項(xiàng)

4、柱外效應(yīng)3、知名廠商

島津、Waters、Agillent工作站界面－正常工作站界面－運(yùn)行工作站界面－出錯(cuò)儀器外觀與工作界面

溫度：10～30℃；相對(duì)濕度<80％；最好是恒溫、恒濕，遠(yuǎn)離高電磁干擾、高振動(dòng)設(shè)備，有良好的通風(fēng)設(shè)施。HPLC的日常操作條件高效液相色譜儀組成流動(dòng)相及貯液罐高壓輸液泵及梯度洗脫裝置進(jìn)樣裝置色譜柱檢測(cè)器餾分收集器數(shù)據(jù)處理及色譜工作站流動(dòng)相

泵色譜柱檢測(cè)器

泵液分離

檢測(cè)

記錄進(jìn)樣閥進(jìn)樣一、流動(dòng)相及貯液罐1.貯液罐1）材料應(yīng)耐腐蝕，常用材料為玻璃、不銹鋼或特種塑料（PEEK）。吸濾頭2）溶積約為0.5～2.0L。3）使用過(guò)程中應(yīng)密閉：以防溶劑蒸發(fā)引起流動(dòng)相組成變化；并防止空氣中的O2、CO2重新溶解于流動(dòng)相中。4）吸濾頭：多孔不銹鋼過(guò)濾器，孔徑0.45um。吸濾頭貯液罐故障：堵塞表現(xiàn)：管路中不斷有氣泡生成。措施：用5％稀硝酸，超聲波清洗，再用蒸餾水清洗5）流動(dòng)相需經(jīng)過(guò)0.45um濾膜過(guò)濾，以除去微小顆粒，尤其是使用緩沖液。2.流動(dòng)相脫氣流動(dòng)相中有溶解的氣體，在洗脫過(guò)程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡，從而影響檢測(cè)器的工作。1）低壓脫氣法使用水泵連接抽濾瓶和微孔玻璃漏斗，可完成脫氣和過(guò)濾的雙重任務(wù)。2）吹氦脫氣法將氦氣通入流動(dòng)相以驅(qū)除其中的空氣，適用于所有的溶劑。3）超聲波脫氣法將流動(dòng)相瓶置于超聲波清洗器中，以水為介質(zhì)超聲脫氣。4）真空脫氣法打開真空脫氣機(jī)的電源開關(guān)后，控制電路即開啟真空泵，真空泵運(yùn)行使真空箱內(nèi)產(chǎn)生部分真空。真空度由壓力傳感器測(cè)定。根據(jù)傳感器信號(hào)，真空脫氣機(jī)通過(guò)運(yùn)行或關(guān)閉真空泵來(lái)維持真空度流動(dòng)相

泵色譜柱檢測(cè)器

泵液分離

檢測(cè)

記錄進(jìn)樣閥進(jìn)樣儀器裝置二、高壓輸液泵及梯度洗脫裝置1.要求1）耐化學(xué)（酸、堿）腐蝕；2）輸出流量穩(wěn)定，重復(fù)性高；3）能在高壓下連續(xù)工作；5）易清洗、維修，具有梯度洗脫功能力。4）輸出流量范圍寬分析柱：0.1～10ml/min2.分類恒流泵恒壓泵注射泵往復(fù)柱塞泵液壓隔膜泵氣動(dòng)放大泵3.往復(fù)型泵1）原理2）優(yōu)點(diǎn)：體積小，流量調(diào)節(jié)方便，更換溶劑容易3）缺點(diǎn)：對(duì)加工制造有特殊要求：耐磨損輸出壓力有明顯的起伏脈動(dòng)。4）減小脈動(dòng)措施①采用多頭泵交替聯(lián)動(dòng)A雙柱塞并聯(lián)泵B雙柱塞串連泵②改進(jìn)驅(qū)動(dòng)凸輪的幾何性狀4.梯度洗脫問(wèn)題：樣品組成復(fù)雜，第一個(gè)組分的k’值和最后一個(gè)峰的k’值相差幾十倍至上百倍。解決：程序升溫？流量程序？在一個(gè)分析周期中，不斷改變流動(dòng)相的組成，先用洗脫能力弱的溶劑，然后不斷增加洗脫能力強(qiáng)的溶劑的組成，使各個(gè)組分能在最佳條件下得到洗脫。1）定義(gradientelution)：洗脫能力：溶劑A<溶劑B

梯度曲線：以梯度洗脫時(shí)間為橫坐標(biāo)，以流動(dòng)相中洗脫能力強(qiáng)的B的體積百分含量（B％）為縱坐標(biāo)時(shí)2）梯度洗脫性狀3）梯度陡度

B％的增加速度4）梯度洗脫中的溶劑選擇分離方法增加強(qiáng)洗脫劑反相色譜增加有機(jī)溶劑正相色譜增加極性離子對(duì)色譜減小反離子濃度減小極性離子交換增加鹽濃度增加pH（對(duì)堿）減小pH（對(duì)酸）分離方法增加強(qiáng)洗脫劑4）梯度洗脫中的溶劑選擇5）梯度洗脫裝置A、低壓梯度（泵前混合)B、高壓梯度（泵后混合)6）分離的重現(xiàn)性A、柱再生－復(fù)雜樣品如中藥在100％B結(jié)果并維持一定時(shí)間（2-5倍柱體積）每次分析結(jié)束后，快速自最終B％運(yùn)行一梯度至100％B并維持一段時(shí)間B、柱平衡每次梯度結(jié)束和下次進(jìn)樣之前用起始流動(dòng)相（5-10個(gè)柱體積）沖洗色譜柱達(dá)到兩相平衡。C、不準(zhǔn)確的梯度不同的儀器設(shè)備梯度準(zhǔn)確度有差異D、基線漂移A和B溶劑UV吸收不同造成；低波長(zhǎng)更為嚴(yán)重例1色譜柱Partisil－ODS(A)10％甲醇水溶液(B)1％乙酸溶液的甲醇溶液梯度程序：B以1.7％/min的速率增加三、進(jìn)樣裝置

高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對(duì)進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。1、注射器進(jìn)樣2.六通閥進(jìn)樣美國(guó)Rheodyne公司的六通閥進(jìn)樣器最為通用，各大HPLC儀器制造商均以此產(chǎn)品作為儀器的進(jìn)樣器。

開始分析廢液樣品

淋洗液

至分離柱進(jìn)樣閥樣品

裝樣

廢液淋洗液至分離柱

（ＬＯＡＤ）（ＩＮＪＥＣＴ）樣品環(huán)雖然六通閥進(jìn)樣器具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便、壽命長(zhǎng)、日常無(wú)需維修等特點(diǎn)，但正確的使用和維護(hù)將能增加使用壽命，保護(hù)周邊設(shè)備，同時(shí)增加分析準(zhǔn)確度。如使用得當(dāng)?shù)脑挘ㄩy進(jìn)樣器一般可連續(xù)進(jìn)樣3萬(wàn)次而無(wú)需維修。*手柄處于Load和Inject之間時(shí)，由于暫時(shí)堵住了流路，流路中壓力驟增，再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位，過(guò)高的壓力在柱頭上引起損壞，所以應(yīng)盡快轉(zhuǎn)動(dòng)閥，不能停留在中途。*在HPLC系統(tǒng)中使用的注射器針頭有別于氣相色譜，是平頭注射器。一方面，針頭外側(cè)緊貼進(jìn)樣器密封管內(nèi)側(cè)，密封性能好，不漏液，不引入空氣；另一方面，也防止了針頭刺壞密封組件及定子。1)部分裝液法:進(jìn)樣量最多為定量環(huán)體積的75％，并且要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同2)完全裝液法:

進(jìn)樣量最少為定量環(huán)體積的3至5倍，這樣才能完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，達(dá)到所要求的精密度及重現(xiàn)性。六通閥進(jìn)樣器的進(jìn)樣方式3.自動(dòng)進(jìn)樣器由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制定量閥，按預(yù)先編制注射樣品的操作程序工作，一次可進(jìn)行幾十個(gè)或上百個(gè)樣品的分析。四、色譜柱色譜柱保護(hù)與壽命的延長(zhǎng)：1)加保護(hù)柱；2)避免高壓沖擊；3)分離條件（pH，溫度）4)凈化樣品；5)用強(qiáng)溶劑（甲醇、乙腈）定期沖洗柱；6)若分析柱長(zhǎng)期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉；故障—壓力高有／無(wú)柱子時(shí)檢查壓力－許多壓力問(wèn)題是由于系統(tǒng)或保護(hù)柱的阻塞如果柱壓高:沖洗柱子排除柱污染和填料堵塞高分子量／被吸附化合物樣品或緩沖液中的沉淀物反沖柱子清潔阻塞的濾頭更換濾頭故障—峰拖尾原因解決方法1、篩板阻塞1、a、反沖色譜柱b、更換進(jìn)口篩板c、更換色譜柱2、色譜柱塌陷2、填充色譜柱3、流動(dòng)相pH選擇錯(cuò)誤3、調(diào)整pH值4、樣品與填料表面的硅羥基發(fā)生反應(yīng)4、a、加入離子對(duì)試劑或堿性揮發(fā)性修飾劑b、更改色譜柱故障—峰前延原因解決方法1、柱溫低1、升高柱溫2、樣品溶劑選擇不恰當(dāng)2、使用流動(dòng)相作為樣品溶劑3、樣品過(guò)載3、降低樣品含量4、色譜柱損壞故障—峰裂分原因解決方法1、保護(hù)柱或分析柱污染1、取下保護(hù)柱再進(jìn)行分析。如果必要更換保護(hù)柱。如果分析柱阻塞，拆下來(lái)清洗。如果問(wèn)題仍然存在，可能是柱子被強(qiáng)保留物質(zhì)污染，運(yùn)用適當(dāng)?shù)脑偕胧?。如果?wèn)題仍然存在，入口可能被阻塞，更換篩板或更換色譜柱。2、樣品溶劑不溶于流動(dòng)相2、改變樣品溶劑。如果可能采取流動(dòng)相作為樣品溶劑。3、色譜柱塌陷3、填充色譜柱故障—保留時(shí)間改變?cè)蚪鉀Q方法1、溫控不當(dāng)1、調(diào)好柱溫2、流動(dòng)相組分變化2、防止變化（蒸發(fā)、反應(yīng)等）3、色譜柱沒(méi)有平衡3、在每一次運(yùn)行之時(shí)間平衡色譜柱4、流速變化4、重新設(shè)定流速5、泵中有氣泡5、從泵中除去氣泡6、流動(dòng)相選擇不恰當(dāng)6、a、更換合適的流動(dòng)相b、選擇合適的混合流動(dòng)相餾分收集器 用微處理機(jī)控制，按預(yù)先規(guī)定好的程序，或按時(shí)間，或按色譜峰的起落信號(hào)逐一收集和