第三章電泳技術(shù)

第二章

電泳技術(shù)

electrophoresistechnology第一節(jié)概述一、電泳技術(shù)的概念在直流電場(chǎng)中，帶電粒子向與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis）。利用各種帶電粒子電泳速度不同，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離，然后對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量的分析方法稱為電泳分析法，也叫電泳技術(shù)。二、電泳技術(shù)的分類

電泳技術(shù)的分類方法有多種，可從分離目的、電場(chǎng)強(qiáng)度、電泳媒介、電泳裝置、緩沖液pH等不同角度進(jìn)行分類。（一）按照電場(chǎng)強(qiáng)度的不同，分為常壓電泳和高壓電泳常壓電泳的電場(chǎng)強(qiáng)度一般在2~10V/cm（電壓在500V以下）高壓電泳的電場(chǎng)強(qiáng)度一般在20~220V/cm（電壓在500V以上）

（二）按照電泳媒介不同（有無(wú)支持物），分為自由電泳和區(qū)帶電泳1．自由電泳自由電泳的媒介為溶液（不用支持物），帶電粒子在溶液中自由移動(dòng)，適用于生物細(xì)胞和生物大分子的電泳分離，如顯微電泳、等電聚焦電泳、密度梯度電泳等。2．區(qū)帶電泳媒介為支持介質(zhì)，被分離的物質(zhì)經(jīng)電泳后在支持介質(zhì)上形成區(qū)帶稱為區(qū)帶電泳。區(qū)帶電泳是目前應(yīng)用最廣泛的一種電泳技術(shù)，適用于蛋白質(zhì)、核酸等標(biāo)本的分離。區(qū)帶電泳根據(jù)支持介質(zhì)的不同又分為濾紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。（三）按照分離目的的不同，分為分析電泳和制備電泳。（四）按照支持物的裝置形式（電泳裝置）不同，分為水平電泳（支持物水平放置，最常用）和垂直電泳等。（五）按照緩沖液pH值是否均一分為連續(xù)pH電泳和不連續(xù)pH電泳。1．連續(xù)pH電泳支持介質(zhì)各處的pH相同，如濾紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳等。2．不連續(xù)pH電泳支持介質(zhì)各處的pH不同，聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳等。聚丙烯酰胺凝膠電泳連續(xù)pH電泳與不連續(xù)pH電泳的主要區(qū)別在于：不連續(xù)pH電泳有兩種不同孔徑的凝膠系統(tǒng)；電泳槽中及兩種凝膠中所用的緩沖液pH值不同；電泳過(guò)程中形成的電勢(shì)梯度也不均勻。而連續(xù)pH電泳在這三方面都是單一或是均勻的。三、電泳技術(shù)的特點(diǎn)1．凡是帶電物質(zhì)均可應(yīng)用某一電泳技術(shù)進(jìn)行分離，并可進(jìn)行定性或定量分析。2．分辨率高。3．可在常溫下進(jìn)行。4．樣品用量少。5．操作省時(shí)簡(jiǎn)便。6．設(shè)備簡(jiǎn)單。第二節(jié)

電泳技術(shù)的基本原理一、電泳遷移率在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下，帶電粒子的移動(dòng)速度稱為電泳遷移率（electrophoresismobility）。用μ表示電泳遷移率，v表示電泳速度（cm/s），E表示電場(chǎng)強(qiáng)度（V/cm），則：μ=v/E=cm2/(V·s)在電場(chǎng)中，推動(dòng)帶電粒子運(yùn)動(dòng)的力（F：電場(chǎng)力）等于粒子荷電量（Q）與電場(chǎng)強(qiáng)度（E）的乘積，即：F=QE帶電粒子的前移同樣要受到阻力（F’：摩擦力）的影響，對(duì)于一個(gè)球形質(zhì)點(diǎn)，服從Stoke定律，即：F’=6πrηv式中r為質(zhì)點(diǎn)半徑，η為介質(zhì)粘度系數(shù)，v為質(zhì)點(diǎn)移動(dòng)速度，當(dāng)質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中作穩(wěn)定運(yùn)動(dòng)時(shí)：F=F’，即QE=6πrηv，由此得出：v=EQ/(6π·r·η)將μ=v/E代入，得：μ=Q/(6π·r·η)（1）從上式可見(jiàn)，球形質(zhì)點(diǎn)的遷移率，首先取決于自身狀態(tài)，即與所帶電荷成正比，與其半徑及介質(zhì)粘度系數(shù)成反比。所以電泳遷移率是物質(zhì)的特征常數(shù)。表2-1血清蛋白等電點(diǎn)與電泳遷移率血清蛋白等電點(diǎn)電泳遷移率cm2/(V·s)分子量白蛋白4.845.9×10-569000α1-球蛋白5.065.1×10-5200000α2-球蛋白5.064.1×10-5300000β-球蛋白5.122.8×10-590000～150000γ-球蛋白6.85～7.301.0×10-5156000～300000二、影響電泳遷移率的因素影響電泳遷移率的外界因素還有以下幾種：（一）電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度也稱電勢(shì)梯度，是指單位長(zhǎng)度（每1cm）的電壓降（電位降）。常壓電泳的電場(chǎng)強(qiáng)度一般為2～10V/cm，高壓電泳的電場(chǎng)強(qiáng)度一般為20～200V/cm。常壓電泳多用于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，高壓電泳則用來(lái)分離氨基酸、小肽、核苷等小分子物質(zhì)。例如：以濾紙作支持物，其兩端浸入電極緩沖液中，電極緩沖液與濾紙交界面的紙長(zhǎng)20cm，測(cè)得的電壓降為200V，那么，電場(chǎng)強(qiáng)度為200V/20cm=10V/cm。（二）電泳緩沖液電泳緩沖液起著決定粒子電荷性質(zhì)和電荷量的作用，同時(shí)起導(dǎo)電作用，電泳時(shí)對(duì)緩沖液的化學(xué)組成、pH值和離子強(qiáng)度都有一定的要求。1．緩沖液的化學(xué)組成（緩沖溶質(zhì)）緩沖體系的組成常選用弱酸/弱酸鹽、酸式鹽/次級(jí)鹽。對(duì)緩沖液的要求是化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、電導(dǎo)率低、緩沖容量大、粒子移動(dòng)性好。按此要求，緩沖液的pH值確定后，第一，選擇緩沖液時(shí)要盡量選擇pKa接近緩沖液pH的弱酸成分，此時(shí)緩沖容量最大。第二，優(yōu)先選用離子價(jià)數(shù)為1價(jià)的電解質(zhì)，目的是保持離子的活度。第三，優(yōu)先選擇正、負(fù)離子移動(dòng)速度相近的電解質(zhì)，使電泳時(shí)離子分布均勻，保證電泳區(qū)帶的整齊。常用的緩沖液有巴比妥/巴比妥鈉、檸檬酸/檸檬酸鈉、NaH2PO4/Na2HPO4、Tris/HCL等。巴比妥/巴比妥鈉是血清蛋白電泳常用的電泳緩沖液。2．pH值溶液的pH值決定了帶電顆粒解離的程度，也決定了物質(zhì)所帶凈電荷的多少。因此當(dāng)分離某一蛋白質(zhì)混合物時(shí)，應(yīng)選擇一種能擴(kuò)大各種蛋白質(zhì)所帶電荷量差異的pH值，以利于各種蛋白質(zhì)的分離，當(dāng)然不能過(guò)酸過(guò)堿，以免引起蛋白質(zhì)變性。緩沖液的pH值一般設(shè)在4.5～9.0為宜。在電泳過(guò)程中，不僅標(biāo)本粒子在作定向運(yùn)動(dòng)，緩沖液中的各種離子也在作定向運(yùn)動(dòng)，當(dāng)它們移動(dòng)到兩極時(shí)，因?yàn)榘l(fā)生氧化還原反應(yīng)使緩沖液的pH值發(fā)生改變。以H+和OH-為例：正極：4OH--4e→2H2O+O2

負(fù)極：2H++2e→H2結(jié)果使正極pH值降低，負(fù)極pH值升高。為了使緩沖液的pH值保持一致，可在每次電泳后將兩個(gè)電泳槽中的緩沖液重新混合，或者將兩極交換。3．離子強(qiáng)度除了要求緩沖液具有合適的化學(xué)組成和pH值以外，還要求具有一定的導(dǎo)電能力。緩沖液的導(dǎo)電能力可用離子強(qiáng)度表示。在稀溶液中離子強(qiáng)度可用下式計(jì)算：I=ΣCiZi2/2I：離子強(qiáng)度，Ci：離子的濃度，Zi：離子的價(jià)數(shù)，Σ代表累加。例：求0.015MNa2SO4溶液的離子強(qiáng)度：I=（0.015×2×12+0.015×22）/2=0.045（mol/L）緩沖液的離子強(qiáng)度影響緩沖容量、產(chǎn)熱效應(yīng)和電泳速度。離子強(qiáng)度大，緩沖容量大，pH值穩(wěn)定；但離子強(qiáng)度大，電泳速度慢；同時(shí)離子強(qiáng)度大，電流強(qiáng)度大，產(chǎn)熱多，蒸發(fā)快。速度慢，會(huì)導(dǎo)致時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，標(biāo)本擴(kuò)散。速度快，導(dǎo)致區(qū)帶不整齊，分辨率低。綜合考慮，離子強(qiáng)度最好選在0.02～0.2mol/L之間。（三）支持介質(zhì)支持介質(zhì)對(duì)電泳的影響主要表現(xiàn)為電滲作用和吸附作用。1．電滲作用液體在電場(chǎng)中對(duì)于一個(gè)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)，稱為電滲作用。在電泳時(shí)應(yīng)盡量避免使用具有高電滲作用的支持物。2．吸附作用支持介質(zhì)的表面對(duì)被分離的物質(zhì)具有一定的吸附作用，使被分離樣品滯留而降低電泳速度，造成樣品拖尾，使電泳的分辨率降低。電泳時(shí)，要選擇吸附作用小的支持介質(zhì)。（四）溫度電泳過(guò)程中由于通電產(chǎn)生焦耳熱，熱對(duì)電泳有很大影響。溫度每升高1℃，遷移率約增加2.4%。為降低熱效應(yīng)對(duì)電泳的影響，可控制電壓或電流，或安裝冷卻散熱裝置。（五）分子的性質(zhì)和形狀（六）蒸發(fā)第三節(jié)電泳儀電泳儀是進(jìn)行電泳分析的儀器主要由電源和電泳槽兩部分組成一、電源電源是產(chǎn)生電泳電場(chǎng)的裝置，常為可調(diào)式直流電源。一般都用交流電源經(jīng)過(guò)整流、濾波后獲得，主要部分是一個(gè)整流器，可用晶體管、電子管或可控硅整流。多數(shù)裝有穩(wěn)壓裝置，用電壓表和電流表指示輸出電壓及電流的大小。二、電泳槽電泳槽是用來(lái)盛裝緩沖液和進(jìn)行電泳的場(chǎng)所，多用透明塑料膜壓或用有機(jī)玻璃膠合而成。電泳槽外形有水平式、垂直式和圓盤(pán)式等多種，其中水平式電泳槽一般由電極、緩沖液槽、電泳介質(zhì)支架和一個(gè)透明的絕緣蓋等幾部分組成。電極分別裝在兩個(gè)緩沖液槽內(nèi)。電極應(yīng)具有良好的導(dǎo)電性、抗腐蝕性和抗電解作用，常用鉑絲或鎳鉻合金絲等材料。支持介質(zhì)放在兩個(gè)支架上，其兩端與電泳液接通而形成鹽橋。通電后，電流只能在支持介質(zhì)體上通過(guò)，電泳物質(zhì)在其上泳動(dòng)。絕緣蓋起防止緩沖液蒸發(fā)以及防觸電的保護(hù)作用。有些電泳槽有冷卻裝置以保證電泳介質(zhì)的溫度不至過(guò)高。電泳操作一般有支持介質(zhì)的制備或飽和，加樣，電泳分離樣品、染色及洗脫比色或光密度掃描定量等步驟。第四節(jié)

幾種常用電泳技術(shù)一、醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜電泳（celluloseacetateelectrophoresis,CAE）是以醋酸纖維素薄膜作為支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)。醋酸纖維素薄膜是將纖維素的羥基乙?；纬衫w維素醋酸酯，然后將其溶于有機(jī)溶劑后涂抹成均勻的薄膜，干燥后就成為醋酸纖維素薄膜。（一）優(yōu)點(diǎn)1．吸附作用和電滲作用都很小2．分離速度快3．分離區(qū)帶清晰，分辨率高4．樣品用量少5．操作簡(jiǎn)便6．易定量、可長(zhǎng)期保存（二）缺點(diǎn)1．薄膜吸水性差2．分辨率比聚丙烯酰胺凝膠電泳低3．不適于制備（三）操作步驟處理膜→點(diǎn)樣→電泳→染色→漂洗→透明→測(cè)定吸光度

（四）電泳結(jié)果不滿意或失敗的可能原因1．醋酸纖維素薄膜（1）薄膜過(guò)分干燥出現(xiàn)白斑（薄膜未完全浸透或溫度過(guò)高致膜局部干燥或水分蒸發(fā)）（2）薄膜位置歪斜、彎曲，與電流方向不平行（3）表面緩沖液過(guò)多（薄膜過(guò)濕）（4）薄膜質(zhì)量不高2．緩沖溶液（1）濃度過(guò)高（2）使用次數(shù)太多，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而改變濃度或變質(zhì)（3）薄膜與緩沖液接觸不良3.樣品與點(diǎn)樣（1）點(diǎn)樣量過(guò)多（2）點(diǎn)樣不均勻，不整齊，樣品觸及薄膜邊緣（3）起始位置錯(cuò)誤（4）樣品不新鮮4．電泳（1）時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短（2）電泳槽密閉性不好（3）溫度過(guò)高（4）電流太大5．染色和透明（1）染色液連續(xù)使用次數(shù)過(guò)多，pH值改變（2）薄膜未完全干燥時(shí)進(jìn)行透明處理（五）應(yīng)用醋酸纖維素薄膜電泳已廣泛用于各種生物分子的分離分析中，如血紅蛋白、血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、同工酶及類固醇等的分離和測(cè)定。正常人血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳示意圖

二、瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳（agarosegelelectrophoresis,AGE）是以瓊脂糖凝膠作為支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)。瓊脂糖凝膠電泳的吸附作用和電滲作用均較小，分辨率和重現(xiàn)性較好，電泳圖譜清晰，電泳速度快，區(qū)帶易染色、洗脫和定量，常用于生物大分子如：血漿脂蛋白、免疫球蛋白、同工酶和DNA酶切片段的分離。三、聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)。這種凝膠電泳的主要特點(diǎn)是凝膠具有電泳和分子篩的雙重作用，大大提高了分辨能力。聚丙烯酰胺凝膠電泳能精細(xì)分離各種蛋白質(zhì)，還可測(cè)定蛋白質(zhì)和核酸的分子量，進(jìn)行核酸的序列分析等，特別在基因變異或同工酶的研究中應(yīng)用廣泛。（一）聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)

1．具有分子篩作用，分離效果好。2．設(shè)備簡(jiǎn)單，樣品用量少（1～100微克），不易擴(kuò)散，分辨率高。3．不帶電荷，幾乎沒(méi)有電滲作用。4．可通過(guò)控制凝膠濃度來(lái)調(diào)節(jié)凝膠的孔徑，以適合不同分子量樣品的分離。5．化學(xué)穩(wěn)定性好，由于分子結(jié)構(gòu)中富含酰胺基，聚丙烯酰胺凝膠是一種穩(wěn)定的親水膠體。6．機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，無(wú)色透明，易觀察，可用檢測(cè)儀直接測(cè)定。不足之處是聚丙烯酰胺凝膠單體對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)及皮膚有毒性作用，但聚合后就沒(méi)有毒性了。（二）聚丙烯酰胺凝膠的聚合聚丙烯酰胺是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺通過(guò)化學(xué)聚合或光聚合反應(yīng)而形成的大分子。聚合時(shí)，丙烯酰胺（CH2＝CH－CO－NH2）的雙鍵打開(kāi)，通過(guò)加成反應(yīng)形成含有酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長(zhǎng)鏈，相鄰的兩條鏈通過(guò)甲叉雙丙烯酰胺以亞甲基橋方式交聯(lián)起來(lái)，形成具有三維結(jié)構(gòu)的多聚物。過(guò)硫酸銨－四甲基乙二胺（TEMED）為化學(xué)催化系統(tǒng)。當(dāng)在丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的溶液中加入這種催化系統(tǒng)后，過(guò)硫酸銨作為引發(fā)劑提供自由基，通過(guò)自由基傳遞，形成丙烯酰胺自由基從而引發(fā)聚合反應(yīng)。四甲基乙二胺作為加速劑，可加快引發(fā)劑釋放自由基的速度，具體反應(yīng)為過(guò)硫酸銨在溶液中形成過(guò)硫酸自由基（SO4?–），該自由基可激活加速劑，加速劑作為電子載體提供一個(gè)未配對(duì)電子將丙烯酰胺單體轉(zhuǎn)化為丙烯酰胺自由基，經(jīng)反應(yīng)多聚物聚合成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。聚合的速度與溫度成正比，如溫度過(guò)低，或體系中有氧分子及不純物質(zhì)都會(huì)延緩凝膠的聚合。為了防止溶液氣泡中含有氧分子而妨礙聚合，在聚合前最好先將溶液分別抽氣除氧，再混合配制。核黃素－TEMED為光催化系統(tǒng)，在光照下部分核黃素被還原成無(wú)色核黃素，在有痕量氧存在的條件下，無(wú)色核黃素再被氧化為帶有自由基的核黃素，從而引發(fā)聚合反應(yīng)，在此系統(tǒng)中，核黃素是引發(fā)劑，四甲基乙二胺是加速劑。（三）聚丙烯酰胺凝膠孔徑和機(jī)械強(qiáng)度的調(diào)節(jié)

聚丙烯酰胺凝膠的孔徑、機(jī)械強(qiáng)度、彈性和透明度都與凝膠總濃度（T）和交聯(lián)度（C）有關(guān)。T表示每100ml凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)（g/dl）。C則表示凝膠溶液中交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)劑總克數(shù)的百分比。凝膠的孔徑主要由T決定，也與C有關(guān)。T值越大，凝膠孔徑越小。當(dāng)T值固定不變，C值在5%時(shí)，凝膠孔徑最小，大于或小于5%時(shí)凝膠的孔徑都會(huì)增大。在電泳中凝膠的孔徑是一個(gè)重要因素，往往會(huì)對(duì)分離效果起決定作用。常用于分離血漿蛋白的聚丙烯酰胺凝膠是標(biāo)準(zhǔn)凝膠，T為7.5g/dl，孔徑大約為5nm，適用于分子量104～106的蛋白質(zhì)的分離。在科研工作中，一般是先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以選出最適的凝膠濃度。凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、彈性和透明度主要取決于T及單體與交聯(lián)劑的比值。通常T值越大，機(jī)械強(qiáng)度越強(qiáng)，其中單體與交聯(lián)劑的比值尤為重要。實(shí)驗(yàn)表明，T<2.5g/dl，不能成膠；T<5g/dl，凝膠成膠胨狀；T>15g/dl，凝膠的硬度、脆性增加，易于折斷。單體與交聯(lián)劑的比值小于10，交聯(lián)度過(guò)大，凝膠堅(jiān)硬易碎，顏色乳白不透明；單體與交聯(lián)劑的比值大于100，凝膠又過(guò)軟，難以成形。一般T為5～10g/dl，單體與交聯(lián)劑的比值為20～40，可制得彈性較好，軟硬適中，無(wú)色透明的凝膠。（四）聚丙烯酰胺凝膠電泳的分類

1．根據(jù)凝膠的形狀不同，聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為圓柱型電泳和平板型電泳兩類。圓柱型電泳所形成的區(qū)帶呈圓盤(pán)狀，又稱為盤(pán)狀電泳。平板型電泳又可分為水平式和垂直式兩類。2．根據(jù)凝膠濃度和緩沖液pH值是否相同分為連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳和不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳。（1）連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳：整個(gè)電泳系統(tǒng)中,凝膠濃度和緩沖液pH值均相同。（2）不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳：電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上不同的凝膠濃度和緩沖液pH。不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離中包括了三種物理效應(yīng)：樣品的濃縮效應(yīng)、電泳分離的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，應(yīng)用廣泛。而連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳則不具備濃縮效應(yīng)。（五）不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠圓盤(pán)電泳一般在內(nèi)徑為0.7厘米，長(zhǎng)10厘米的小玻璃管內(nèi)，把三種性質(zhì)不完全一樣的聚丙烯酰胺凝膠重疊起來(lái)：樣品膠在最上層，濃縮膠在中層，分離膠在最下層。其中樣品膠和濃縮膠的緩沖液、pH值和孔徑大小完全一樣，區(qū)別是樣品膠中有樣品，而濃縮膠中沒(méi)有樣品。分離膠的孔徑一般比前兩種小，pH值也不相同。不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的電泳器示意圖

表2-2血清蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳的條件

凝膠總濃度交聯(lián)劑百分比Tris-HCl緩沖液凝膠孔徑主要效應(yīng)

T（%）C（%）pH樣品膠3206.7大（含有樣品）濃縮膠3206.7大濃縮效應(yīng)分離膠72.58.9小電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)電極緩沖液使用pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液。不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳具有下列三種效應(yīng)。1．樣品的濃縮效應(yīng)2．電荷效應(yīng)3．分子篩效應(yīng)（六）操作步驟安裝設(shè)備→配制凝膠（包括配制溶液、制備凝膠、緩沖液）→電泳→染色→電解脫色四、等電聚焦電泳等電聚焦電泳（isoelectricfocusingelectrophoresis,IEF）是20世紀(jì)60年代中期問(wèn)世的一種利用具有pH梯度的兩性電解質(zhì)為載體，分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)等兩性分子的電泳技術(shù)。等電聚焦電泳與其他電泳技術(shù)相比具有更高的分辨率，等電點(diǎn)僅相差0.01pH的蛋白質(zhì)即可分開(kāi)，因此特別適合于分離分子量相近而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)組分，同時(shí)也可用于確定被分離物質(zhì)的等電點(diǎn)。（一）基本原理在IEF電泳系統(tǒng)中，具有一個(gè)從陽(yáng)極到陰極，pH逐漸增大的連續(xù)而穩(wěn)定的pH梯度，處于此體系的各種蛋白質(zhì)分子將根據(jù)各自的等電點(diǎn)與所處位點(diǎn)pH的差別分別帶有正電荷或負(fù)電荷，從而向相反電極泳動(dòng)，最后停止在與其等電點(diǎn)相等的pH位點(diǎn)上，此時(shí)凈電荷為零，這一過(guò)程稱為聚焦。因此，將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)混合物加入具有pH梯度的介質(zhì)中，在電場(chǎng)中經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，各組分就分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的pH位置上，形成一系列分離蛋白質(zhì)的區(qū)帶。（二）pH梯度的形成pH梯度的建立是在電泳管正負(fù)極間引入等電點(diǎn)彼此接近的一系列兩性電解質(zhì)的混合物，在正極端引入強(qiáng)酸溶液（如硫酸或磷酸），在負(fù)極端引入強(qiáng)堿溶液（如氫氧化鈉）。電泳開(kāi)始前各段介質(zhì)的pH相等；電泳開(kāi)始后，由于各組分的等電點(diǎn)不同，從而形成由正極到負(fù)極，pH由低到高的線性pH梯度。（三）兩性電解質(zhì)載體和支持介質(zhì)理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)是：第一、在兩個(gè)pH之間易于形成pH線性梯度。第二、各組分在等電點(diǎn)處有足夠的緩沖能力，以保證電泳時(shí)支持介質(zhì)各區(qū)域pH穩(wěn)定，維持pH梯度。第三、各組分電導(dǎo)率接近，以保持支持介質(zhì)各區(qū)域電場(chǎng)強(qiáng)度均勻。第四、在280nm無(wú)光吸收，以便于對(duì)蛋白質(zhì)組分進(jìn)行定性、定量檢測(cè)。第五、分子量要小，易于應(yīng)用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質(zhì)分開(kāi)，并且不應(yīng)與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)或使之變性。目前常用的兩性電解質(zhì)載體是兩性電解質(zhì)混合物，由不飽和酸（如丙烯酸）和多烯多胺（如五乙烯六胺）聚合而成的各種多羧基脂肪多胺，分子量范圍在300～800。根據(jù)分子中羧基/氨基比例不同，等電點(diǎn)也不同，等電點(diǎn)范圍在3～10.5之間。常用的支持介質(zhì)有聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等，其中聚丙烯酰胺凝膠最為常用。（四）優(yōu)點(diǎn)1．分辨率很高，可把等電點(diǎn)相差0.01pH的蛋白質(zhì)分開(kāi)?？蓪⒀宓鞍追蛛x為50多條區(qū)帶。2．樣品可以混入凝膠中或加在任何位置，在電場(chǎng)中隨著電泳的進(jìn)行區(qū)帶會(huì)越來(lái)越窄，克服了一般電泳的擴(kuò)散作用，即區(qū)帶清晰無(wú)拖尾。3．分離速度快，蛋白質(zhì)可保持原有生物活性。4．電泳結(jié)束后，可直接測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。五、毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳（capillaryelectrophoresis,CE）是上一世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一類快速高效電泳技術(shù)。毛細(xì)管電泳將電泳載體移到毛細(xì)管中，克服了傳統(tǒng)電泳技術(shù)的樣品擴(kuò)散和熱擴(kuò)散的缺陷，大大提高了分析靈敏度，具有選擇性好、分辨率高、微量、定量準(zhǔn)確、易自動(dòng)化等特點(diǎn)。毛細(xì)管電泳按分離模式分為毛細(xì)管區(qū)帶電泳、凝膠電泳、等點(diǎn)聚焦電泳、等速電泳和膠束電動(dòng)力學(xué)毛細(xì)管色譜等。其中毛細(xì)管區(qū)帶電泳應(yīng)用作為廣泛。毛細(xì)管區(qū)帶電泳是近些年發(fā)展起來(lái)的一種快速高效的液相分離分析技術(shù)，是以具有pH緩沖能力的電解質(zhì)溶液為載體，以毛細(xì)管為分離室的一種高壓區(qū)帶電泳。具有操作簡(jiǎn)便、易自動(dòng)化、耗費(fèi)低等特點(diǎn)。主要用于蛋白質(zhì)的分離和檢測(cè)、藥物的分離和檢測(cè)等。（一）基本原理毛細(xì)管電泳除具有一般的電泳遷移外，還受電滲的影響。毛細(xì)管表面因基團(tuán)電離而帶負(fù)電荷，與溶液中陽(yáng)離子形成停滯的雙電層。部分陽(yáng)離子會(huì)擴(kuò)散到運(yùn)動(dòng)著的雙電層，因溶劑化而帶著溶劑向負(fù)極流動(dòng)形成電滲。當(dāng)毛細(xì)管的半徑大于雙電層厚度的7倍時(shí)，毛細(xì)管中的電滲就形成平流。試樣引入后，正離子遷移方向與電滲方向一致，所以正離子在毛細(xì)管內(nèi)的遷移速度加快。負(fù)離子遷移方向與電滲方向相反。離子的遷移方向和速度，決定于泳動(dòng)速度和電滲作用大小。由于電滲流一般遠(yuǎn)大于泳動(dòng)流速，因此在毛細(xì)管中，負(fù)離子也總是向負(fù)極移動(dòng)。中性粒子的泳動(dòng)速度為零，所以中性粒子也隨電滲而行。以中性粒子的速度可以測(cè)定電滲作用。因此。在毛細(xì)管電泳中，所有的離子性和非離子性溶質(zhì)都被電滲攜帶而向負(fù)極運(yùn)動(dòng)，對(duì)加了電壓后毛細(xì)管流體的研究表明，液體在毛細(xì)管中的流動(dòng)呈扁平型的“塞子流”，這種流型導(dǎo)致了毛細(xì)管的高效分離。即，分離的原因：電泳遷移，電滲遷移。電泳遷移：在高壓電場(chǎng)下，帶電離子向相反的方向移動(dòng)。電滲遷移：當(dāng)毛細(xì)管內(nèi)充滿緩沖溶液時(shí)，毛細(xì)管壁上的硅羥基發(fā)生解離，生成氫離子溶解在溶液中，這樣就使毛細(xì)管壁帶上負(fù)電荷與溶液形成雙電層，在毛細(xì)管的兩端加上直流電場(chǎng)后，帶正電的溶液就會(huì)整體的向負(fù)極端移動(dòng)，這就形成了電滲流。在操作緩沖溶液中，帶電粒子的運(yùn)動(dòng)速度等于電泳速度和電滲速度的矢量和，電滲速度一般大于電泳速度，因此即使是陰離子也會(huì)從陽(yáng)極端流向陰極端。（二）儀器裝置主要由以下幾個(gè)基本部分組成：1．兩個(gè)電極槽2．石英毛細(xì)管分別浸在兩個(gè)電極槽中，里面充滿與電極槽相同的液體3．直流高壓電源4．檢測(cè)器在毛細(xì)管的一端安裝有熒光、紫外、質(zhì)譜、電位等檢測(cè)器。

毛細(xì)管電泳儀裝置示意圖（三）分離模式

毛細(xì)管電泳的分離模式有以下幾種。1.毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）將待分析溶液引入毛細(xì)管進(jìn)樣一端，施加直流電壓后，各組分按各自的電泳流和電滲流的矢量和流向毛細(xì)管出口端，按陽(yáng)離子、中性粒子和陰離子及其電荷大小的順序通過(guò)檢測(cè)器。中性組分彼此不能分離。出峰時(shí)間稱為遷移時(shí)間（tm），相當(dāng)于高效液相色譜和氣相色譜中的保留時(shí)間。2.毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）在毛細(xì)管中裝入單體和引發(fā)劑引發(fā)聚合反應(yīng)生成凝膠，這種方法主要用于分析蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子。另外還可以利用聚合物溶液，如葡聚糖等的篩分作用進(jìn)行分析，稱為毛細(xì)管無(wú)膠篩分。有時(shí)將它們統(tǒng)稱為毛細(xì)管篩分電泳，下分為凝膠電泳和無(wú)膠篩分兩類。3.毛細(xì)管等速電泳（CITP）采用前導(dǎo)電解質(zhì)和尾隨電解質(zhì)，在毛細(xì)管中充入前導(dǎo)電解質(zhì)后，進(jìn)樣，電極槽中換用尾隨電解質(zhì)進(jìn)行電泳分析，帶不同電荷的組分遷移至各個(gè)狹窄的區(qū)帶，然后依次通過(guò)檢測(cè)器。4.毛細(xì)管等電聚焦電泳（CIEF）將毛細(xì)管內(nèi)壁涂覆聚合物減小電滲流，再將樣品和兩性電解質(zhì)混合進(jìn)樣，兩個(gè)電極槽中分別加入酸液和堿液，施加電壓后毛細(xì)管中的操作電解質(zhì)溶液逐漸形成pH梯度，各溶質(zhì)在毛