儀器分析色譜法

2023/1/31第十二章

色譜分析基礎

公共衛(wèi)生學院環(huán)境科學系曹建明一、色譜法概述

generalizationof

chromatographanalysis

二、色譜法的分類classificationofchromatograph

三、氣相色譜分離過程separationprocessofgaschromatograph

fundamentalofchromatographanalysis

2023/1/312023/1/31一、概述色譜法是一種分離技術。

混合物最有效的分離、分析方法。

俄國植物學家茨維特在1906年分離植物葉的色素使用的裝置。色譜原型裝置，如圖。玻璃管碳酸鈣石油醚2023/1/31流動相：幾個概念色譜柱：玻璃柱固定相：管內(nèi)固定、起分離作用的填充物攜帶試樣混合物流經(jīng)固定相的流體（氣體或液體）2023/1/31色譜法(chromatography)

流動相攜帶樣品流過固定相,試樣組分在固定相和流動相間的吸附、溶解、分配、離子交換或其他親和作用的能力不同,樣品分離------色譜法2023/1/31特點

靈敏快速高效2023/1/31二、色譜法分類

（classification

of

chromatograph

）氣相色譜法（gaschromatography）

液相色譜法（liquidchromatography）１、按兩相所處的狀態(tài)分類

氣固色譜法液固色譜法

氣液色譜法液液色譜法2023/1/31氣相色譜的結構流程圖2023/1/31高效液相色譜的結構流程圖

2023/1/31２、按操作形式不同分類

1.柱色譜法2.薄層色譜法3.紙色譜法2023/1/311.柱色譜法(columnchromatography)

固定相裝在金屬或玻璃柱中或是將固定相附著在毛細管內(nèi)壁上做成色譜柱。2023/1/312.薄層色譜法

(thin-layerchromatography,TLC)

固定相涂布在平板上形成薄層，把試樣點在薄板上，然后用溶劑展開，根據(jù)薄板上斑點位置及大小進行定性和定量分析。2023/1/313.紙色譜法（paperchromatography）紙色譜法是把試樣點在濾紙上，然后用溶劑展開，根據(jù)薄板上斑點位置及大小進行定性和定量分析。2023/1/313、按分離原理分類按色譜法分離所依據(jù)的物理或物理化學性質(zhì)的不同，又可將其分為：1.吸附色譜法2.分配色譜法3.離子交換色譜法4.尺寸排阻色譜法5.親和色譜法2023/1/311.吸附色譜法

(adsorptionchromatography)

利用吸附劑對不同組分吸附能力的不同2023/1/312.分配色譜法

(partitionchromatography)

利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)（或溶解度）不同2023/1/313.離子交換色譜法

（ion-exchangechromatography

利用組分在離子交換劑（固定相）上的離子交換力大小不同2023/1/314.尺寸排阻色譜法

(sizeexchangechromatography）

利用分子大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透2023/1/315.親和色譜法

(affinitychromatography)

利用生物分子間高專屬性親和力的進行分離的技術稱為親和色譜法

抗原和抗體、酶和底物激素和受體、RNA和其互補的DNA2023/1/31三、色譜分離過程

separationprocessofgaschromatograph1、色譜分離過程

該過程主要利用試樣中各組分在固定相和流動相間具有不同的溶解、吸附、分配、離子交換或其他親和作用的能力差異從而按先后不同的次序從固定相中流出2023/1/31色譜流出曲線

混合組分的分離過程及檢測器對各組份在不同階段的響應2023/1/31色譜分離流出曲線2023/1/312、色譜流出曲線與術語1.基線

無試樣通過檢測器時，檢測到的信號即為基線。2.保留值

（1）時間表示的保留值

保留時間（tR）：組分從進樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時所需的時間；死時間（tM）：不與固定相作用的氣體（如空氣）的保留時間；

調(diào)整保留時間（tR

＇）：tR＇=tR－tM

2023/1/31（2）用體積表示的保留值

保留體積（VR）：

VR=tR×F0F0為柱出口處的載氣流量，單位：mL/min。

死體積（VM）：

VM=tM×F0

調(diào)整保留體積(VR＇)：

V

R＇=VR－VM

2023/1/313.相對保留值r21組分2與組分1調(diào)整保留值之比：

r21=t′R2

/t′R1=V′R2/V′R1

相對保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關，與其他色譜操作條件無關，它表示了固定相對這兩種組分的選擇性。2023/1/314.區(qū)域?qū)挾?/p>

用來衡量色譜峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：（1）標準偏差()：即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。（2）半峰寬(Y1/2)：色譜峰高一半處的寬度Y1/2=2.354（3）峰底寬(Wb)：Wb=42023/1/31

色譜流出曲線的意義：

色譜保留值——定性依據(jù)色譜峰高或面積——定量依據(jù)色譜峰數(shù)——樣品中單組份的最少個數(shù)色譜保留值或區(qū)域?qū)挾?/p>

——色譜柱分離效能評價指標色譜峰間距

——固定相或流動相選擇是否合適的依據(jù)2023/1/31苯系物標準氣相色譜圖

1－苯；2－甲苯；3—乙苯；4－對二甲苯；5－間二甲苯；

6－鄰二甲苯；7－異丙苯；8－苯乙烯

2023/1/31真人頭馬特級色譜圖假人頭馬特級色譜圖2023/1/312.分配系數(shù)（partionfactor）K

組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的濃度（單位：g/mL）比，稱為分配系數(shù)，用K表示，即：分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。2023/1/31分配系數(shù)K的討論

一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；試樣一定時，K主要取決于固定相性質(zhì)；每個組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎；某組分的K=0時，即不被固定相保留，最先流出。2023/1/313.分配比（partionradio）k

在實際工作中，也常用分配比來表征色譜分配平衡過程。分配比是指，在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的質(zhì)量比：

1.分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學性質(zhì)有關的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。2.分配系數(shù)與分配比都是衡量色譜柱對組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時間越長。3.分配比可以由實驗測得。分配比也稱：容量因子(capacityfactor)；容量比(capacityfactor)；2023/1/314.容量因子與分配系數(shù)的關系

容量因子越大，保留時間越長。

VM為流動相體積，即柱內(nèi)固定相顆粒間的空隙體積；

VS為固定相體積，對不同類型色譜柱，VS的含義不同；

氣-液色譜柱：VS為固定液體積；

氣-固色譜柱：VS為吸附劑表面容量；2023/1/315.分配比與保留時間的關系

滯留因子（retardationfactor）：us：組分在分離柱內(nèi)的線速度；u：流動相在分離柱內(nèi)的線速度；滯留因子RS也可以用質(zhì)量分數(shù)ω表示：若組分和流動相通過長度為L的分離柱，需要的時間分別為tR和tM，則：由以上各式，可得：tR=tM(1+k)2023/1/31

氣相色譜分析法一、氣相色譜儀gaschromatographicinstruments二、氣相色譜儀流程processofgaschromatograph三、氣相色譜主要部件mainassemblyofgaschromatograph第一節(jié)

氣相色譜儀gaschromatographicanalysis,GCgaschromatographicinstruments2023/1/31一、氣相色譜儀器

gaschromatographicinstruments2023/1/31氣相色譜儀器2023/1/31氣相色譜儀器2023/1/31二、氣相色譜結構流程

processofgaschromatograph1-載氣鋼瓶；2-減壓閥；3-凈化干燥管；4-針形閥；5-流量計;6-壓力表；4-針形閥；5-流量計;6-壓力表；9-熱導檢測器；10-放大器；11-溫度控制器；12-記錄儀；載氣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)色譜柱檢測系統(tǒng)溫控系統(tǒng)2023/1/31結構流程2023/1/31二、氣相色譜結構流程

processofgaschromatograph1-載氣鋼瓶；2-減壓閥；3-凈化干燥管；4-針形閥；5-流量計;6-壓力表；4-針形閥；5-流量計;6-壓力表；9-熱導檢測器；10-放大器；11-溫度控制器；12-記錄儀；載氣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)色譜柱檢測系統(tǒng)溫控系統(tǒng)2023/1/31三、氣相色譜儀主要部件

mainassemblyofgaschromatograph1.載氣系統(tǒng)包括氣源、凈化干燥管和載氣流速控制；常用的載氣有：氫氣、氮氣、氦氣；凈化干燥管：去除載氣中的水、有機物等雜質(zhì)（依次通過分子篩、活性炭等）；載氣流速控制：壓力表、流量計、針形穩(wěn)壓閥，控制載氣流速恒定。2023/1/312.進樣裝置進樣裝置：進樣器+氣化室；氣體進樣器（六通閥）：推拉式和旋轉(zhuǎn)式兩種。試樣首先充滿定量管，切入后，載氣攜帶定量管中的試樣氣體進入分離柱；2023/1/31液體進樣器：不同規(guī)格的專用注射器，填充柱色譜常用10μL；毛細管色譜常用1μL；新型儀器帶有全自動液體進樣器，清洗、潤沖、取樣、進樣、換樣等過程自動完成，一次可放置數(shù)十個試樣。

氣化室：將液體試樣瞬間氣化的裝置。無催化作用。2023/1/313.色譜柱（分離柱）色譜柱：色譜儀的核心部件。柱材質(zhì)：不銹鋼管或玻璃管，內(nèi)徑3-6毫米。長度可根據(jù)需要確定。柱填料：粒度為60-80或80-100目的色譜固定相。

液-固色譜：固體吸附劑液-液色譜：擔體+固定液柱制備對柱效有較大影響，填料裝填太緊，柱前壓力大，流速慢或?qū)⒅滤?，反之空隙體積大，柱效低。有關固定液性質(zhì)及其選擇見下一節(jié)。2023/1/314.檢測系統(tǒng)

色譜儀的眼睛，通常由檢測元件、放大器、顯示記錄三部分組成；被色譜柱分離后的組分依次進入檢測器，按其濃度或質(zhì)量隨時間的變化，轉(zhuǎn)化成相應電信號，經(jīng)放大后記錄和顯示，給出色譜圖；

檢測器：廣普型——對所有物質(zhì)均有響應；

專屬型——對特定物質(zhì)有高靈敏響應；常用的檢測器：熱導檢測器、氫火焰離子化檢測器；有關檢測器原理、結構見第三節(jié)。2023/1/315.溫度控制系統(tǒng)

溫度是色譜分離條件的重要選擇參數(shù)；氣化室、分離室、檢測器三部分在色譜儀操作時均需控制溫度；氣化室：保證液體試樣瞬間氣化；檢測器：保證被分離后的組分通過時不在此冷凝；

分離室：準確控制分離需要的溫度。當試樣復雜時，分離室溫度需要按一定程序控制溫度變化，各組分在最佳溫度下分離；2023/1/31一、高效液相色譜法的特點二、流程及主要部件三、影響分離的因素四、高效液相色譜法的主要分離類型

高效液相色譜法2023/1/31液相色譜儀（1）2023/1/31液相色譜儀（2）2023/1/31液相色譜儀（3）2023/1/31液相色譜儀（4）2023/1/31一、高效液相色譜法的特點

特點：高壓、高效、高速高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。2023/1/31二、流程及主要部件1.流程2023/1/312.主要部件(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性2023/1/31(2)梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2023/1/31(3)進樣裝置

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結構如圖所示：2023/1/31(4)高效分離柱

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。2023/1/31(5)高效液相色譜檢測器紫外光度檢測器（UV）：最小檢測量10-9g·mL-1，對流量和溫度的波動不敏感，可用于梯度洗脫。最常用的檢測器。2023/1/31光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2023/1/31四、高效液相色譜法的主要分離類型1.吸附色譜（液-固吸附色譜）以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。2.分配色譜（液-液分配色譜）早期通過在擔體上涂漬一薄層固定液制備固定相,現(xiàn)多為化學鍵合固定相，即用化學反應的方法通過化學鍵將固定液結合在擔體表面。2023/1/313.離子交換色譜固定相為離子交換樹脂，流動相為無機酸或無機堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹脂上的交換基團的交換能力的不同而得到分離。4.凝膠色譜（空間排阻色譜）以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結構和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠；2023/1/31一、毛細管色譜的特點二、結構流程及操作條件的優(yōu)化三、分流比調(diào)節(jié)

毛細管色譜法2023/1/31一、毛細管色譜的特點1.毛細管色譜分離能力提高的途徑(1)由塔板理論：增加柱長減小柱徑，即增加柱子塔板數(shù)；(2)由速率理論：減小組分在柱中的渦流擴散和傳質(zhì)阻力，也即降低塔板高度。2023/1/312.毛細管色譜柱的結構特點（1）不裝填料阻力小，長度可達百米的毛細管柱，管徑0.2mm。（2）氣流單途徑通過柱子，消除了組分在柱中的渦流擴散。（3）固定液直接涂在管壁上，總柱內(nèi)壁面積較大,涂層很薄，則氣相和液相傳質(zhì)阻力大大降低。（4）毛細管色譜柱柱效高達每米3000～4000塊理論塔板，一支長度100米的毛細管柱，總的理論塔板數(shù)可達104～106。

2023/1/313.毛細管色譜具有的優(yōu)點（1）分離效率高：比填充柱高10～100倍；（2）分析速度快：用毛細管色譜分析比用填充柱色譜速度（3）色譜峰窄、峰形對稱。較多采用程序升溫方式；（4）靈敏度高，一般采用氫焰檢測器。（5）渦流擴散為零。2023/1/314.毛細管色譜的種類與制備方法毛細管柱按其制備方法可分為以下幾種：涂壁開管柱（wallcoatedopentubular，WCOT柱）：將固定液直接涂敷在管內(nèi)壁上。柱制作相對簡單，但柱制備的重現(xiàn)性差、壽命短。多孔層開管柱（porouslayeropentubular，PLOT柱）：在管壁上涂敷一層多孔性吸附劑固體微粒。構成毛細管氣固色譜。載體涂漬開管柱（supportcoatedopentubular，SCOT柱）：將非常細的擔體微粒粘接在管壁上，再涂固定液。柱效較WCOT柱高?；瘜W鍵合或交聯(lián)柱：將固定液通過化學反應鍵合在管壁上或交聯(lián)在一起。使柱效和柱壽命進一步提高。2023/1/31二、結構流程具有分流和尾吹裝置2023