第十二章實驗動物胚胎工程技術(shù)

1第十二章實驗動物胚胎工程技術(shù)

第一節(jié)概述

胚胎工程又稱胚胎技術(shù)，是指利用生物工程學(xué)的原理對動物的胚胎進(jìn)行某種技術(shù)操作或改造，使之獲得人們所需要動物的一系列生物技術(shù)的總稱。胚胎工程主要分為四大體系：第一類：胚胎操作基本技術(shù)，包括超數(shù)排卵、精子和卵母細(xì)胞的采集、體外受精、胚胎培養(yǎng)、胚胎的冷凍保存、胚胎性別鑒定和胚胎移植技術(shù)；第二類：動物克隆技術(shù)，包括胚胎分割、細(xì)胞核移植技術(shù)；第三類：胚胎干細(xì)胞技術(shù)；第四類：轉(zhuǎn)基因技術(shù)。

胚胎工程是生物工程的一個分支，是動物細(xì)胞工程的拓展與延伸，胚胎工程技術(shù)除了作為研究胚胎的分化和發(fā)育的方法和手段外，當(dāng)前更多地作為一種先進(jìn)技術(shù)應(yīng)用于以下幾個方面：1.在畜牧業(yè)方面通過建立超數(shù)排卵、受精卵/卵母細(xì)胞的采集、體外受精、胚胎切割、胚胎性別控制、體細(xì)胞克隆以及胚胎移植技術(shù)，加快良種家畜的繁殖和家畜品種的改良。2.在醫(yī)學(xué)方面通過建立卵母細(xì)胞的采集、體外受精、顯微受精以及胚胎移植技術(shù)，用于不孕癥的治療；通過對胚胎培養(yǎng)和檢測，剔除具有遺傳性疾病的胚胎，達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育目的。3.在生命科學(xué)研究方面闡明哺乳動物早期胚胎發(fā)生及其發(fā)育機(jī)制等基礎(chǔ)理論。4.在生物制藥方面通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將具有藥用價值的生物活性蛋白的基因整合到宿主的染色體上，使其在乳汁、血液、尿液等體液中表達(dá)。通過收集、純化這些體液中的生物活性蛋白，用于預(yù)防和治療某些人類的疾病。5.在拯救瀕危野生動物方面通過野生動物生殖細(xì)胞和組織的冷凍保存、體細(xì)胞克隆和胚胎移植技術(shù)，擴(kuò)大野生動物的種群。6第二節(jié)胚胎操作基本技術(shù)胚胎操作基本技術(shù)：一、精子、卵母細(xì)胞、早期胚胎的采集和超數(shù)排卵二、體外受精三、胚胎性別控制四、胚胎培養(yǎng)五、胚胎移植

六、胚胎冷凍保存

一、精子、卵母細(xì)胞、早期胚胎的采集和超數(shù)排卵是胚胎工程最基本的技術(shù)。胚胎工程的其他技術(shù)均需從卵母細(xì)胞和受精卵的采集技術(shù)開始。1.精子的采集嚙齒類小動物，如大、小鼠，可將動物處死后，分離附睪尾部，用眼科剪子在頂端剪一小口，用手指輕柔擠出濃稠的液滴，置培養(yǎng)液中培養(yǎng)。大動物，如犬的精液采集可采用生物電刺激方法促進(jìn)雄性射精，收集精液。解剖取附睪尾部精子的獲取和培養(yǎng)102.卵母細(xì)胞的采集

從哺乳動物獲得成熟的卵母細(xì)胞，主要途徑有兩條：獲取體內(nèi)成熟并排到輸卵管中的卵母細(xì)胞，需處死動物或通過外科手術(shù)；如果已交配，獲取的是受精卵或早期胚胎。從剛死亡的雌性動物卵巢中分離卵母細(xì)胞，體外培養(yǎng)。小鼠解剖取輸卵管從輸卵管壺腹部取卵母細(xì)胞/受精卵的方法113.超數(shù)排卵：在正常情況下，哺乳動物一次排卵數(shù)極其有限，單胎動物一次排卵一枚，多胎動物如小鼠一次平均排卵8～10枚，家兔一次平均排卵9枚。為了獲得大量的胚胎，可通過注射激素刺激卵巢大量排卵，常用激素有促卵泡激素（FSH）、人絨毛膜促性腺激素(HCG)和孕馬血清促性腺激素（PMSG）、孕酮和前列腺素（PG）等，最常用的是前三種。經(jīng)超數(shù)排卵處理，動物卵巢大量的卵泡同時成熟并排出，排卵數(shù)可增加幾倍至十幾倍，一次可獲得大量的卵細(xì)胞、受精卵或早期胚胎。以小鼠的超數(shù)排卵為例，成熟雌性小鼠，中午12～13時用孕馬妊娠血清（PMSG）腹腔注射5單位/只。48小時后用人絨毛膜促性腺激素（hCG）腹腔注射5單位/只，進(jìn)行超數(shù)排卵。二、體外受精體外受精是指成熟的精子與卵母細(xì)胞在體外環(huán)境下完成受精的過程。以小鼠為例：1）進(jìn)行超數(shù)排卵：PMSG和hCG注射2）處死，取出輸卵管壺腹部采集卵母細(xì)胞。將新鮮采集的精子在培養(yǎng)液中培養(yǎng)1小時后，以適當(dāng)?shù)臐舛纫迫胗新涯讣?xì)胞的培養(yǎng)液滴中。如受精，4～5小時后受精卵中可見明顯的雄性原核，第二天受精卵發(fā)育成二細(xì)胞胚胎。體外受精不僅是研究受精及早期胚胎發(fā)生的重要手段，而且廣泛應(yīng)用于人類生殖障礙、家畜品種改良等方面。試管嬰兒：若夫婦兩人，生殖細(xì)胞能正常產(chǎn)生，但就是生不出孩子——怎么辦？把卵子和精子都拿到體外來，讓它們在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程，然后把受精卵移植到女性的子宮中，在子宮中孕育成為胚胎。世界上第一個試管嬰兒路易斯-布朗

1992年我國首例三胞胎試管嬰兒廣州8胞胎--試管嬰兒連中八元三、胚胎性別控制是畜牧業(yè)生物技術(shù)中一項重要的高新技術(shù)。這項技術(shù)的應(yīng)用可以使畜牧上大動物的繁殖按照人們的意愿只生產(chǎn)同一性別動物，例如奶牛、奶羊等的生產(chǎn)按照人們的意愿只生產(chǎn)母畜，可以顯著提高奶牛的繁殖效率，獲得可觀的經(jīng)濟(jì)效益。在醫(yī)學(xué)上對人類性別控制的研究也具有積極的意義。有的遺傳性疾病屬于性連鎖遺傳，例如進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良，為X連鎖隱性遺傳，男性發(fā)病，女性攜帶異?；虻话l(fā)病。攜帶此致病基因的女性懷孕后如做胚胎性別鑒定，可避免男性患兒出生。

正常情況下，法律禁止對胎兒性別進(jìn)行控制！性別控制技術(shù)主要有3種不同的途徑：1.分離X精子與Y精子：流式細(xì)胞光度法2.對胚胎進(jìn)行鑒定以控制性別：在胚胎移植前對胚胎的部分組織用染色體檢查、間接免疫熒光法和PCR法進(jìn)行性別鑒定。其中PCR法具有高效、快速的特點。3.改變酸堿度：酸性環(huán)境下X型精子活力強，堿性環(huán)境下Y型精子活力強，如雌性動物喂食酸性飼料，子代雌性動物可能性大，喂食偏堿性飼料，子代雄性動物可能性大。同樣原理，交配前用酸性溶液沖洗陰道，子代雌性動物機(jī)會多；用堿性溶液沖洗陰道，子代雄性動物機(jī)會多。四、胚胎培養(yǎng):胚胎培養(yǎng)是指將獲得的未成熟的卵母細(xì)胞、受精卵、冷凍保存胚胎在體外人工創(chuàng)造的環(huán)境中培養(yǎng)成熟，并通過體外受精發(fā)育成各階段的早期胚胎。研究胚胎發(fā)育的環(huán)境和條件，揭示胚胎細(xì)胞的生長發(fā)育和分化的奧秘。

但體外胚胎培養(yǎng)只能發(fā)育到受精卵的囊胚期，然后必須移植到動物的子宮內(nèi)。21五、胚胎移植胚胎移植技術(shù)是胚胎工程技術(shù)的最后一步，體外受精、胚胎分割、轉(zhuǎn)基因動物、克隆動物等任何一項生物技術(shù)所生產(chǎn)的胚胎，最終都必須移植到受體動物的生殖管道一定部位，繼續(xù)生長、發(fā)育、分娩出生仔代動物。顯然，在同一物種動物之間進(jìn)行胚胎移植更易于成功。22在畜牧業(yè)方面：牛奶營養(yǎng)豐富，但普通奶牛的產(chǎn)奶量低?，F(xiàn)在如果從國外購進(jìn)幾頭高產(chǎn)的荷斯坦奶牛，有什么技術(shù)可以讓這些高產(chǎn)的奶牛短時間內(nèi)快速繁殖成一個群體呢？——胚胎移植技術(shù)（借腹懷胎）。胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用供體：只產(chǎn)生具有優(yōu)良遺傳特性的胚胎受體：擔(dān)任漫長繁重的妊娠和育仔任務(wù)23問題1：將準(zhǔn)備移植的荷斯坦奶牛胚胎，移植到另外一頭普通母牛的子宮內(nèi)，一定能發(fā)育嗎？供體母牛和受體母牛必須具備相同或相似的子宮內(nèi)生理環(huán)境，供體的胚胎移入受體子宮后，才能存活和發(fā)育，這是胚胎移植成功的生理學(xué)基礎(chǔ)。因此，胚胎移植也可以看成是早期胚胎在相同子宮內(nèi)環(huán)境條件下空間位置的轉(zhuǎn)移。問題2：

怎樣才能使供體母牛和受體母牛具備相同或相似的子宮內(nèi)生理環(huán)境？

同期發(fā)情處理，使胚胎移植中的供體和受體幾乎同步性的出現(xiàn)卵泡期、排卵期和黃體生成期，這樣才能使兩者體內(nèi)的子宮內(nèi)膜的狀態(tài)、各種激素水平都具有一致性，保證移植后的胚胎具有最合適的發(fā)育環(huán)境，是胚胎移植成功的基本條件。注射孕激素等，延長黃體期，抑制卵泡發(fā)育;

前列腺素，溶解黃體，促使卵巢進(jìn)入卵泡期。供體母牛超數(shù)排卵配種收集受精卵受體母牛質(zhì)量檢查、培養(yǎng)同期發(fā)情處理發(fā)情胚胎移植妊娠有價值的后裔受體公牛奶牛胚胎移植技術(shù)路線示意圖26同一種屬內(nèi)的不同品種品系可互相進(jìn)行胚胎移植。如近交系C57BL/6J小鼠的胚胎可移植到雌性封閉群ICR的生殖管道內(nèi)；日本大耳白兔的胚胎可移植到雌性新西蘭兔的生殖管道內(nèi)。這一特點在畜牧業(yè)很有價值，如為了加快良種奶牛的繁殖，可將良種奶牛的胚胎移植到普通黃牛的生殖管道內(nèi)，借腹懷胎。胚胎移植技術(shù)的新進(jìn)展：

六、胚胎冷凍保存指在低溫（-196℃）條件下利用低溫保護(hù)劑保存生殖細(xì)胞及胚胎的一門技術(shù)。目前應(yīng)用的低溫保護(hù)劑有二甲基亞砜（DMSO）、聚乙烯砒咯烷酮(PVP)、甲醇、乙二醇、羥甲基淀粉（HES）等。

可以避免或減少結(jié)冰的程度與速度，降低細(xì)胞周圍未凍結(jié)溶液中的電解質(zhì)濃度，從而避免或減少胚胎冷凍過程中所發(fā)生的物理和化學(xué)損傷。自1972年以來，世界各地已有小鼠、大鼠、田鼠、兔、山羊、綿羊、牛、馬、狒狒等20多種動物的胚胎被成功地冷凍保存。28液氮罐胚胎冷凍保存技術(shù)的應(yīng)用

（1）應(yīng)用于實驗動物的保種和珍稀或瀕危動物種質(zhì)保存。（2）應(yīng)用于實驗動物的長途運輸。（3）應(yīng)用于實驗動物的生物凈化。被病原體感染的實驗動物的生物凈化，一般采用子宮切開術(shù)，取出胎仔由無菌動物或SPF動物代乳。但是這種方法成功率并不高，而且較為麻煩。通過胚胎冷凍、胚胎移植等技術(shù)，可以使生物凈化變得更簡便和安全。（4）應(yīng)用于實驗動物育種和野生動物實驗動物化。胚胎克隆技術(shù)、體細(xì)胞克隆技術(shù)結(jié)合胚胎冷凍技術(shù)，已經(jīng)應(yīng)用于實驗動物和其他動物的育種，可以縮短育種時間，可以克服野生動物進(jìn)入實驗室后因環(huán)境改變而交配困難，可以利用極少量的原種繁殖出大量的后代，可以克服雜交障礙而實現(xiàn)基因的種間轉(zhuǎn)移(如轉(zhuǎn)基因動物等)。

胚胎移植實現(xiàn)了優(yōu)良性狀個體的繁育，如果我們能確定某個胚胎將發(fā)育為非常理想的個體，那么有沒有辦法讓這樣的一個胚胎一次性地繁育更多的個體？思考第三節(jié)動物體細(xì)胞克隆技術(shù)一、克隆的定義

克?。–lone）是指一個細(xì)胞或個體通過無性繁殖（不經(jīng)過兩性生殖細(xì)胞的結(jié)合）方式產(chǎn)生遺傳物質(zhì)完全相同的一群細(xì)胞或一群個體。

無性繁殖在植物中很常見，如孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖；植物的根、莖、葉等經(jīng)過壓條、扦插或嫁接等方式產(chǎn)生新個體。

關(guān)于動物無性繁殖的設(shè)想，吳承恩在《西游記》中已有精彩的描述——孫悟空經(jīng)常在緊要關(guān)頭拔一把猴毛變出一大群猴子，用今天的科學(xué)名詞來說就是孫悟空能迅速將自己身體的一部分克隆成自己，用現(xiàn)在的理論來解釋，就是通過對猴毛中含有的蛋白質(zhì)基因逆轉(zhuǎn)錄來進(jìn)行克隆。動物的克隆技術(shù)，經(jīng)歷了由胚胎細(xì)胞克隆動物到由體細(xì)胞克隆動物的發(fā)展過程。

二、動物克隆技術(shù)：1.胚胎分割2.細(xì)胞核移植

2.1胚胎細(xì)胞核移植

2.2胚胎干細(xì)胞核移植

2.3胎兒成纖維細(xì)胞核移植

2.4體細(xì)胞核移植

胚胎分割：

受精卵在發(fā)育為胚胎的過程中，早期未分化的胚胎細(xì)胞具有全能性，能夠分化成發(fā)育所需的所有細(xì)胞，如果對其加以分割，再將分割的胚胎細(xì)胞分別加以培養(yǎng)，就能夠發(fā)育出完整的新一代，由于這些后代來自同一胚胎，具有相同的遺傳物質(zhì)，因此胚胎分割可看成動物無性繁殖或克隆的方法之一。

胚胎分割的最佳時期是受精卵發(fā)育到囊胚期，用分割針將胚胎切開，吸出其中的半個胚胎，直接移植給受體。對囊胚期的胚胎進(jìn)行分割時，為什么要均等分割？

囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)將來要發(fā)育成胎兒的各種組織，是胚胎本身的基礎(chǔ)細(xì)胞。如果分割時不能將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割，會出現(xiàn)含內(nèi)細(xì)胞團(tuán)多的部分正常發(fā)育的能力強，少的部分發(fā)育受阻或發(fā)育不良，甚至不能發(fā)育等問題。所以要將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割。問題分割的份數(shù)越多，操作的難度會越大，移植的成功率也越低。目前多采用2分割與4分割技術(shù)。

胚胎移植——胚胎分割——？思考（后代少）（后代多，但不能無限分割）（更多）

動物體細(xì)胞的形成不會像胚胎細(xì)胞那樣受到時間和數(shù)量的限制；而且同一個個體所有體細(xì)胞都具有同樣的遺傳信息，因此，利用動物體細(xì)胞進(jìn)行克隆，可以復(fù)制出比胚胎分割數(shù)量更多的優(yōu)良個體。1.畜牧業(yè)育種；2.克隆能夠生產(chǎn)特殊醫(yī)藥蛋白的轉(zhuǎn)基因動物。3.利用個體克隆技術(shù)可以研究細(xì)胞發(fā)育過程中不同基因的表達(dá)規(guī)律和調(diào)節(jié)控制機(jī)理,4.利用動物克隆技術(shù)可以獲得足夠量的動物器官，用于人類器官移植。5.延緩珍稀野生瀕危動物的滅絕。

相對于通過胚胎分割克隆動物，通過細(xì)胞核移植來克隆動物，意義更大，因為生物的遺傳信息DNA，主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，可以通過技術(shù)手段（顯微操作技術(shù)）將一個動物的細(xì)胞核移植到另一個去核的動物細(xì)胞中，再通過胚胎移植，使之發(fā)育成個體。整個過程沒有經(jīng)過精子和卵子的受精，核移植動物的全部遺傳信息來自供體核細(xì)胞，等于是復(fù)制了提供細(xì)胞核的動物。。卵母細(xì)胞去核卵母細(xì)胞NucleusofstemcellsorothersNuclearTransferTechnologyForcloning核移植用于核移植的供體核來源細(xì)胞無論是早期胚胎細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞還是胎兒成纖維細(xì)胞都有一個特點，即都是處在未分化或低分化狀態(tài)，具有重新發(fā)育成個體的潛能，而且這種克隆都是子代動物的克隆，不存在倫理上的爭議。但是成年體細(xì)胞核移植的成功卻意義重大，它第一次推翻了長期以來人們認(rèn)為的已經(jīng)分化了的體細(xì)胞不再具有重新分化的能力，證明了即使是已分化了的成年體細(xì)胞在某種條件下也具有全能性，即可重編程序發(fā)育成一個新個體。我們一般所說的“克隆”主要是指成年體細(xì)胞核移植。體細(xì)胞克隆羊”多莉”（動畫）在裸小鼠身上克隆出人耳三、克隆動物的研究進(jìn)展

克隆?？寺∈罂寺∩窖蚩寺∝?003年8月，我國首批本土自主克隆牛。

我國首例異種克隆羊2004年1月21日零時在新疆誕生。胚胎細(xì)胞克隆兔在廣西大學(xué)出生

意大利科學(xué)家2004年6月成功培育出世界上首匹“自體克隆馬”。

在2000年美國的《科學(xué)》雜志上，科學(xué)家宣布，他們使用新的方法成功地克隆了一個恒河猴，這是與人類血緣最近的動物———靈長目動物第一次被成功克隆。

美國密蘇里大學(xué)通過克隆技術(shù)培育出四只含有熒光水母基因的小豬。五只小豬中有四只小豬的豬嘴和豬蹄呈熒光黃色，剩下的一只小豬和正常小豬無異。專家們稱，熒光小豬的成功培育對培育動物器官用于人體移植具有重要意義。

美國科學(xué)家2003年5月宣布培育出一頭克隆騾子。它頭上戴有3個“世界第一”桂冠：第一個克隆的騾子，第一個克隆的馬科動物，第一個克隆的雜種動物?？茖W(xué)家們說，該成果將有助于克隆其他自身繁殖有困難的瀕危動物，對研究癌癥等疾病也有重要的參考價值。

2003年12月22日，美國得克薩斯農(nóng)業(yè)和機(jī)械大學(xué)公布了世界上第一頭克隆鹿的照片。這一成果被認(rèn)為在瀕危鹿種保護(hù)等領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價值。

目前，動物體細(xì)胞核移植技術(shù)還不很成熟，克隆成功率很低，克隆動物的先天性缺陷很多，這說明對克隆技術(shù)和克隆動物的研究還有許多問題尚待解決。

2003年2月14日，英國蘇格蘭愛丁堡羅斯林研究所的科學(xué)家宣布，全世界第一個克隆動物多利羊已經(jīng)死亡，活了6年半。當(dāng)科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)它患上無法治愈的肺病后，決定實施“安樂死”讓它長眠。一般來說，一只綿羊平均可以活１１－１２年，而多莉今年只有６歲，壽命僅相當(dāng)于普通羊的一半。59

克隆技術(shù)的安全性也存在很大風(fēng)險，克隆過程中無法避免基因變異的問題。在自然情況下，精子和卵細(xì)胞必須經(jīng)過幾個月才能成熟，這一過程絕大多數(shù)情況下是非常完美的，而克隆過程中的卵細(xì)胞必須在幾分鐘或數(shù)小時內(nèi)，要完成通?；◣讉€月或幾年才能完成的“任務(wù)”。人為地加快了動物自然生殖過程，容易導(dǎo)致很多基因復(fù)制時出現(xiàn)一些錯誤，造成胚胎停止發(fā)育或基因變異，而在其誕生后產(chǎn)生許多生理問題。60

克隆鼠、克隆牛、克隆豬等先后問世，甚至有些已經(jīng)出現(xiàn)第6代復(fù)制品，但一些克隆動物生長過快，患了肥胖癥，或是肺發(fā)育不正常。更令人不寒而栗的是“克隆人”，雖然目前克隆人引起的爭議主要集中在倫理道德方面，但科學(xué)家指出，真正的問題是在于克隆人可能會出現(xiàn)基因變異，導(dǎo)致致命的生理問題。綜上所述，克隆技術(shù)雖然很神奇，但它是一把“雙刃劍”，它誘人的地方也就是最危險的地方。61第四節(jié)干細(xì)胞技術(shù)62

干細(xì)胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的未分化細(xì)胞。具有發(fā)育的全能性，能夠被誘導(dǎo)或分化為機(jī)體幾乎所有的細(xì)胞類型。因此干細(xì)胞也被稱為“種子細(xì)胞”，根據(jù)來源的不同，干細(xì)胞主要分為三種：1.胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells，ESCs)2.誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（inducedpluripotentstemcells，iPS）3.成體干細(xì)胞(adultstemcells，ASCs)63一、胚胎干細(xì)胞（ESCs)來源：囊胚期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖細(xì)胞64

1981年Evans和Kaufman首次成功分離小鼠ESCs

目前已在倉鼠、大鼠、兔、豬、牛、綿羊、山羊、水貂、恒河猴、美洲長尾猴以及人類都分離獲得了ESCs

，而且已經(jīng)證明小鼠ESCs可以分化為心肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、卵黃囊細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、胰島細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞等。人類ESCs也可以分化為滋養(yǎng)層細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、造血細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。65ESCs的應(yīng)用：1.研究體外細(xì)胞分化和發(fā)育調(diào)控機(jī)制的理想材料。在ESCs培養(yǎng)液中加入分化誘導(dǎo)因子,可以誘導(dǎo)ESCs向不同類型的組織細(xì)胞分化，研究胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞分化、組織和器官形成的規(guī)律。小鼠ESCs已成為研究哺乳動物早期發(fā)育規(guī)律重要工具之一。662.治療人類的某些難治性疾病利用ESCs可以誘導(dǎo)分化形成新的組織細(xì)胞的特性，移植ESCs可使壞死或退化的部位得以修復(fù)并恢復(fù)正常功能。目前，用ESCs誘導(dǎo)分化出的某些組織細(xì)胞已成功地治愈了部分糖尿病、肝衰竭、心衰竭和成骨不良等疑難病癥。673.培育出人造組織器官，用于器官移植

ESCs作為“種子細(xì)胞”，可為臨床的組織器官移植提供大量材料。通過ESCs體外誘導(dǎo)分化，可以培育出人造組織器官，解決目前臨床上存在的供體器官不足和器官移植后免疫排斥的問題，為人類移植醫(yī)學(xué)帶來一場革命。684.生產(chǎn)克隆動物（設(shè)想）

ESCs從理論上講可以無限傳代和增殖，以其作為核供體進(jìn)行核移植后，在短期內(nèi)可獲得大量基因型和表現(xiàn)型完全相同的個體，使用該項技術(shù)進(jìn)行異種動物克隆，對保護(hù)珍稀野生動物有重要意義。5.生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物（設(shè)想）

ESCs可以作為一種載體，將通過同源重組產(chǎn)生的基因組的定點突變導(dǎo)入個體，從而突破親緣關(guān)系的限制，加快動物群體遺傳變異程度，進(jìn)行定向變異和育種。利用ES細(xì)胞技術(shù)，可在細(xì)胞水平上對胚胎進(jìn)行早期選擇，這樣可以提高選樣的準(zhǔn)確性，縮短育種時間。69二、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）1.iPS細(xì)胞的產(chǎn)生2006年，日本科學(xué)家山中伸彌利用病毒載體將四個轉(zhuǎn)錄因子（Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc）引入小鼠胚胎和皮膚纖維母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生了在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、分化能力等方面都與胚胎干細(xì)胞極為相似的一種細(xì)胞類型，并命名為iPS細(xì)胞。702.iPS細(xì)胞系建立的主要過程:①

分離和培養(yǎng)宿主細(xì)胞；②

通過病毒介導(dǎo)或基因轉(zhuǎn)染的方式將若干個多能性相關(guān)的基因?qū)胨拗骷?xì)胞；③

將病毒感染后的細(xì)胞種植于飼養(yǎng)層細(xì)胞上,用ESCs專用培養(yǎng)體系中培養(yǎng),同時在培養(yǎng)液中根據(jù)需要加入相應(yīng)的小分子化合物，以促進(jìn)重編程。④進(jìn)行iPS細(xì)胞系的鑒定，包括細(xì)胞形態(tài)、表觀遺傳學(xué)、體外分化潛能等方面。713.iPS細(xì)胞與ESCs相比，具有很多優(yōu)勢。目前的研究成果表明，iPS細(xì)胞與ESCs具有相似的多能性，而且iPS細(xì)胞不需要從動物囊胚期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖細(xì)胞中分離，不存在倫理問題，理論上可以從任何組織的細(xì)胞，甚至皮膚組織的細(xì)胞來制造，技術(shù)上更加簡單。目前,科學(xué)家們已經(jīng)成功地從小鼠、大鼠、獼猴、豬和人的體細(xì)胞中誘導(dǎo)并獲得了iPS細(xì)胞。72

在實際應(yīng)用方面，iPS細(xì)胞的建立進(jìn)一步拉近了干細(xì)胞和臨床疾病治療的距離，iPS細(xì)胞在細(xì)胞替代性治療以及發(fā)病機(jī)理的研究、新藥篩選方面具有巨大的潛在價值。此外，iPS細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等方面的作用也日益呈現(xiàn)，iPS細(xì)胞在體外已成功地被分化為神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、心血管細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞等。在臨床疾病治療中具有巨大應(yīng)用價值。73二、成體干細(xì)胞（ASCs）1.來源：

ASCs存在于機(jī)體的各種組織器官中，可以自我更新，在一定條件下也可以分化，產(chǎn)生各種特異的細(xì)胞類型。但成體干細(xì)胞含量很少，在正常情況下一般靜止休眠狀態(tài)（不分裂），直到組織受到損傷或發(fā)生疾病時被激活，才開始分裂，表現(xiàn)出現(xiàn)修復(fù)和再生能力，維持正常生理功能。目前已經(jīng)報道的含有ASCs的組織包括：腦、骨髓、外周血液、血管、骨骼肌、皮膚和肝臟742.體外培養(yǎng)：取所要分離ASCs的組織，用酶消化法分散細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。再用各種技術(shù)從體外培養(yǎng)細(xì)胞中分離ASCs，如用免疫磁珠分離系統(tǒng)分離乳腺ASCs

。3.應(yīng)用：

疾病的替代治療和移植治療，如用造血干細(xì)胞治療白血病，造血干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞來修復(fù)受損傷的心肌，治療心力衰竭。骨髓來源干細(xì)胞及其他來源干細(xì)胞都可以分化得到成骨細(xì)胞，通過將細(xì)胞與支架材料結(jié)合后移植于骨骼受損部位，用于修復(fù)骨骼缺損。75對ESCs、iPS細(xì)胞和ASCs的研究，在干細(xì)胞研究領(lǐng)域、表觀遺傳學(xué)研究領(lǐng)域以及生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域都引起了強烈的反響，這不僅是因為它們在基礎(chǔ)研究方面的重要性，更是因為它們?yōu)槿祟悗砹斯饷鞯膽?yīng)用前景，必然成為未來的研究熱點。76第五節(jié)外源基因?qū)肱咛ゼ夹g(shù)一、外源基因直接導(dǎo)入受精卵或早期胚胎內(nèi)1.顯微注射法：在顯微鏡下利用玻璃顯微注射針直接將外源DNA注入到受體的細(xì)胞核內(nèi)。是應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可獲得大量的轉(zhuǎn)基因動物。2.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法：目前已有許多逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。將外源基因克隆到這些病毒載體，感染受體胚胎細(xì)胞時，外源基因可整合到宿主細(xì)胞染色體。該法轉(zhuǎn)移效率高。3.精子載體法：將外源DNA與動物精子一起孵育，在體外受精過程中由精子將外源DNA帶入卵內(nèi)。該法重復(fù)性較差，尚有爭議。二、外源基因通過胚胎干細(xì)胞和體細(xì)胞進(jìn)入早期胚胎步驟：①首先將外源基因轉(zhuǎn)染ESCs或體細(xì)胞，在體外細(xì)胞水平進(jìn)行基因定點整合篩選；

電穿孔法、脂質(zhì)體法、EAE-葡聚糖介導(dǎo)法、磷酸鈣介導(dǎo)法、基因槍法

②篩選出的定點整合ESCs通過崁合體技術(shù)進(jìn)入囊胚，體細(xì)胞通過克隆技術(shù)（核移植）進(jìn)入早期胚胎。1．電穿孔法：使用高電壓擊穿細(xì)胞膜，從而使外源DNA被攝入細(xì)胞中。最大優(yōu)點是可以快速對大量細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，且轉(zhuǎn)染效率高。2．脂質(zhì)體法：脂質(zhì)體是一種人造膜，將外源DNA裝入脂質(zhì)體，與培養(yǎng)細(xì)胞一起溫育，將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。3．DEAE-葡聚糖介導(dǎo)法：DEAE-葡聚糖是