蛋白質(zhì)的分析

第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)第五組成員周錫歡4-7頁(yè)文藝8-28頁(yè)申培培29-41頁(yè)鄒家奕42-52頁(yè)第五組成員廖瑩53-71頁(yè)何容秀72-88頁(yè)田景艷89-97頁(yè)彭浩98-104頁(yè)第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)姓名：周錫歡學(xué)號(hào)：2014950001班級(jí)：2014級(jí)醫(yī)檢1班第一節(jié)蛋白質(zhì)分離與純化概述蛋白質(zhì)的特點(diǎn)容易變性遇酸、堿發(fā)生水解變性后生物學(xué)活性喪失第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)蛋白質(zhì)的來(lái)源隨著DNA重組技術(shù)的問世，蛋白質(zhì)的表達(dá)和分離純化技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用。第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)蛋白質(zhì)的分離純化利用其相應(yīng)的理化性質(zhì)，采取鹽析、透析、離心、電泳以及色譜等不破壞蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的方法，獲得高純度的目的蛋白質(zhì)。第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)姓名：文藝學(xué)號(hào)：2014950007班級(jí)：2014級(jí)醫(yī)檢1班第一節(jié)蛋白質(zhì)分離與純化一、分離純化策略常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)分離依據(jù)溶解度差別電荷不同生物分子特性分子大小第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)常用的蛋白質(zhì)分離純化方法及原理1、透析2、超過濾3、凝膠過濾分子大小第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無(wú)機(jī)鹽、單糖、水等分開。原理第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)1、透析2、超過濾3、凝膠過濾分子大小常用的蛋白質(zhì)分離純化方法及原理第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)加壓蛋白質(zhì)溶液半透膜支持膜的柵板超濾液利用壓力和離心力，強(qiáng)行使其他小分子和水通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上。原理第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)1、透析2、超過濾3、凝膠過濾分子大小常用的蛋白質(zhì)分離純化方法及原理第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)當(dāng)不同分子大小的蛋白質(zhì)混合物流進(jìn)凝膠層析柱時(shí)，比凝膠網(wǎng)孔大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，排阻在凝膠珠以外，在凝膠珠縫隙間隙中向下移動(dòng)。而比孔小的分子不同程度地進(jìn)入凝膠珠內(nèi)，這樣由于不同大小分子所經(jīng)歷的路徑不同而到分離。原理第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)分離依據(jù)溶解度差別電荷不同生物分子特性分子大小第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)等電點(diǎn)沉淀溶解度差別鹽析不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物調(diào)到其中一種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，這種蛋白質(zhì)大部分或全部被沉淀下來(lái)。低濃度時(shí)，中性鹽可以增加蛋白質(zhì)溶解度這種現(xiàn)象稱為鹽溶。當(dāng)離子強(qiáng)度增加，足夠高時(shí)，例如飽和或半飽和程度，很多蛋白質(zhì)可以從水中沉淀出來(lái)，這種現(xiàn)象稱為鹽析。第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)分離依據(jù)溶解度差別電荷不同生物分子特性分子大小第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)

電荷不同氨基酸分離常用陽(yáng)離子交換樹脂，樹脂被處理成鈉型，將混合氨基酸上柱，氨基酸主要以陽(yáng)離子形式存在，在樹脂上與鈉離子發(fā)生交換，而被掛在樹脂上。離子交換層析第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)分離依據(jù)溶解度差別電荷不同生物分子特性分子大小第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)生物分子特性親和疏水作用層析第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)親和層析是一種吸附層析，抗原(或抗體)和相應(yīng)的抗體(或抗原)發(fā)生特異性結(jié)合，而這種結(jié)合在一定的條件下又是可逆的。所以將抗原(或抗體)固相化后，就可以使存在液相中的相應(yīng)抗體(或抗原)選擇性地結(jié)合在固相載體上，借以與液相中的其他蛋白質(zhì)分開，達(dá)到分離提純的目的。高效快速簡(jiǎn)便優(yōu)點(diǎn)第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)生物分子特性親和疏水作用層析第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)疏水作用層析是根據(jù)分子表面疏水性差別來(lái)分離蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法。蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的表面常常暴露著一些疏水性基團(tuán)，我們把這些疏水性基團(tuán)稱為疏水補(bǔ)丁，疏水補(bǔ)丁可以與疏水性層析介質(zhì)發(fā)生疏水性相互作用而結(jié)合。不同的分子由于疏水性不同，它們與疏水性層析介質(zhì)之間的疏水性作用力強(qiáng)弱不同，疏水作用層析就是依據(jù)這一原理分離純化蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的。疏水作用層析常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)類別方法分離依據(jù)特點(diǎn)用途沉淀法鹽析破壞蛋白質(zhì)水化膜操作簡(jiǎn)便，成本低廉，對(duì)蛋白質(zhì)和酶有保護(hù)作用，重復(fù)性好蛋白質(zhì)和酶的分級(jí)沉淀。粗制階段有機(jī)溶劑沉淀破壞蛋白質(zhì)水化膜操作簡(jiǎn)便，分辨力較強(qiáng)粗制階段選擇性沉淀等電點(diǎn)、熱變性、酸堿變性等沉淀作用選擇性較強(qiáng)，方法簡(jiǎn)便粗制階段第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)類別方法分離依據(jù)特點(diǎn) 用途膜技術(shù)超濾分子大小操作方便，可連續(xù)操作，但是分辨率低粗制階段透析分子大小小樣品處理，不能用于工業(yè)生產(chǎn)脫鹽、更換流動(dòng)相第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)類別方法分離依據(jù)特點(diǎn)用途色譜法離子交換電荷處理量大，分辨力較高最適于早期純化，即大體積樣品且蛋白純度較低時(shí)采用親和生物親和性分辨率極高，容量大，樣品體積不限適于任何階段，特別是樣品濃度低，雜質(zhì)含量高時(shí)采用凝膠過濾分子大小分級(jí)分離，分辨率適中；非常適合脫鹽；分級(jí)分離時(shí)流速較慢，脫鹽時(shí)流速較快缺點(diǎn)：樣品體積受限大規(guī)模純化的最后一步，用于去除微量雜質(zhì)及聚合體。脫鹽時(shí)可用于任何階段，特別是步驟銜接時(shí)的緩沖液更換疏水作用疏水性分辨率較高，流速大，容量大，樣品體積不受限適于任何階段，特別適于樣品離子強(qiáng)度較高時(shí)，如沉淀、離子交換和親和層析后反相疏水性分辨率較高，流速大，容量大，樣品體積不受限適于最后階段，特別適于分子量較小的肽最為廣泛第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)原材料破碎、溶解離心↓提取液↓超濾除核酸↓粗制品↓↓親和色譜凝膠色譜疏水色譜反相色譜結(jié)晶高純度蛋白質(zhì)↓↓↓↓↓↓↓↓↓前處理階段鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀離子交換色譜粗制階段精制階段蛋白質(zhì)分離純化過程第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)姓名：申培培學(xué)號(hào)：2014950016班級(jí)：2014級(jí)醫(yī)檢1班第一節(jié)蛋白質(zhì)分離與純化二、樣品的前處理第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)為什么要進(jìn)行樣品前處理？一、樣品的前處理重要性第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)樣品屬于復(fù)合基質(zhì)體系復(fù)雜的基質(zhì)背景會(huì)對(duì)被分析的目標(biāo)化合物的提取、分離、凈化和測(cè)定等帶來(lái)很大的麻煩而且對(duì)于分析結(jié)果的準(zhǔn)確可靠和靈敏具有決定性作用。60%的工作和花費(fèi)都用在樣品的前處理上二、樣品前處理的原則制備過程中避免組分發(fā)生化學(xué)變化；要防止和避免欲測(cè)定組分的玷污；盡可能減少無(wú)關(guān)化合物引入制備過程；盡可能簡(jiǎn)單易行。第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)

含量高來(lái)源豐富成本低廉分離制備工藝簡(jiǎn)便生物材料第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)三、材料的選擇四、原材料的破碎第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)原材料的破碎方法機(jī)械破碎法：利用勻漿器、組織分散器、細(xì)菌磨、超聲儀或高壓擠壓設(shè)備破碎細(xì)胞。

多功能粉碎機(jī)第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)五、樣品的提取生物材料破碎之后，加入適當(dāng)?shù)牧呀馊芤?，使?xì)胞中的蛋白質(zhì)釋放到溶液中。第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)樣品提取的注意事項(xiàng)第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)細(xì)胞破碎后，根據(jù)目的蛋白質(zhì)是在上清液中還是在固相沉淀中分別處理。若蛋白質(zhì)在提取液中，先通過離心方法出去不溶物，蛋白質(zhì)上清液進(jìn)行后續(xù)的純化處理。在破碎、提取及后續(xù)純化過程中，最好在4攝氏度條件下進(jìn)行，防止溫度過高引起蛋白質(zhì)變性失活六、樣品處理的過程第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)姓名：鄒家奕學(xué)號(hào)：2014150005班級(jí)：2014級(jí)醫(yī)檢1班第一節(jié)蛋白質(zhì)分離與純化三、低分辨率操作單元低分辨率操作單元鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法選擇性沉淀第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)鹽析法

中性鹽（固體粉末或飽和溶液）緩慢加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)水化膜被破壞，形成沉淀。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、成本低、使用范圍廣、不易造成蛋白質(zhì)失活缺點(diǎn)：分辨率較差（通常作為初步的分離純化）eg：血清中的白蛋白和球蛋白分離第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)水化膜蛋白質(zhì)屬高分子化合物，其顆粒大小已達(dá)到膠粒范圍（1~100nm），由蛋白質(zhì)形成的溶液是一種穩(wěn)定的親水膠體溶液。蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素為蛋白質(zhì)表面的水化膜和同種電荷。蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)形成的水化膜將蛋白質(zhì)顆粒彼此隔開，加之蛋白質(zhì)在非等電狀態(tài)時(shí)，帶同種電荷互相排斥也不致聚集而沉淀。第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)鹽的加入方式?1.加入固體鹽法,用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；固體研細(xì)后緩慢加入,防泡沫,要平衡.?2.加入飽和溶液法,用于要求飽和度不高而原來(lái)溶液體積不大的情況；使用飽和鹽溶液，要求鹽析范圍小于50%飽和度?3.

透析鹽析.屬于透析平衡法,先將鹽析的Pr溶液樣品裝于透析袋中，然后放入一定濃度的鹽溶液中,或浸入飽和硫酸銨中進(jìn)行透析，由于滲透壓的作用,透析袋內(nèi)硫酸銨飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后，目的蛋白析出，停止透析。第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)鹽析注意事項(xiàng)1.鹽析的成敗決定于溶液的pH值與離子強(qiáng)度，溶液pH值越接近蛋白的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)越容易沉淀。2.鹽析一般用的硫酸銨，平鋪放入烤箱內(nèi)60攝氏度烘干后再稱量，這樣更準(zhǔn)確。3.在加入鹽時(shí)應(yīng)該緩慢均勻，攪拌也要緩慢，越到后來(lái)速度應(yīng)該更注意緩慢，如果出現(xiàn)一些未溶解的鹽，應(yīng)該等其完全溶解后再加鹽。4.鹽析后最好攪拌40分鐘到一個(gè)小時(shí)而且再在冰浴中放置一段時(shí)間。5.鹽析后的蛋白質(zhì)最好盡快脫鹽處理，以免變性。6.一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸銨濃度在70%左右。第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)有機(jī)溶劑沉淀法（必須在低溫下進(jìn)行）

有機(jī)溶劑通過剝奪蛋白質(zhì)表面的水化膜使蛋白質(zhì)沉淀優(yōu)點(diǎn)：分辨率比鹽析法高缺點(diǎn)：容易使蛋白質(zhì)失活eg:血液制品低溫乙醇工藝第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)有機(jī)溶液沉淀法的影響因素1、有機(jī)溶劑的選擇在實(shí)際生產(chǎn)中，常用的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮、異丙酮、氯仿等。丙酮的介電常數(shù)小，沉淀能力強(qiáng)；而乙醇無(wú)毒，廣泛應(yīng)用于藥品生產(chǎn)中。2、溫度的控制有機(jī)溶劑沉淀時(shí)，溫度是重要的控制指標(biāo)。根據(jù)沉淀對(duì)象的不同，采用的溫度不同，為防止蛋白質(zhì)在較高溫度時(shí)發(fā)生變性，一般要求在低溫下進(jìn)行。第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)有機(jī)溶液沉淀法的影響因素3、PH值等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最低。在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)，應(yīng)選擇ph值在等電點(diǎn)附近。4、離子強(qiáng)度在有機(jī)溶劑和水的混合液中，鹽在一定的濃度范圍內(nèi)能增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度，使有機(jī)溶液沉淀率降低。第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)選擇性沉淀根據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)可以有選擇的使某些蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀優(yōu)點(diǎn)：不經(jīng)過色譜純化，粗提得到的熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)接近純凈缺點(diǎn)：只對(duì)某些特定蛋白有效eg:大腸桿菌表達(dá)的外源性耐熱蛋白純化第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)姓名：廖瑩學(xué)號(hào)：2014150064班級(jí)：2014級(jí)醫(yī)檢1班第一節(jié)蛋白質(zhì)分離與純化四、高分辨率操作單元（一）離子交換色譜分離原理蛋白質(zhì)色譜技術(shù)技術(shù)種類高分辨率操作單元第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)蛋白質(zhì)色譜技術(shù)概念：

分離原理：

利用蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少、疏水作用力的強(qiáng)弱以及親和力等物理化學(xué)特性不同，理化性質(zhì)相差不大的蛋白質(zhì)混合物組分經(jīng)過與填料成千上百次的結(jié)合—解離而得到分離。流動(dòng)相在柱中往下流動(dòng)時(shí)，已被結(jié)合在柱頂端顆粒上的A和B部分被重新結(jié)合在顆粒上，就這樣隨著流動(dòng)相的不斷加入，在色譜中就不斷發(fā)生結(jié)合、解離、再結(jié)合、在解離。第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)

技術(shù)分類根據(jù)填料根據(jù)色譜柱大小根據(jù)原理常壓色譜中壓色譜高壓色譜分析型色譜柱制備色譜柱工業(yè)制備柱離子交換色譜親和色譜凝膠過濾色譜等第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)高效液相色譜儀的原理高效液相色譜儀第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)什么是離子交換色譜？

是利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異，所帶電荷性質(zhì)和電荷量不同，因此與具有相反離子交換材料的結(jié)合強(qiáng)度不同，被流動(dòng)相洗脫保留時(shí)間不同，從而達(dá)到分離目的的一種層析技術(shù)

基于

第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)分子之間電荷的差異電荷量的影響因素可解離基團(tuán)的性質(zhì)、數(shù)量以及溶液PH的影響第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)離子交換填料的組成第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)定義：固體支持物，賦予填料形狀，一般為球形。選擇條件：1.盡可能小的非特異性吸附；2.表面高度親水；3.具有相當(dāng)量的化學(xué)基團(tuán)可供活化；4.具有較好的物理化學(xué)穩(wěn)定性；5.具有良好機(jī)械強(qiáng)度的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

分類：樹脂、纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺等基質(zhì)第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)電荷基團(tuán)對(duì)陰、陽(yáng)離子交換填料的選擇對(duì)強(qiáng)、弱離子交換填料的選擇強(qiáng)酸或強(qiáng)堿型離子交換填料適用的PH范圍較廣，常用于制備去離子水和分離一些小分子物質(zhì)或在極端PH下物質(zhì)的分離。由于弱酸或弱堿型離子交換填料不易使蛋白質(zhì)失活，因此蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的分離一般采用弱酸或弱堿型離子交換填料取決于被分離物質(zhì)在其穩(wěn)定的PH下所帶電荷正電荷陽(yáng)離子交換填料負(fù)電荷陰離子交換填料第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)離子交換填料相關(guān)指標(biāo)這些指標(biāo)有什么意義？分析速度！第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)緩沖液的選擇第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)緩沖液的選擇第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)離子交換過程離子交換層析第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)離子交換色譜操作流程為什么要荷壓裝柱？為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時(shí)分層，同時(shí)使柱床壓緊，減少死體積，有利于分辨率的提高?；€？第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)洗脫等濃度洗脫分段洗脫梯度洗脫第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)色譜柱的選擇宜采用短柱，減少擴(kuò)散。如果要增加柱床體積，宜增加柱子直徑階段洗脫時(shí)尤其要注意使用短柱，以避免梯度的急劇變化，降低分辨率連續(xù)梯度洗脫時(shí)，適當(dāng)?shù)脑黾又L(zhǎng)可增加分辨率第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)小結(jié)幾乎所有生物大分子都是極性的，都可使其帶電，因此離子交換法已廣泛的應(yīng)用于生物大分子的分離純化第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)姓名：何容秀學(xué)號(hào)：2014150026班級(jí)：2014級(jí)醫(yī)檢1班第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)第一節(jié)蛋白質(zhì)分離與純化四、高分辨率操作單元（二）親和色譜原理將一對(duì)能可逆結(jié)合和解離生物分子的一方作為配基（也稱為配體），與具有大孔徑、親水性的固相載體相偶聯(lián)、制成專一的親和吸附劑，再用此親和吸附劑填充色譜柱，當(dāng)含有被分離物質(zhì)的混合物隨著流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱時(shí)，親和吸附劑上的配基就有選擇地吸附能與其結(jié)合的物質(zhì)，而其他的蛋白質(zhì)及雜質(zhì)不被吸附，從色譜柱中流出，使用適當(dāng)?shù)木彌_液使被分離物質(zhì)與配基解吸附，即可獲得純化的目的產(chǎn)物。第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)親和色譜填料第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)基質(zhì)間隔臂配體基質(zhì)的定義基質(zhì)是一種剛性、內(nèi)部為多孔結(jié)構(gòu)，表面有大量反應(yīng)基團(tuán)的顆粒物質(zhì)，用于支撐間隔臂和配體。第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)基質(zhì)基質(zhì)的選擇理想的基質(zhì)應(yīng)符合下面的要求極低的非特異性吸附。高度的親水性較好的理化穩(wěn)定性大量的化學(xué)基因能被有效地活化，而且容易和配體結(jié)合。適當(dāng)?shù)亩嗫招?/p>

一般親和吸附劑采用的基質(zhì)有纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖、交聯(lián)瓊脂糖，多空玻璃珠。第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)配體的選擇

1.配體與待分離的物質(zhì)有適當(dāng)?shù)挠H和離

2.配體與待分離的物質(zhì)之間的親和力要有較強(qiáng)的特異性

3.配體要能夠與基質(zhì)穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合

4.配體自身具有較好的穩(wěn)定性

配體的選擇配體分離蛋白抗原抗體抗體抗原、病毒、細(xì)胞蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G免疫球蛋白蛋白酶抑制劑、底物蛋白酶三嗪染料脫氫酶、激酶、白蛋酶、干擾素凝聚劑多糖，糖蛋白、細(xì)胞表面因子受體、細(xì)胞核酸互補(bǔ)堿基序列、組蛋白、核酸結(jié)合蛋白激素、維生素受體，載體蛋白螯合金屬離子含有組氨基，半光氨基、色氨基殘基的蛋白質(zhì)酶底物類似物、抑制劑輔助因子肝素脂蛋白、脂肪酶、甾體受體、限制性核酸內(nèi)切酶、抗凝血酶第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)配體的固相化接臂活化第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)活化第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)接臂第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)大分子蛋白質(zhì)或者其他帶有氨基的大分子為配體，可直接偶聯(lián)于瓊脂上。小分子化合物為配體時(shí)，由于基質(zhì)的空間位阻效應(yīng)，影響陪體與蛋白質(zhì)的結(jié)合，間隔分子第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)親和色譜操作技術(shù)樣品制備第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)基本特點(diǎn)第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)優(yōu)點(diǎn)純化過程簡(jiǎn)單，迅速，且分離效率高。特別使用與分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子。純化倍數(shù)大，產(chǎn)物純度高缺點(diǎn)價(jià)格相對(duì)較貴。必須針對(duì)某一分離對(duì)象制備專一的配備及尋求穩(wěn)定的層析條件。在洗脫中，交聯(lián)在層析介質(zhì)上的配基可能脫落并進(jìn)入產(chǎn)品中從而造成不良影響，如抗體，染料等配基。第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)姓名：田景艷學(xué)號(hào)：2014150071班級(jí)：2014級(jí)醫(yī)檢1班第一節(jié)蛋白質(zhì)分離與純化四、高分辨率操作單元（三）凝膠色譜目的要求：1、熟練凝膠色譜分離的基本原理；2、掌握凝膠柱色譜填充的裝柱、平衡、加樣、洗脫等基本操作技術(shù)；3、掌握做好本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵及注意事項(xiàng)；4、凝膠色譜分離有何特點(diǎn)和用途。第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)1、凝膠色譜法分離原理：凝膠色譜是利用某些凝膠對(duì)于不同組分因分子大小不同而阻滯作用不同的差異而進(jìn)行分離的技術(shù)。當(dāng)溶液在色譜柱內(nèi)流動(dòng)時(shí)，各種物質(zhì)分子在柱內(nèi)同時(shí)進(jìn)行向下的移動(dòng)和不定向的分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。體積大小分有三種情況，一是分子很小，能進(jìn)入分子篩全部的內(nèi)孔隙;二是分子很大，完全不能進(jìn)入凝膠的任何內(nèi)孔隙;三是分子大小適中，能進(jìn)入凝膠的內(nèi)孔隙中孔徑大小相應(yīng)的部分，因此，在流動(dòng)過程中不斷地進(jìn)出于膠粒的微孔，這樣就使小分子物質(zhì)向下流動(dòng)的速度落后于大分子物質(zhì)，從而使溶液中的各組分按分子量從大到小順序先后流出色譜柱，達(dá)到分離純化的目的。2、凝膠色譜填料分類1）葡萄糖凝膠

SephadexG交聯(lián)葡聚糖的商品名為Sephadex，不同規(guī)格型號(hào)的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍。SephadexLH-20，是─SephadexG-25的羧丙基衍生物，能溶于水及親脂溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。（2）聚丙烯酸胺是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的，凝膠色譜法經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成粒狀，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號(hào)的凝膠。交聯(lián)劑越多，孔隙越小。（3）瓊脂凝膠胺脂糖凝膠商品名很多，常見的有，Sepharose(瑞典，pharmacia)，凝膠色譜法Bio-Gel-A(美國(guó)Bio-Rad)等。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級(jí)鏈如氫鍵來(lái)維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下，它的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，可以在許多條件下使用(如水，pH4-9范圍內(nèi)的鹽溶液)。瓊脂糖凝膠在40℃以上開始融化，也不能高壓消毒，可用化學(xué)滅菌活處理。（4）復(fù)合凝膠凝膠色譜填料分類第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)凝膠色譜條件：（1）凝膠調(diào)料的選擇（2）流動(dòng)相與洗脫模式（3）上樣量（4）流速（5）柱直徑和長(zhǎng)度第九章蛋白質(zhì)分離技術(shù)3、注意事