神經(jīng)節(jié)苷脂誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬性死亡

神經(jīng)節(jié)苷脂誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬性死亡馬明明;王雪晶;丁雪冰;張錢林;賀爽;張杰文(GM1)U251GM1U251MTTMDCLC3-Ⅱ的表達(dá);WesternblottingLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值、Lamp-2a、Beclin-1,GM148h,U251細(xì)胞存活率明顯降低,且具有劑量依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與對照組相比,GM148h,U251LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值、Lamp-2aBeclin-1的表達(dá)水平明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)GM1U251【期刊名稱】《腫瘤基礎(chǔ)與臨床》【年(卷),期】2012(025)004【總頁數(shù)】3頁(P281-283)【關(guān)鍵詞】自噬性死亡;神經(jīng)節(jié)苷脂;U251細(xì)胞【作者】馬明明;王雪晶;丁雪冰;張錢林;賀爽;張杰文【作者單位】河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河南,鄭州,450003;鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河南,鄭州,450052;河南省人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科,河南,鄭州,450003;河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河南,鄭州,450003;河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河南,鄭州,450003;河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河南,鄭州,450003【正文語種】中文【中圖分類】R730.264;R730.23神經(jīng)節(jié)苷脂(monosialotetrahexosy1ganglioside，GM1)是哺乳類動(dòng)物細(xì)胞膜的重要組成部分。以往研究［1GM1目前研究［2GM1U251GM1U251細(xì)胞培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)12%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，置于37℃、體5%CO21～2190%后，以消化液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0．30%胰蛋白酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0．05%EDTA)消化，1∶4比例稀釋、培養(yǎng)。MTTU251963×103/孔)，次日對照組給予常規(guī)DMEM培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分為5個(gè)濃度組，分別加入0、50100、250μg·mL－1GM1，448h10μLMTT90μLDMEM，37℃2h150μLDMSO570nmA/A×100%。0、50、100、250μg·mL－1GM1，48hPBSAnnexin120μL，8μLAlexaFluor488AnnexinⅤ和2μL100μg·mL－1PI工作液，室溫下孵育15min，向標(biāo)本中加入400μLAnnexin結(jié)合緩沖液，在冰上輕輕混勻，立即將標(biāo)本用流式細(xì)胞儀分析。Westernblot250μg·mL－1GM12448h細(xì)胞，提取總蛋白并檢測。經(jīng)SDS電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜后封閉，一抗4℃過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗，雜交爐孵育2h，暗室中行X線膠片曝光，GAPDH設(shè)為內(nèi)參。U2511245min15%BSA(0．25%TritoX-100)封閉，PBS3Hochest33258(1∶10000)，3min，用OlympusIX70SPSS13．0ˉx±stα=0．05。GM1U251MTT0、50、100、250μg·mL－1GM148hU251(98．0±8．2)%、(79．3±12．2)%、(62．2±14．3)%、(51．2±7．3)%;與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0．051。GM1U2510、50100、250μg·mL－1GM148h后，U251細(xì)胞凋亡率為(2．1±0．3)%、(4．0±0．5)%、(20．1±8．1)%、(40．2±7．0)%;與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0．052。WesternblotLC3、Lamp-2a、Beclin-1GM1LC3-Ⅱ表達(dá)水平，250μg·mL－1GM10、24、48hLC3-Ⅱ表達(dá)水平逐漸上調(diào)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值逐漸上調(diào)，明顯高于對照組(P＜0．05);與對照組相比，Lamp-2aP＜0．05);與對照組相比，Beclin-10．05。LC3-Ⅱ表達(dá)熒光顯微鏡下可見，250μg·mL－1GM1給藥0、48h后，U251細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)LC3-Ⅱ表達(dá)高亮點(diǎn)，呈顆粒狀聚集，說明自噬體形成，而對照組無此現(xiàn)象。見圖4。細(xì)胞有2種死亡方式:細(xì)胞壞死和程序性細(xì)胞死亡，其中程序性細(xì)胞死亡有Ⅰ型(細(xì)胞凋亡)和Ⅱ型(自噬性細(xì)胞死亡)2種［3]。自噬是指溶酶體降解利用細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)成分的過程［4]。細(xì)胞自噬的主要生理功能是及時(shí)清除細(xì)胞中產(chǎn)生的"垃圾"(如破損或衰老的細(xì)胞器、折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)等)，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。因此，無論是腫瘤細(xì)胞還是正常細(xì)胞，保持一種基礎(chǔ)低水平的自噬活性對細(xì)胞的生理活動(dòng)至關(guān)重要，但過度細(xì)胞自噬則引起細(xì)胞的過量損傷導(dǎo)致細(xì)胞死亡［5]。神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤60%為膠質(zhì)瘤，惡性膠質(zhì)瘤預(yù)后差，平均生存周期不超過1a［6]。手術(shù)是膠質(zhì)瘤的主要治療方式，但侵襲到遠(yuǎn)處的瘤細(xì)胞，往往難以清除，是唑胺能夠誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，3－甲基腺嘌呤在抑制替莫唑胺誘導(dǎo)自噬bafilomycinA1caspase-3BNIP3［8]。姜黃素能夠抑制該通路誘導(dǎo)自噬性惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡從而產(chǎn)生抗腫瘤效果［9]。原人參萜AktU87MGGM1U251GM1U251U251U251過程;為GM1治療惡性腦膠質(zhì)瘤提供了新的理論依據(jù)?！鞠嚓P(guān)文獻(xiàn)】［1]KarpiakSE，MahadikSP．ReductionofcerebraledemawithGM1ganglioside［J]．JNeurosciRes，1984，12(2/3):485－492．［2]LedeenRW，WuG．GM1ganglioside:anothernuclearlipidthatmodulatesnuclearcalcium．GM1potentiatesthenuclearsodiumcalciumexchanger［J]．CanJPhysiolPharmacol，2006，84(3/4):393－402．［3]BurschW．Theautophagosomal-lysosomalcompartmentinprogrammedcelldeath［J]．CellDeathDiffer，2001，8(6):569－581．［4]SapunarD，VilovicK，EnglandM，etal．Morphologicaldiversityofdyingcellsduringregressionofthehumantail［J]．AnnAnat，2001，183(3):217－222．［5]LiF，VierstraRD．Autophagy:amultifacetedintracellularsystemforbulkandselectiverecycling［J]．TrendsPlantSci，2012．［6]SchwartzbaumJA，F(xiàn)isherJL，AldapeKD，etal．Epidemiologyandmolecularpathologyofglioma［J]．NatClinPractNeurol，2006，2(9):494－503．［7]KanzawaT，GermanoIM，KomataT，etal．Roleofautophagyintemozolomide-inducedcytotoxicityformalignantgliomacells［J]．CellDeathDiffer，2004，11(4):448－457．［8]KanzawaT，ZhangL，XiaoL，etal．ArsenictrioxideinducesautophagiccelldeathinmalignantgliomacellsbyupregulationofmitochondrialcelldeathproteinBNIP3［J]．Oncogene，2005，24(6):980－991．［9]ShinojimaN，YokoyamaT，KondoY，etal．RolesoftheAkt/mTOR/p70S6KandERK1/2signalingpathwaysincurcumin-inducedautophagy［J]．Autophagy，2007，3