食品發(fā)酵工程介紹

發(fā)酵的定義狹義“發(fā)酵”的定義在生物化學(xué)或生理學(xué)上發(fā)酵是指微生物在無(wú)氧條件下，分解各種有機(jī)物質(zhì)產(chǎn)生能量如葡萄糖在無(wú)氧條件下被微生物利用產(chǎn)生酒精并放出二氧化碳。同時(shí)獲得能量，丙酮酸被復(fù)原為乳酸而獲得能量等等。廣義“發(fā)酵”的定義工業(yè)上所稱的發(fā)酵是泛指利用生物細(xì)胞制造某些產(chǎn)品或凈化環(huán)境的過(guò)程，它包括厭氧培育的生產(chǎn)過(guò)程，如酒精、丙酮丁醇、乳酸等，以及通氣〔有氧〕培育的生產(chǎn)過(guò)程，如抗生素、氨基酸、酶制劑等的生產(chǎn)。產(chǎn)品即有細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也包括菌體細(xì)胞、酶等。發(fā)酵工程〔FermentationEngineering〕的定義發(fā)酵工程，是利用“生物細(xì)胞”的特定功能，通過(guò)現(xiàn)代工程技術(shù)手段〔主要是發(fā)酵罐生產(chǎn)各種特定的有用物質(zhì)，或者把微生物直接用于某些工業(yè)化生產(chǎn)的一種生物技術(shù)體系。這里的“生物細(xì)胞”包括微生物細(xì)胞和動(dòng)物、植物細(xì)胞及其固定化細(xì)胞。因此，發(fā)酵工程使?jié)B透有工程學(xué)的微生物學(xué)，是發(fā)酵技術(shù)的工程化。發(fā)酵工程是化學(xué)工程與生物工程技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，它將微生物學(xué)、生物化學(xué)、化學(xué)工程學(xué)等的根本原理和技術(shù)有機(jī)地結(jié)合在一起，利用微生物進(jìn)展規(guī)?；a(chǎn)，是生產(chǎn)加工與生物制造實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的核心技術(shù)。發(fā)酵工程技術(shù)主要包括供給高性能生產(chǎn)菌種的菌種技術(shù)、實(shí)現(xiàn)低本錢大規(guī)模生產(chǎn)產(chǎn)品的發(fā)酵技術(shù)和最終獲得合格產(chǎn)品的分別純化技術(shù)。進(jìn)展發(fā)酵工程的關(guān)鍵技術(shù)〔菌種技術(shù)、發(fā)酵技術(shù)和分別技術(shù)〕及重大產(chǎn)品的爭(zhēng)論開發(fā)，將發(fā)揮中國(guó)豐富的生物資源優(yōu)勢(shì)，提高發(fā)酵工程的技術(shù)水平，促進(jìn)生物化工、生物醫(yī)藥、食品加工等相關(guān)行業(yè)的產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)力和可持續(xù)進(jìn)展。1.4特點(diǎn)〔1〕發(fā)酵工程使用的原料來(lái)源廣泛，多為農(nóng)副產(chǎn)品，其中以碳源為主，只參加少量有機(jī)和無(wú)機(jī)氮源，不含有毒物質(zhì)?！?〕發(fā)酵工程的反響過(guò)程比較溫順，通常在常溫、常壓下進(jìn)展。而且，反響過(guò)程是以生物體的自身調(diào)整方式進(jìn)展，多個(gè)反響就像是一個(gè)反響一樣，可在單一設(shè)備中進(jìn)展，因此一種設(shè)備可有多種用途?！?〕簡(jiǎn)潔進(jìn)展簡(jiǎn)單的高分子化合物的生產(chǎn)，如酶、化學(xué)活性體等?！?〕能夠高度選擇性地進(jìn)展復(fù)制化合物在特定部位的反響，如甾體化合物的氧化、復(fù)原等?！?〕生產(chǎn)產(chǎn)品的微生物菌體本身也可作為發(fā)酵產(chǎn)物。例如，富含蛋白質(zhì)、酶、維生素的單細(xì)胞蛋白等?！?〕發(fā)酵過(guò)程是純種培育過(guò)程。生產(chǎn)中使用的設(shè)備、管道、截門和培育基都必需嚴(yán)格滅菌，通入的空氣也應(yīng)當(dāng)是無(wú)菌空氣。在操作中應(yīng)特別留意嚴(yán)格防止污染，尤其要防止噬菌體的侵入，否則，會(huì)引起重大的損失?！?〕生產(chǎn)力量，可以到達(dá)事半功倍的效果。〔8〕在發(fā)酵生產(chǎn)中，還可以通過(guò)改進(jìn)工藝技術(shù)和設(shè)備來(lái)提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。發(fā)酵工程的進(jìn)展史自然發(fā)酵階段微生物純培育技術(shù)的建立微生物液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)的建立微生物酶轉(zhuǎn)化及代謝調(diào)控技術(shù)的應(yīng)用微生物發(fā)酵原料的拓寬微生物基因工程育種初級(jí)代謝產(chǎn)物和代謝調(diào)控中起作用的各種物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)、多糖和核酸等次級(jí)代謝產(chǎn)物通常是在生長(zhǎng)后期合成。次級(jí)代謝產(chǎn)物是通過(guò)次級(jí)代謝合成的產(chǎn)物，如抗生素、生物堿、色素、激素和毒素等，這些產(chǎn)物是對(duì)微生物本身無(wú)明顯生理作用或?qū)ψ陨砩L(zhǎng)是非必需的，但對(duì)產(chǎn)生菌的生存可能有肯定價(jià)值。次級(jí)代謝產(chǎn)物與初級(jí)代謝產(chǎn)物的關(guān)系次級(jí)代謝產(chǎn)物和初級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)生殖作用雖然不同，但它們的生物合成途徑是相互關(guān)聯(lián)的。初級(jí)代謝中產(chǎn)生的一些小分子化合物是全部次級(jí)代謝途徑中的原料，即通過(guò)初級(jí)代謝中的糖酵解、三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑等所產(chǎn)生的物質(zhì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化和合成一系列有著不同化學(xué)構(gòu)造和性質(zhì)的次級(jí)代謝產(chǎn)物。2-1中簡(jiǎn)要說(shuō)明白初級(jí)代謝途徑與次級(jí)代謝途徑的聯(lián)系與區(qū)分。2.1.1.2工業(yè)發(fā)酵常見(jiàn)微生物及其代謝產(chǎn)物1)細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物放線菌及其代謝產(chǎn)物霉菌及其代謝產(chǎn)物酵母菌及其代謝產(chǎn)物工業(yè)發(fā)酵對(duì)生產(chǎn)菌種的一般要求〔1〕安全性?！?〕有在較短的發(fā)酵周期內(nèi)產(chǎn)生大量發(fā)酵產(chǎn)物的力量?！?〕物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率，削減分別純化的難度，降低本錢，提高產(chǎn)品的質(zhì)量。〔4〕生長(zhǎng)生殖力量強(qiáng)，生長(zhǎng)、反響速度快，發(fā)酵周期短，產(chǎn)孢菌應(yīng)具有較強(qiáng)的產(chǎn)孢子力量。〔5〕原料來(lái)源廣，價(jià)格低廉，菌種能高效地將原料轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品?！?〕對(duì)需要添加的前體物質(zhì)有耐受力量，并不能將前體作為一般碳源利用。〔7〕菌種純，遺傳特性穩(wěn)定，抗噬菌體力量強(qiáng)，以保證發(fā)酵生產(chǎn)和產(chǎn)品的穩(wěn)定性。工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)菌種來(lái)源從自然界分別篩選從菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得。從生產(chǎn)過(guò)程中已有菌種中篩選發(fā)生正突變的優(yōu)良菌種。菌種選育種變異，再經(jīng)過(guò)篩選而到達(dá)菌種改進(jìn)的目的。菌種選育方法主要包括自然選育、誘變育種、雜交育種和基因工程育種。自然選育〔自然分別〕的一般程序，是把菌種制備成單孢子懸浮液，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)南♂屢院?，在固體平板上進(jìn)展分別，挑取局部單菌落進(jìn)展生產(chǎn)力量的測(cè)定，經(jīng)反復(fù)篩選，以確定生產(chǎn)力量更高的菌株代替原來(lái)的菌株。自然選育的菌種來(lái)源于自然界、菌種保藏機(jī)構(gòu)或生產(chǎn)過(guò)程，從自然界中選育菌種的過(guò)程較為簡(jiǎn)單，而從生產(chǎn)過(guò)程或菌種保藏機(jī)構(gòu)得到菌種的自然選育過(guò)程較為簡(jiǎn)潔。因此，下面以從自然界中選育菌種的過(guò)程為例，闡述菌種自然選育的主要步驟。其具體做法一般分為四個(gè)步驟：樣品采集、增殖培育、純種分別和篩選等。假設(shè)產(chǎn)物與食品制造有關(guān)，還要對(duì)菌種進(jìn)展毒性鑒定，見(jiàn)圖2-2。采樣平板分別增殖培育原種斜面或平板分別 原種斜面或復(fù)篩 原種斜面增殖培育平板分別平板分別原種斜面原種斜面再?gòu)?fù)篩初步工藝條件摸索定性或初篩較優(yōu)菌株半定量進(jìn)一步的生產(chǎn)性能試驗(yàn)和毒性試驗(yàn)2-2半定量進(jìn)一步的生產(chǎn)性能試驗(yàn)和毒性試驗(yàn)增加分別的概率，增加該菌種的數(shù)量，稱為富集培育。常用的純種分別方法有三種，即劃線分別法、稀釋分別法和組織分別法。誘變育種的一般步驟利用各種誘變劑處理微生物細(xì)胞，提高基因的隨機(jī)突變頻率，擴(kuò)大變異幅度，通過(guò)肯定的篩選方法，獵取所需要優(yōu)良菌株的過(guò)程，稱為誘變育種。誘變育種包括誘變和篩選兩個(gè)局部。誘變局部包括由動(dòng)身菌株開頭，制出穎孢子懸浮液〔或細(xì)菌懸液〕作誘變處理，然后以肯定稀釋度涂平皿，至平皿上長(zhǎng)出單菌落等各步驟。因誘發(fā)突變是使用誘變劑促使菌種發(fā)生突變，所以誘發(fā)所形成的突變與菌種本身的遺傳背景、誘變劑種類及其劑量的選擇和合理使用方法均有親熱關(guān)系，亦可說(shuō)這三者是誘變局部的關(guān)鍵所在。篩選局部包括經(jīng)單孢子分別長(zhǎng)出單菌落后隨機(jī)挑至斜面，經(jīng)初篩和復(fù)篩進(jìn)展生產(chǎn)能力測(cè)定和菌種保存〔馬上篩選出來(lái)的高產(chǎn)菌種保藏好。因此，可以認(rèn)為，誘變育種的整個(gè)過(guò)程主要是誘變和篩選的不斷重復(fù)，直到獲得比較抱負(fù)的高產(chǎn)菌株。最終經(jīng)考察其穩(wěn)定性、菌種特性、最適培育條件等后，再進(jìn)一步進(jìn)展中試、放大。誘變育種應(yīng)留意的問(wèn)題誘變成功的關(guān)鍵包括動(dòng)身菌株的選擇、誘變劑種類和劑量的選擇，以及合理的使用方法等。紫外線誘變的步驟與方法：①制備菌懸液以處于對(duì)數(shù)期的細(xì)菌斜面、孢子剛成熟的霉菌或放線菌為動(dòng)身菌，16~24h，霉菌、放線菌培育到絕大局部孢子剛剛萌發(fā)。然后，離心除去液體培育基，用生理鹽水制備菌懸液，參加玻璃珠振蕩分散，以無(wú)菌濾紙或脫脂棉花過(guò)濾，使形成單細(xì)胞，分散程度達(dá)90108個(gè)/m107~108個(gè)/m，106~107個(gè)/mL②紫外線照耀處理前，先開紫外燈預(yù)熱20min，使光波穩(wěn)定。然后，取3mL菌懸液置于7cm培育皿中，并置于誘變箱內(nèi)的磁力攪拌器上，離燈管肯定距離，翻開皿蓋，暴露于紫外線下照耀肯定時(shí)間，邊照耀邊攪拌，力求使細(xì)胞均勻吸取紫外線光波。照耀過(guò)程必需在備有黃光或紅光的暗室內(nèi)進(jìn)展，以免光復(fù)活。經(jīng)過(guò)紫外線誘變后的菌體轉(zhuǎn)入無(wú)菌試管內(nèi)，置于冰水中浸1~2h，由于細(xì)胞參與對(duì)突變修復(fù)的各種酶類活性在低溫條件下受到抑制，使修復(fù)難以進(jìn)展，有利于提高突變率。③后培育與稀釋涂布照耀完畢的菌懸液參加到適合的培育基中，在適宜溫度下暗培育1.5~2.0h，培育完畢后，從中吸取肯定量培育物按肯定稀釋度進(jìn)展稀釋，然后以待篩選。亞硝基胍〔NTG〕誘變亞硝基胍為黃色結(jié)晶狀物質(zhì)，性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光易分解，放出NO，顏色由黃色變?yōu)榫G色，誘變效應(yīng)會(huì)降低。因此，亞硝基胍須保存在棕色瓶中，并在避光、枯燥、低溫條件下貯存。亞硝基胍不溶于水，須加助溶劑，使用時(shí)現(xiàn)配現(xiàn)用。亞硝基胍有“超誘變劑”之稱，能使細(xì)胞發(fā)生一次或?qū)掖瓮蛔?，誘變效果好，尤其適合于誘發(fā)養(yǎng)分缺陷型突變株。另外，亞硝基胍還能使多基因并發(fā)突變，在復(fù)制叉四周一個(gè)基因突變能誘發(fā)鄰近位置的基因間續(xù)連鎖突變亞硝基胍在水溶液中隨著不同的pH將產(chǎn)生不同的分解產(chǎn)物，從而影響誘變效應(yīng)。pH5.5時(shí)，NTGHNO2，HNO2本身就具有誘變作用；當(dāng)溶液pH8.0以上時(shí)，NTG會(huì)分解產(chǎn)生CH2N2，對(duì)核酸起烷化作用，引起微生物突變；當(dāng)溶液pH6.0時(shí)，NTG本身和DNApH6.0的條件下進(jìn)展誘變處理。由于酸堿條件影響NTG的誘變效果，配制NTG溶液常用適宜的緩沖液，如磷酸緩沖液和Tris緩沖液。NTG是一種猛烈的致癌物質(zhì)，操作時(shí)肯定要穿工作服，戴橡皮手套、口罩，用稱量瓶稱量，最好在通風(fēng)櫥中進(jìn)展。但凡接觸過(guò)NTG的器皿必需準(zhǔn)時(shí)、單獨(dú)處理，例如1~2mol/LNaOH2%的Na2S2O3浸泡過(guò)夜，洗凈。NTG的誘變處理方法：①取穎的斜面，用肯定pH的磷酸緩沖液或Tris緩沖液洗下菌苔制備菌懸液。②配制NTG母液：由于NTG不溶于水，配制時(shí)需加甲酰胺或丙酮等助溶劑少許，然后加緩溶液，其比例為9:〔緩沖溶液9mNTG丙酮溶液1m，一般NTG母1mg/mL100~1000μg/mL，放線菌、1000~3000μg/mL。③將以上菌懸液和NTG〔30~35℃，真菌25~28℃，放線菌30~32℃〕20~60min，孢子為90~120min。終止反響時(shí)，用冷的生理鹽水稀釋到50倍以上或在低溫下進(jìn)展離心洗滌，去除藥液，加無(wú)菌水使沉淀懸液并制成肯定稀釋度，涂布于平板。菌種保藏的根本原理