第8章 抗體的制備及應(yīng)用

第八章抗原抗體反應(yīng)

及應(yīng)用一、抗體的制備抗體的一些基本概念單克隆抗體

(MonoclonalAntibody,McAb)

單個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所分泌的抗體多克隆抗體

(PolyclonalAntibody)

多個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所分泌的抗體

抗原（antigen，Ag）表位，抗原結(jié)合位點(diǎn)，抗原決定簇（epitope）Ag1234Ag

單克隆抗體

B1B2B3B4B3B3B3B32

多克隆抗體341單克隆抗體的特點(diǎn)特異性強(qiáng)，具有抗原結(jié)合位點(diǎn)的專一性。（不是抗原的專一性?。┮蚪Y(jié)合位點(diǎn)的單一性，有時(shí)不易捕捉抗原，一株單克隆抗體與抗原不易產(chǎn)生凝集反應(yīng)或沉淀反應(yīng)。

抗體的性質(zhì)相同，容易純化、標(biāo)記。多克隆抗體的特點(diǎn)

多抗是單抗的混合物，因此多抗的性質(zhì)是一個(gè)群體綜合的性質(zhì)。特異性一般比單抗差因?yàn)橛刹煌再|(zhì)的抗體組成，所以多抗更容易有交叉反應(yīng)。

比單抗更容易捕捉抗原。

因?yàn)楹锌共煌砦坏目贵w，多種抗

體都可與抗原結(jié)合。

抗體的純化、標(biāo)記比單抗難因?yàn)楹懈鞣N不同類型、亞類的抗體，提純、標(biāo)記的方法有所差別。同時(shí)，血清中含有的雜蛋白比較多?？贵w的制備1、單克隆抗體的制備無法采用生物化學(xué)的方法從多抗中分離必須采用細(xì)胞雜交的方法來制備能否篩選到理想的單克隆抗體有技術(shù)問題也有機(jī)遇問題

制備單克隆抗體的基本原理：

致敏的B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞（myeloma）

（能夠分泌特異性的抗體，（不能分泌特異性的抗體，不能在體外長期生存）但能在體外長期生存）

陽性雜交瘤細(xì)胞

(hybridoma)

（既能分泌特異性抗體，又能夠在體外長期生存）克隆化培養(yǎng)

（產(chǎn)生單克隆的陽性雜交瘤細(xì)胞）生產(chǎn)單克隆抗體

12222122、多抗的制備常用的免疫動物免疫的基本步驟如何免疫兔子1）常用的免疫動物兔子（rabbit）：最常用于自制抗體，抗體量較多。（新西蘭,大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗體，但抗體量很少。（BALB/C,昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗體，免疫過程要麻醉動物。（Wistar大鼠）羊（sheep、goat）：常用于較大批量地生產(chǎn)抗體（商品）。馬（horse）：常用于大批量生產(chǎn)治療用抗體（商品）。豚鼠（guineapig）：國外實(shí)驗(yàn)室常用。2）免疫的基本步驟基礎(chǔ)免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全佐劑（含礦物油,卡介苗等)。加強(qiáng)免疫：第2次以后，抗原量減半，多次，間隔2-4周，用佛式不完全佐劑

(不含卡介苗)。取血測效價(jià)：加強(qiáng)免疫兩次或三次以后的第7天取血。放血制備血清：最后一次免疫后7-10天放血。

(在三角瓶中加一些生理鹽水，放血放置一段時(shí)間，凝固，吸取血清，離心，分裝，凍存)

1.周圍6個(gè)孔放不同稀釋度的相應(yīng)Ab。

2.以出現(xiàn)沉淀線的血清最高稀釋倍數(shù)為該抗體的效價(jià)。

3.可進(jìn)行任意稀釋。

抗體效價(jià)滴定3)如何免疫兔子2000g(雌雄均可),健康,無病原（小鼠20g，大鼠200g）基礎(chǔ)免疫0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108顆粒抗原)0.5ml佛式完全佐劑(CFA)（小鼠0.2ml）制備抗原-佐劑乳化液背部、頸部皮下多點(diǎn)注射或腿部肌肉注射（注意：不要剪毛）加強(qiáng)免疫間隔2-4周,可進(jìn)行多次0.5ml抗原(蛋白量減半)0.5ml佛式不完全佐劑(IFA)制備抗原-佐劑乳化液背部、頸部皮下多點(diǎn)注射或腿部肌肉注射免疫3~4次以后從耳靜脈取血檢測效價(jià)酶聯(lián)法：1:104以上，能達(dá)到1:106。免疫雙擴(kuò)散：1:16以上，能達(dá)到1:64效價(jià)達(dá)到要求的可放血制備血清可一次放血(頸動脈)也可多次取血(耳靜脈)

單抗與多抗的區(qū)別

單抗多抗抗體組成單一復(fù)雜

抗體性質(zhì)個(gè)體的屬性群體綜合的性質(zhì)純化標(biāo)記容易，效果好難度高一些種屬來源絕大多數(shù)是小鼠兔子、羊、豚鼠等制備周期長(最短4個(gè)月）短（2個(gè)月）制備技術(shù)復(fù)雜簡單經(jīng)費(fèi)多少什么情況需要制備單抗抗原不純，無法分開多抗效果不好（已排除非特異性反應(yīng)）希望將抗體用于治療，研制成藥品希望將抗體用于診斷，研制成診斷試劑抗體的純化鹽析法（硫酸銨沉淀)辛酸-硫酸銨沉淀法離子交換法親和層析法凝膠過濾法1、鹽析法（硫酸銨沉淀)原理在高濃度中性鹽存在下，蛋白質(zhì)在水中的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀硫酸銨是最常用的中性鹽不同蛋白質(zhì)的鹽析常數(shù)不同硫酸銨的加入量通常以飽和度表示

(100%飽和度:767g/L)主要步驟在血清或腹水中加入硫酸銨使抗體沉淀；4℃高速離心，棄上清，溶解沉淀；

可反復(fù)操作,逐級降低硫酸銨的濃度:50%飽和度:0.313g/ml45%飽和度:0.277g/ml40%飽和度:0.243g/ml最后一次離心后，用少量PBS溶解沉淀，透析，測定濃度。特點(diǎn)成本低，步驟簡單。抗體的回收率比較高?？贵w純度比較低，電泳后可見到明顯的雜帶。需要高速離心機(jī)。2、正辛酸-硫酸銨沉淀法原理兩步沉淀：先加正辛酸去雜蛋白.

正辛酸是一種有機(jī)酸，在酸性條件下(pH4.5)可使大分子的雜蛋白沉淀。后加硫酸銨使抗體沉淀.主要步驟：調(diào)節(jié)樣品的pH值，加入正辛酸(25ul/ml)，攪拌30分。室溫高速離心(10000g，30分鐘)，收集上清液；再加入硫酸銨（40%飽和度）；4℃高速離心(10000g，15分鐘)，棄上清；溶解沉淀，透析，測定濃度。特點(diǎn)成本較低，步驟較復(fù)雜。抗體回收率很低?？贵w純度高，電泳后雜帶很少。需要高速離心機(jī)，耐高速離心的玻璃離心管。3、離子交換法原理利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異進(jìn)行物質(zhì)分離。DEAE是一種陰離子交換劑，自身帶正電荷

(Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基)將樣品的pH值調(diào)至等電點(diǎn)以上，使樣品帶負(fù)電荷.采用鹽溶液洗脫，通過高濃度的帶同種電荷的離子(Cl-)置換被分離的組分.

+++++--------

帶負(fù)電荷的被吸附上帶負(fù)電荷少的先被置換帶負(fù)電荷多的后被置換

NaCl

Tris

梯度混合儀

連續(xù)梯度洗脫:主要步驟

先用硫酸銨沉淀抗體，粗提；將樣品過柱；洗去沒有結(jié)合的物質(zhì)；用梯度NaCl溶液洗脫，等量收集洗脫液；紫外分光光度計(jì)測量，保留A280值明顯升高的樣品；匯集樣品，濃縮，測定濃度。特點(diǎn)成本較低，步驟較簡單。抗體回收率較高?？贵w純度較高，電泳后可見少量雜帶，適合于各種標(biāo)記。純化后抗體體積大，需要濃縮。需要冷柜，自動收集器。4、親和層析法原理利用蛋白質(zhì)之間的特異性結(jié)合（抗體-抗原，受體-配體）將一種配基與凝膠顆粒結(jié)合，捕捉與它相配的物質(zhì)。洗脫一般采用改變pH值的方法使用前樣品結(jié)合(Binding)洗脫(Elution)主要步驟

將ProteinA與活化的柱子相結(jié)合(買商品柱)；將腹水或血清處理后過柱；用結(jié)合緩沖液洗柱子，直到A280值為零；用甘氨酸緩沖液洗脫抗體，等量收集洗脫液；測定洗脫液的A280值，保留A280值明顯升高的樣品；匯集樣品，濃縮，測定濃度。葡萄球菌A蛋白

(staphylococcalproteinA,SPA)金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上的一種蛋白分子量42000,等電點(diǎn)pH5.1可與大多數(shù)動物Ig的Fc段結(jié)合一個(gè)SPA分子有4個(gè)相似的活性部位與IgG的結(jié)合最強(qiáng),與IgM,IgA的結(jié)合較差

特點(diǎn)成本高，步驟較簡單?？贵w回收率低?？贵w純度高，適合于各種標(biāo)記。純化后抗體體積大，需要濃縮。需要自動收集器。5、凝膠過濾法(分子篩)原理將樣品混合物通過一定孔徑的凝膠介質(zhì)，由于流經(jīng)路徑的差異,使不同分子質(zhì)量的組分分離。大分子物質(zhì)直接從凝膠顆粒外通過，走得快；小分子物質(zhì)進(jìn)入凝膠顆粒的內(nèi)部再出來，走得慢。適合于IgM類抗體的純化

(五聚體,分子量約800KD)主要步驟將腹水或血清處理后上柱，樣品要濃；

(可用G-200，柱子要長，80-100cm)待樣品入柱后,用緩沖液過柱；等量收集洗脫液,測定洗脫液的A280值。收集第一峰。特點(diǎn)成本高，步驟較簡單?？贵w回收率較高，分離條件緩和，抗體活性不受影響。抗體純度較高。需要自動收集器。二、抗體酶抗體酶（Abzyme)概念：抗體酶或催化抗體（Catalyticantibody)是一種新型人工酶制劑，是一種具有催化功能的抗體分子，在其可變區(qū)賦予了酶的特性。它是利用現(xiàn)代生物學(xué)與化學(xué)的理論與技術(shù)交叉研究的成果，是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物。IgG與抗原形成

的交聯(lián)晶格抗體酶的催化特征1、與天然酶相比抗體酶的特點(diǎn)能催化一些天然酶不能催化的反應(yīng)有更強(qiáng)的專一性和穩(wěn)定性催化作用機(jī)制不同2、抗體酶和非催化性抗體作用的比較更高的反應(yīng)特異性反應(yīng)的可逆性反應(yīng)過程

普通酶催化作用機(jī)制是“鎖鑰學(xué)說”

及“誘導(dǎo)契合學(xué)說”；

而抗體酶的催化機(jī)制目前還沒有完全搞清楚，Janda曾提出“識別開關(guān)”

機(jī)制，即抗體將底物“釣進(jìn)”抗體結(jié)合部位，然后使其與抗體結(jié)合，打開底物轉(zhuǎn)化為反應(yīng)過渡態(tài)的“開關(guān)”，導(dǎo)致共價(jià)鍵斷裂，形成產(chǎn)物?？贵w酶催化反應(yīng)的介質(zhì)效應(yīng)酯解反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng)：抗體酶在有機(jī)溶劑中具穩(wěn)定性。脫羧反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng)；有機(jī)溶劑引起脫羧反應(yīng)速率增加。?；D(zhuǎn)移反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng)：在疏水溶劑中，活性較高。三、抗體酶的催化反應(yīng)類型1、轉(zhuǎn)酰基反應(yīng)2、水解反應(yīng)3、Claisen重排反應(yīng)4、酰胺合成反應(yīng)5Diels-Alder反應(yīng)6、轉(zhuǎn)酯反應(yīng)7、光誘導(dǎo)反應(yīng)8、氧化還原反應(yīng)9、脫羧反應(yīng)10、順反異構(gòu)化反應(yīng)四、抗體酶的制備1、細(xì)胞融合法：

用設(shè)計(jì)好的半抗原，通過間隔鏈與載體蛋白（如牛血清白蛋白）偶聯(lián)制成抗原；然后對此抗原進(jìn)行免疫，使宿主有機(jī)體針對抗原產(chǎn)生抗體；產(chǎn)生抗體的脾臟細(xì)胞與骨髓細(xì)胞相融合，融合得到的雜交細(xì)胞既能產(chǎn)生抗體又能在體外培養(yǎng)；將雜交體克隆化，即能產(chǎn)生單一均勻的抗體。2、抗體結(jié)合位點(diǎn)化學(xué)修飾法：抗體酶和酶一樣也可以用化學(xué)修飾法加以改造。對抗體酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的關(guān)鍵是找到一種溫和的方法在抗體結(jié)合位置或附近引入具有催化功能的基因。游離巰基就是適合的基團(tuán)之一，它具有高親核性，易于氧化，及能通過二硫化物進(jìn)行交換反應(yīng)或親電反應(yīng)而選擇性修飾的特點(diǎn)。3.引入輔助因子法

很多天然酶活性中心都含有金屬離子。Lerner等將金屬離子引入抗體酶，成功地催化了肽鍵的選擇性水解。他們用Co3+鹽作為金屬離子輔因子，所用半抗原分子帶有一肽鍵，且通過羧根及仲胺基與金屬離子相連。將此半抗原通過共價(jià)鍵連接在載體蛋白免疫動物產(chǎn)生的抗體，在金屬離子復(fù)合物作為輔因子的參與下，這些抗體酶能選擇性水解甘氨酸和丙氨酸之間的肽鍵.用生物工程的方法產(chǎn)生抗體

Fab片斷由輕鏈和重鏈的VH及CH1部分組成，作為一種催化劑，抗體酶有這樣的片斷就行，無須完整的抗體分子。從人或動物的抗原中抽取基因，然后PCR技術(shù)重新鑄造輕鏈和重鏈，這樣就可以把這些基因組合成100萬個(gè)含有成對輕鏈和重鏈的基因庫。這些基因庫是存儲在細(xì)菌里，通過隨機(jī)地將基因和輕重鏈結(jié)合，基因是通過細(xì)菌、酵母、絲狀真菌等表達(dá)出來，就可大量制造Fab片斷了。

5、拷貝法：用酶作為抗原免疫動物得到抗酶的抗體，再將此抗體免疫動物并進(jìn)行單克隆化，獲得單克隆的抗抗體。對抗抗體進(jìn)行篩選，獲得具有原來酶活性的抗體酶。6、共價(jià)抗原免疫法以親和標(biāo)記劑為半抗原，則抗體結(jié)合部位將產(chǎn)生與親和基團(tuán)電荷性質(zhì)相反的基團(tuán)，如親核性，親電性氨基酸，酸性氨基酸，堿性氨基酸等。五、抗體酶的篩選1、ELISA法；用ELISA法篩選對半抗原有親和力的單克隆抗體，然后大量培養(yǎng),分析單克隆抗體的酶學(xué)活性。2、酶學(xué)活性檢測法：直接用反應(yīng)底物檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中抗體的酶活性。3、短過渡態(tài)類似物法：以過渡態(tài)類似物中含有的必需基團(tuán)的基本結(jié)構(gòu)單元做為篩選單克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)。對該化合物親和力越強(qiáng)的化合物,其催化效率越高4、基因篩選法：應(yīng)用基因探針，對基因抗體庫進(jìn)行分析和篩選。六、抗體酶的應(yīng)用前景1、抗體酶在幫助戒毒方面的應(yīng)用

Landry等用可卡因水解的過渡態(tài)類似物-磷酸單酯為半抗原，產(chǎn)生的單克隆抗體能催化可卡因的分解，其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰膽堿酯酶差不多，水解后的可卡因片斷失去可卡因刺激功能。因此，用人工抗體酶的被動免疫也許能阻斷可卡因上癮，達(dá)到戒毒目的。2.抗體酶用于腫瘤治療前藥(prodrug)是指由具有生物活性的藥物經(jīng)化學(xué)修飾后轉(zhuǎn)變?yōu)轶w外無活性的化合物。這種化合物在體內(nèi)經(jīng)酶或非酶作用，脫去保護(hù)基，釋放出母體藥物而發(fā)揮作用。

目前正在發(fā)展一種稱為抗體介導(dǎo)前藥治療技術(shù)，即將能水解前藥釋放出腫瘤細(xì)胞毒劑的酶和腫瘤專一性抗體相偶聯(lián)，這樣酶就會通過和腫瘤結(jié)合的抗體而存在于細(xì)胞的表面。靜脈給藥后，當(dāng)藥物擴(kuò)散至腫瘤細(xì)胞的表面或附近，抗體酶就會將前藥迅速水解釋放出抗腫瘤藥物，從而提高腫瘤細(xì)胞局部藥物濃度，增強(qiáng)對腫瘤的殺傷力。三免疫反應(yīng)的基本特點(diǎn)和標(biāo)記技術(shù)一、抗原抗體反應(yīng)的一般規(guī)律二、抗原抗體間主要的反應(yīng)三、免疫標(biāo)記技術(shù)一、抗原抗體反應(yīng)的一般規(guī)律1、特異性2、可逆性3、定比性4、階段性5、條件依賴性

特異性示意圖

特異性：抗原分子，只能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合。決定因素：由抗原決定簇和抗體分子超變區(qū)之間空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性決定的?？贵w分子N端可變區(qū)形成3nm×1.5nm×0.7nm的槽溝，只有與其空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的抗原決定簇才能如楔狀嵌入。最適比例性

抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)具有一定的量比關(guān)系。只有當(dāng)抗原抗體兩者的分子比例合適時(shí)，才能發(fā)生最強(qiáng)的結(jié)合反應(yīng)。以沉淀免疫反應(yīng)為例

可逆性

概念：是指抗原與抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下可解離為游離抗原與抗體的特性。

解離后抗原抗體仍保持原有特性。一定條件：低pH、高濃度鹽等。常用于解離抗原抗體復(fù)合物的物質(zhì)有：

3mol/L硫氰化鉀、pH2.40.1mol/L甘氨酸、

7mol/L尿素等?？贵w混有SPAg抗體-SPAg抗體-SPAg分離劑一、抗原抗體結(jié)合二、分離抗體

可逆性示意圖抗體抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段。第一為抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的階段，此階段反應(yīng)快，僅需幾秒至幾分鐘，但不出現(xiàn)可見反應(yīng)。第二為可見反應(yīng)階段，抗原抗體復(fù)合物在環(huán)境因素（如電解質(zhì)、ph、溫度、補(bǔ)體）的影響下，進(jìn)一步交聯(lián)和聚集，表現(xiàn)為凝集、沉淀、溶解、補(bǔ)體結(jié)合介導(dǎo)的生物現(xiàn)象等肉眼可見的反應(yīng)。此階段反應(yīng)慢，往往需要數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)。實(shí)際上這兩個(gè)階段以嚴(yán)格區(qū)分，而且兩階段的反應(yīng)所需時(shí)間亦受多種因素和反應(yīng)條件的影響，若反應(yīng)開始時(shí)抗原抗體濃度較大且兩者比較適合，則很快能形成可見反應(yīng)。二、抗原抗體間主要的反應(yīng)1、凝集反應(yīng)3、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)2、沉淀反應(yīng)顆粒性抗原和抗體反應(yīng)出現(xiàn)肉眼可見的凝聚團(tuán)現(xiàn)象需要補(bǔ)體參與，以綿羊血和溶血素為指示劑的抗原抗體結(jié)合檢測反應(yīng)。可溶性抗原和抗體反應(yīng)出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物現(xiàn)象凝集反應(yīng)顆粒性抗原(細(xì)菌、血細(xì)胞等)與相應(yīng)抗體在適量電解質(zhì)環(huán)境中相互作用，經(jīng)過一定時(shí)間出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象，稱凝集反應(yīng)。2、間接凝集反應(yīng)將可溶性抗原事先偶聯(lián)到無關(guān)顆粒(如乳膠粒)上轉(zhuǎn)化為顆粒性抗原再進(jìn)行凝集反應(yīng)。1、直接凝集反應(yīng)

顆粒狀抗原（如細(xì)菌、紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體直接結(jié)合所出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。分為玻片法和試管法。凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體在電解質(zhì)存在的適當(dāng)條件下相遇，經(jīng)過一定時(shí)間出現(xiàn)肉眼可見的沉淀現(xiàn)象，稱沉淀反應(yīng)。1、環(huán)狀沉淀實(shí)驗(yàn)

當(dāng)反應(yīng)于試管內(nèi)進(jìn)行時(shí)，稱環(huán)狀沉淀實(shí)驗(yàn)。2、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

抗原與抗體在含電解質(zhì)的凝膠介質(zhì)（瓊脂）內(nèi)自由擴(kuò)散，當(dāng)抗原抗體以適當(dāng)比例相遇時(shí)可出現(xiàn)白色沉淀線，稱瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀釋加入抗血清各管抗體量不變振搖混勻、37℃孵育沉淀量不同出現(xiàn)沉淀量最多的管為最適比例管。輕搖絮狀沉淀試驗(yàn)絮狀沉示意圖淀AgAbAg瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

某些小分子物質(zhì)結(jié)合到抗原或抗體上，不影響抗原抗體反應(yīng)但使之更容易觀察從而提高檢測的靈敏度，稱為免疫標(biāo)記技術(shù)。與抗原或抗體結(jié)合的小分子物質(zhì)稱為標(biāo)記劑。近年免疫標(biāo)記技術(shù)發(fā)展很快，各類物質(zhì)被試用作標(biāo)記物，其中以熒光素、放射性同位素和酶標(biāo)記最為成熟，合稱三大標(biāo)記技術(shù)。三、免疫標(biāo)記技術(shù)1、免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)是一種將免疫反應(yīng)的特異性與熒光標(biāo)記分子的可見性結(jié)合起來的方法，因常用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體，又稱熒光抗體法。生物標(biāo)記熒光素的要求1、具有與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的能力2、熒光效率高3、能與背景物質(zhì)形成鮮明對比4、不影響蛋白質(zhì)的生物、免疫活性5、標(biāo)記方法安全、簡便6、標(biāo)記物穩(wěn)定，易保存異硫氰酸熒光素（FITC）的標(biāo)記原理與方法熒光素-N=C=S+NH2-抗體熒光素-N-C-N-抗體HSH呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）的標(biāo)記原理與方法熒光素-SO3Na+PCl5熒光素-SO2Cl

+

PCl3+NaCl熒光素-SO2Cl+NH2-抗體

熒光素-SO2-NH-抗體+HCl

呈橘紅色熒光標(biāo)記免疫物的分離與鑒定1、分離目的：去除游離熒光素方法：柱層析2、鑒定抗體活性標(biāo)記物結(jié)合度

F/P比值放射免疫測定是一種以放射線同位素作為標(biāo)記物，將同位素分析的靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性這兩大特點(diǎn)結(jié)合起來的測定技術(shù)。2、放射免疫測定(radioimmunoassayRIA)

放射免疫技術(shù)靈敏度極高，能測得毫微克至微微克(10-9～10-12克)的含量，廣泛用于激素、核酸、病毒抗原、腫瘤抗原等微量物質(zhì)測定。但需特殊儀器及防護(hù)措施，并受同位素半衰期的限制。常用標(biāo)記方法1、常用放射性核素2、125I的標(biāo)記方法直接法（氯胺T法）間接法（連接法）直接法（氯胺T法）OH-NHCHONH-CH2OH-NHCHONH-CH2Na125I4。C125I氯胺T間接法（連接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2HOO=C-C-CH2CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2HOO=C-C-CH2+Na125I氯胺T125INSHPP間接法（連接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2HOO=C-C-CH2CH2OHH-C-C-N-蛋白質(zhì)HOH+NH2-蛋白質(zhì)125I125I標(biāo)記免疫物的分離與鑒定1、分離目的：去除游離放射性核素方法：柱層析2、鑒定游離放射性核素含量免疫活性比放射性（mCi/mg）應(yīng)用意義3、免疫酶技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）是將酶作為標(biāo)記物質(zhì)，使之和抗原（或抗體）結(jié)合形成酶與抗原（或抗體）復(fù)合物，然后再根據(jù)待測抗體（或抗原）與復(fù)合物專一且定量的結(jié)合關(guān)系，在特異抗原抗體反應(yīng)后，在相應(yīng)而合適的酶底物作用下，產(chǎn)生可見的不溶性有色產(chǎn)物。

免疫酶技術(shù)可用于組織切片、細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)本等組織細(xì)胞抗原的定性定位。也可用于可溶性抗原或抗體的測定。

常用的為辣根過氧化物酶(HRP)，其次有堿性磷酸酶等。

ELISA方法是將可溶性抗體或抗原吸附到聚苯乙烯等固相載體上，再進(jìn)行免疫酶反應(yīng)，用分光光度計(jì)比色以定性或定量，是目前應(yīng)用最廣泛的生物學(xué)技術(shù)之一。酶聯(lián)免疫吸附測定(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)ELISA技術(shù)的原理與方法間接法

夾心法

競爭法間接法夾心法競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA（enzymelinkedimmunosorbentassay）

是一類常用的免疫酶技術(shù)。是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行。常用的酶：辣根過氧化物酶(HRP)

堿性磷酸酶（AP）。ELISA檢測抗原

Ag+ Ab*?Ag-Ab*ELISA檢測抗體

Ab+ Ag*?Ab-Ag*ELISA檢測抗體Ag+Ab1?Ag-Ab1Ag-Ab1+Ab2*?Ag-Ab1-Ab2*競爭ELISA檢測抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。固定OD值實(shí)驗(yàn)材料：羊抗人血清白蛋白抗體（一抗）已知含量的人血清白蛋白（作標(biāo)準(zhǔn)曲線）待檢人血清白蛋白辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗羊抗體（二抗）包被液CBS：PH9.6，0.05mol/L碳酸鹽緩沖液洗板液或稀釋液：PH7.4，0.01mol/LPBS底物溶液：OPD-H2O2終止液：2mol/LH2S04酶標(biāo)反應(yīng)板（一條/人）三、操作步驟包被抗原

抗原用包被液（CBS）稀釋至合適濃度，加入到酶標(biāo)板中，100μl/孔，放入濕盒中，4℃過夜。次日，用洗板液洗板3次（將洗板液加入每孔，1min后傾去），以洗去未包被的游離抗原?？乖?00ul/孔濕盒中，4℃過夜酶標(biāo)板抗原與抗體的預(yù)孵育制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：

在稀釋板中，用PBS倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)抗原，每種濃度的抗原最終為50μl，分別在各抗原孔中加入250μl一定濃度的抗體，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中30min。待測抗原：

取50μl未知濃度的抗原按照同上操作。待測抗原50ulPBS50ul50ul稀釋液50ul50ul100ul標(biāo)準(zhǔn)抗原250ul抗體稀釋板37℃，30min3.與固相抗原的競爭結(jié)合

取稀釋板中預(yù)孵育的抗原抗體混合液100μl，加入酶標(biāo)板的抗原孔中，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中60min。洗板3次。

100ul稀釋板酶標(biāo)板37℃，60min洗板3次4.酶標(biāo)二抗的結(jié)合

酶標(biāo)抗體用稀釋液稀釋至工作濃度后，加入每孔中，100ul/孔，置濕盒中放37℃30min。洗板3次。5.加入底物顯色液（用前再配制，并置棕色瓶內(nèi)）每孔加入底物顯色液，100ul/孔，濕盒中37℃保溫一定時(shí)間。6.終止反應(yīng)

待出現(xiàn)明顯顏色反應(yīng)（或一定時(shí)間）后，加入終止液，

50ul/孔以終止反應(yīng)。7.結(jié)果測定用酶標(biāo)儀在492nm波長下測定OD值。以標(biāo)準(zhǔn)抗原的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算未知抗原的濃度。酶標(biāo)儀4、免疫電子顯微鏡技術(shù)

(immuneelectronmicroscopy)基本原理：用電子致密物質(zhì)標(biāo)記抗體，然后與含有相應(yīng)抗原的生物標(biāo)本反應(yīng)，在電鏡下觀察到電子致密物質(zhì)，從而準(zhǔn)確地顯示抗原所在位置，是一種在超微結(jié)構(gòu)水平上的抗原定位方法。免疫電子顯微鏡技術(shù)是將血清學(xué)標(biāo)記技術(shù)與電子顯微鏡相結(jié)合，在免疫反應(yīng)高度特異、敏感、快速、簡便的基礎(chǔ)上，用電子顯微鏡進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)水平研究的一項(xiàng)技術(shù)。5、免疫印跡

(westernblot)免疫印跡是在用于DNA分析的DNA印跡(Southernblot)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)。

原理：將SDS電泳的高分辨率與免疫反應(yīng)的高度特異性相結(jié)合。待測樣品經(jīng)SDS電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相介質(zhì)如醋酸纖維膜上，在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。WesternBlot一般流程蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色通過有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白水溶液提取法針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑。

細(xì)胞裂解液：50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40，0.05%PMSF，2μg/mLAprotinin,0.5μg/mLLeupeptin

，pH8.0

有機(jī)溶劑提取法對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通過層析或電洗脫法制備目的蛋白蛋白樣品的制備蛋白樣品的定量Bradford法

考馬斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結(jié)合后形成藍(lán)色化合物，該化合物在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比。(上樣量)試劑：考馬斯亮藍(lán)工作液，0.1N鹽酸，雙蒸水，蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（將10mg/ml蛋白溶液稀