細胞培養(yǎng)實驗指導(dǎo)大全

生物學(xué)實驗教學(xué)中心WenzhouMedicalCollegeCentralLaboratoryofBiologyCO2培養(yǎng)箱使用李

東CO2培養(yǎng)箱WenzhouMedicalCollege

全世界的用戶對二氧化碳培養(yǎng)箱都有兩條最基本的要求，一是要求二氧化碳培養(yǎng)箱能夠?qū)囟?、二氧化碳濃度和濕度提供最精確穩(wěn)定的控制，以便于其研究工作的進展；二是要求二氧化碳培養(yǎng)箱能夠?qū)ε囵B(yǎng)箱內(nèi)的微生物污染進行有效的防范。

CO2培養(yǎng)箱使用注意事項WenzhouMedicalCollege一、二氧化碳進氣壓力：0.08~0.1MPa(0.8-1bar)

壓力表選用：初級壓力25MPa，次級壓力0.2MPa。松→緊壓力低→高。進氣正常的現(xiàn)象。壓力過高的危害，注意安全。壓力調(diào)節(jié)穩(wěn)定需要時間，原因：殘余氣體，壓力表不穩(wěn)。。二、溫度控制培養(yǎng)箱的最低工作溫度一般是高于室溫5°C，空氣循環(huán)提高溫度均一性。溫度恢復(fù)時間（37℃），開門時間過長，超溫；水盤的水溫影響。門加熱系統(tǒng)，即使箱內(nèi)相對濕度高達98%，所有內(nèi)壁表面亦能保持完全干燥。

▼CO2培養(yǎng)箱使用注意事項WenzhouMedicalCollege

CO2培養(yǎng)箱使用注意事項WenzhouMedicalCollege

CO2培養(yǎng)箱使用注意事項WenzhouMedicalCollege

▲幻燈片3CO2培養(yǎng)箱使用注意事項WenzhouMedicalCollege三、二氧化碳濃度控制按培養(yǎng)基中的NaHCO3設(shè)定二氧化碳濃度：NaHCO31.97g/L，CO2濃度5%；NaHCO33.95g/L，CO210%。RPMI1640培養(yǎng)基每升2.1g碳酸氫鈉；DMEM每升3.7克碳酸氫鈉；F12NaHCO31.18g/L;DMEM/F12NaHCO32.56g/L。

HEPES緩沖液可與低水平的碳酸鈉（0.34g/L）共用，以抵消因額外加入HEPES引起的滲透壓增加。在這種培養(yǎng)條件下，細胞培養(yǎng)瓶的蓋子應(yīng)擰緊，以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。注意CO2培養(yǎng)箱使用注意事項WenzhouMedicalCollege四、相對濕度水盤蒸發(fā)面積大，增強蒸發(fā)作用，使培養(yǎng)箱內(nèi)能快速達到飽和濕度狀態(tài)。無菌蒸餾水，定期檢查、定期更換。二氧化碳培養(yǎng)箱停止使用時，除水，否則發(fā)霉。

CO2培養(yǎng)箱使用注意事項WenzhouMedicalCollege五、防污染和消毒滅菌空氣過濾：HEPA過濾器能過濾培養(yǎng)箱內(nèi)空氣，可過濾除去99.97%的0.3微米以上的顆粒，箱體關(guān)閉后5分鐘內(nèi)達到空氣100級。乙醇消毒。紫外消毒：紫外消毒能力是與紫外燈距離目標(biāo)的距離的二次方成反比，距離越遠，消毒能力越差，且無穿透能力，難以達到徹底滅菌的要求；高溫濕熱：目前比較有效消毒滅菌的方法，高溫消毒又分為兩類，一是傳統(tǒng)的高溫干熱消毒，另一種是先進的高溫濕熱滅菌。CO2培養(yǎng)箱使用注意事項WenzhouMedicalCollege六、重要提示需要定時更換的部件：HEPA過濾器、空氣過濾器

需要定時處理的工作：消毒、水盤

CO2培養(yǎng)箱使用注意事項WenzhouMedicalCollege

▲幻燈片3細胞培養(yǎng)室WenzhouMedicalCollegeBiotechnologyResearchPlatform細胞培養(yǎng)室WenzhouMedicalCollege無菌級別：萬級，局部100級Nikon

倒置生物顯微鏡NikonDS-5M-L1顯微攝影系統(tǒng)Thermo二氧化碳培養(yǎng)箱Labsystems

BioMate電動移液器細胞培養(yǎng)室使用注意事項WenzhouMedicalCollege

細胞培養(yǎng)室的大小依需要而定，一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。更衣間放在外，主要供更換衣帽、鞋子等。緩沖間位于更衣間與操作間之間，也可同時和幾個操作間相通。操作間放在內(nèi)間，主要供無菌操作和細胞培養(yǎng)，房間應(yīng)不受日光直射，大小適當(dāng)，高度適宜(2.5m)。房間過大，清掃和消毒不便；過小，操作不便；頂部過高會影響紫外線的有效滅菌效果。墻壁應(yīng)光滑無死角，以便清洗和消毒。

細胞培養(yǎng)室使用注意事項WenzhouMedicalCollege細胞培養(yǎng)室的日常維護和操作規(guī)程：㈠、日常維護1、定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水擦地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3‰

來蘇爾或者新潔爾滅擦拭。2、無菌室實驗前滅菌：打開紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)30分鐘。3、無菌室實驗后滅菌：用75％酒精擦拭超凈臺（有機玻璃面板不能用酒精擦拭）、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺，打開紫外燈照射30分鐘。細胞培養(yǎng)室使用注意事項WenzhouMedicalCollege㈡、進入無菌室的實驗人員無菌準(zhǔn)備：

1、肥皂洗手，75％酒精泡手。

2、帶好手套、穿好隔離衣、拖鞋、帶好隔離帽、口罩。

3、用75％酒精棉球擦凈雙手（酒精不可過多，防止著火）。細胞培養(yǎng)室使用注意事項WenzhouMedical

College㈢、無菌室內(nèi)的操作要求和注意事項：1、凡是帶入無菌室的試劑（酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶等）的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面。2、動作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸、手。3、吸取兩種以上的試劑時要注意更換吸管，防止交叉污染。4、不同細胞培養(yǎng)瓶（板）內(nèi)使用的吸管要注意更換，防止污染擴大。細胞培養(yǎng)室使用注意事項WenzhouMedicalCollege誤區(qū)：紫外燈消毒滅菌時間。消毒的效能與距離成反比，進行空氣消毒時燈管應(yīng)距地面2．5m以內(nèi)；臺面的消毒應(yīng)在80cm以內(nèi)；培養(yǎng)器皿的消毒在30cm以內(nèi)。消毒的時間與效能存在一定關(guān)系，但不是絕對的：照射20min后，有71％的細菌被消滅；40min后79％的細菌被消滅；60min后86％的細菌被消滅。紫外線照射時間再長也不是100％的滅菌，最多只能把90％的細菌消滅，過長的照射是沒有意義的。如用于紫外線照射帶菌的器皿，應(yīng)與其他消毒方法結(jié)合使用，如先用75％的酒精浸泡，再照紫外線消毒滅菌等。細胞培養(yǎng)室使用注意事項WenzhouMedicalCollege誤區(qū)：鼓風(fēng)機風(fēng)速要適當(dāng)。超凈工作臺注意過濾器的效果，一般2-3年更換一次，以保持過濾器的凈化效果。

廢液缸處理。

及時關(guān)閉空氣循環(huán)器

及時關(guān)閉空調(diào)光學(xué)顯微鏡的使用

李東生物學(xué)實驗教學(xué)中心—、普通光學(xué)顯微鏡顯微鏡的構(gòu)造主要分為三部分：機械部分、照明部分和光學(xué)部分—、普通光學(xué)顯微鏡

顯微鏡清晰度決定于放大倍數(shù)和顯微鏡的分辨力，分辨力是指顯微鏡（或人的眼睛距目標(biāo)25cm處）能分辨物體最小間隔的能力，分辨力的大小決定于光的波長和鏡口率以及介質(zhì)的折射率，用公式表示為：R=0.61λ/N.A，N.A＝ｎsinα/2介質(zhì)的折射率:空氣(1)水(1.33)香柏油(1.515)

光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為1.65~1.78，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。對于干燥物鏡來說，介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為0.05~0.95；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近1.5。普通光線的波長為400~700nm，因此顯微鏡分辨力數(shù)值不會小于0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般顯微鏡設(shè)計的最大放大倍數(shù)通常為1000X。二、熒光顯微鏡

二、熒光顯微鏡熒光顯微鏡濾色片參數(shù)

MWU:波長330~385nm高通濾色片：420nm

MWB(藍光激發(fā)):波長450~480nm高通濾色片：515nm

觀察綠色熒光的樣品，例：FITC（激發(fā)490nm，熒光波長520nm）

EB：激發(fā)波長488nm,發(fā)射波長620nm

（RNA，DNA：紅色；可進入死細胞）

AOPI：激發(fā)波長495nm，發(fā)射波長530nm

（DNA：綠色；RNA：紅色；可進入活細胞）WIG(綠光激發(fā)):波長510~550nm高通濾色片：590nm

觀察紅色熒光的樣品二、熒光顯微鏡熒光顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別：照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上；2.光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡；3.有兩個特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護人目。三、倒置相差顯微鏡

可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細胞。相差顯微鏡的基本原理是，把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4λ（波長），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減小，提高反差。三、倒置相差顯微鏡三、倒置相差顯微鏡相差顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的不同點：1、環(huán)形光闌位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標(biāo)本上。2、相位板（annularphaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：

1、A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮，形成亮反差（或稱負(fù)反差）。

2.、B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。用ＭＴＴ比色法測定細胞相對數(shù)WenzhouMedicalCollege

取有貼壁細胞培養(yǎng)板的，每孔內(nèi)加入5mg/mlＭＴＴ20μl，4ｈ后每孔加入50%二甲亞砜水溶液150μL，振蕩10Min，570nm(或490nm)處測定OD值，作為細胞相對數(shù)。注意：MTT法只能測定細胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細胞絕對數(shù)。

制備細胞爬片WenzhouMedicalCollege1、在無菌培養(yǎng)皿或6孔細胞培養(yǎng)板中鋪上滅菌后的蓋玻片，在每片蓋玻片上滴一滴計數(shù)后的細胞懸液（細胞密度為2×104/ml）。再在每片蓋玻片上滴加培養(yǎng)液至剛好覆蓋滿蓋玻片。將培養(yǎng)皿（6孔細胞培養(yǎng)板）置于37℃，含5%CO2及飽和濕度的

CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2、4小時后將培養(yǎng)液加量至覆蓋整個培養(yǎng)皿的底面。

制備細胞爬片WenzhouMedicalCollege3、倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細胞增殖到合適的密度后取出培養(yǎng)皿中止培養(yǎng)（一般為3-5

天）。

4、傾去培養(yǎng)液，加PBS（PH7.2～7.4）洗滌細胞爬片2次，每次1min。5、加10%中性甲醛（或-20℃預(yù)冷的丙酮）固定10～15min。6、吸除固定液，加PBS再洗滌細胞爬片2

次，每次1min。

制備細胞爬片WenzhouMedicalCollege

7、置于室溫下干燥1小時，如暫不染色，先放在-20冰箱中保存。8、取出蓋玻片時注意蓋玻片的正反面（有細胞的為正面）。

細胞爬片的免疫化學(xué)染色法WenzhouMedicalCollege

1、在細胞爬片上加0.03%TritonX-100水溶液處理15min。（若是要檢測的抗原表達于胞漿，此步可考慮省略）

2、吸除0.03%TritonX-100，加3%H2O2孵育10min。

3、吸除3%H2O2，加2%牛血清白蛋白封閉30～60min。PBS洗5min。

細胞爬片的免疫化學(xué)染色法WenzhouMedicalCollege

4、吸除PBS，分別滴加相應(yīng)的一抗（用