熒光(熒光顯微鏡和熒光分光光度計(jì))

熒光技術(shù)韓東洺

細(xì)胞生物學(xué)科

2014-11-52015年6月15日1熒光和熒光素

利用較短波長(zhǎng)的光(激發(fā)光)照射樣品，使樣品受到高能量激發(fā)，產(chǎn)生較長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光(發(fā)射光)，用來(lái)觀察和分辨樣品中產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的成分和位置。2常見熒光素：

（1）異硫氰酸熒光素(fluorescein

isothiocyanate,

FITC)（2）四乙基羅丹明

(rhodamine,

RB200)（3）四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethyl

rhodamine

isothiocynate,

TRITC)（4）鑭系

（5）藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）（6）多甲藻葉綠素蛋白

（peridinin

chlorophyll

protein，PerCP）（7）碘化丙啶（

propidium

iodide，PI）3合適熒光素的選擇：

具有與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)。

熒光效率高，標(biāo)記后下降不明顯。

熒光色澤與背景色澤對(duì)比鮮明。

標(biāo)記后能保持生物學(xué)活性和免疫活性。標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、快速。

安全無(wú)毒4熒光顯微鏡（fluorescencemicroscope）

熒光顯微鏡的基本構(gòu)造是由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎(chǔ)上組成的。光源濾光片光路聚光器鏡頭圖像采集系統(tǒng)

熒光光源：高壓汞燈、氙燈或鹵素?zé)?/p>

濾色系統(tǒng)：激發(fā)濾色片：置于光源與物鏡之間，用于選擇激發(fā)光范圍，只有能激發(fā)熒光染料發(fā)光的特定波長(zhǎng)的光通過(guò)。阻擋濾色片：物鏡和目鏡之間，選擇性通過(guò)特異的熒光，呈現(xiàn)專一的熒光色彩。

透射光：照明光線從標(biāo)本下經(jīng)聚光器透過(guò)標(biāo)本進(jìn)入物鏡。落射光：照明光線從標(biāo)本上經(jīng)垂直照明器落射到標(biāo)本，經(jīng)標(biāo)本反射進(jìn)入物鏡。

透射熒光顯微鏡光路(a)落射熒光顯微鏡光路(b)光路5熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求（一）載玻片

載玻片厚度應(yīng)在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無(wú)明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。

（二）蓋玻片

蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強(qiáng)激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對(duì)不同波長(zhǎng)的光起不同干涉作用的物質(zhì)（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過(guò)，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光女可激發(fā)標(biāo)本。

（三）標(biāo)本

組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外，細(xì)胞重迭或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。（四）封裱劑

封裱劑常用甘油，必須無(wú)自發(fā)熒光，無(wú)色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時(shí)較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l

pH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。

（五）鏡油

一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須使用鏡油，最好使用特制的無(wú)熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對(duì)圖像質(zhì)量略有影響。6使用熒光顯微鏡的注意事項(xiàng)

（1）嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說(shuō)明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。

（2）應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開始觀察標(biāo)本。

（3）防止紫外線對(duì)眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。

（4）檢查時(shí)間每次以1～2h為宜，超過(guò)90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過(guò)2～3h。

（5）熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)

省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí)，須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。（6）標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間防止封裱劑蒸發(fā)。

（7）熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：一般分為四級(jí)，即“-”—無(wú)或可見微弱熒光?！?”—僅能見明確可見的熒光?！?+”—可見有明亮的熒光?！?++”—可見耀眼的熒光。熒光分光光度計(jì)工作原理：

由光源氙狐燈發(fā)出的光通過(guò)切光器使其變成斷續(xù)之光以及激發(fā)光單色器變成單色光后，此光即為熒光物質(zhì)的激發(fā)光，被測(cè)的熒光物質(zhì)在激發(fā)光照射下所發(fā)出的熒光，經(jīng)過(guò)單色器變成單色熒光后照射于測(cè)樣品用的光電倍增管上，由其所發(fā)生的光電流經(jīng)過(guò)放大器放大輸至記錄儀，激發(fā)光單色器和熒光單色器的光柵均由電動(dòng)機(jī)帶動(dòng)的凸輪所控制，當(dāng)測(cè)繪熒光發(fā)射光譜時(shí)，將激發(fā)光單色器的光柵，固定在最適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長(zhǎng)處，而讓熒光單色器凸輪轉(zhuǎn)動(dòng)，將各波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度訊號(hào)輸出至記錄儀上，所記錄的光譜即發(fā)射光譜（emissionspectrum），簡(jiǎn)稱熒光光譜。

7熒光分光光度計(jì)

當(dāng)測(cè)繪熒光激發(fā)光譜時(shí)，將熒光單色器的光柵固定在最適當(dāng)?shù)臒晒獠ㄩL(zhǎng)處，只讓激發(fā)光單色口的凸輪轉(zhuǎn)動(dòng)，將各波長(zhǎng)的激發(fā)光的強(qiáng)度訊號(hào)輸出至記錄儀，所記錄的光譜即激發(fā)光譜（emissionspectrum）。

當(dāng)進(jìn)行樣品溶液的定量分析時(shí)，將激發(fā)光單色器固定在所選擇的激發(fā)光波長(zhǎng)處，將熒光單色器調(diào)節(jié)至所選擇的熒光波長(zhǎng)處，由記錄儀得出的信號(hào)是樣品溶液的熒光強(qiáng)度。熒光分光光度計(jì)原理圖熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)是:光源單色器或?yàn)V光片樣品池單色器或?yàn)V光片檢測(cè)器注意事項(xiàng)：

（1）

注意開機(jī)順序。

（2）

注意關(guān)機(jī)順序。

（3）

為延長(zhǎng)儀器使用壽命，掃描速度、負(fù)高

壓、狹縫的設(shè)置一般不宜選在高檔。

（4）

關(guān)機(jī)后必須半小時(shí)（等氙燈溫度降下）

方可重新開機(jī)。

8熒光技術(shù)的應(yīng)用（1）免疫熒光技術(shù)用熒光標(biāo)記的抗體或抗原與樣品(細(xì)胞、組織或分離的物質(zhì)等)中相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合，以適當(dāng)檢測(cè)熒光的技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析的方法。將抗原或抗體與熒光染料連接，用于檢測(cè)相應(yīng)特異性的抗體或抗原的方法稱“直接免疫熒光技術(shù)(directimmunofluorescenttechnique)”。用熒光染料標(biāo)記的第二、第三抗體等檢測(cè)相應(yīng)抗原抗體復(fù)合體的方法則稱“間接免疫熒光技術(shù)(indirectimmunofluorescenttechnique)”?？寡a(bǔ)體染色法簡(jiǎn)稱補(bǔ)體法，是間接染色法的一種改良法，本法利用補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的原理，用熒光素標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體，鑒定未知抗原或未知抗體(待檢血清)。直接法熒光素標(biāo)記的特異性抗體直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。直接熒光抗體染色法示意圖

間接法特異性抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)，熒光素標(biāo)記的抗抗體再與第一抗體結(jié)合。間接熒光抗體染色法示意圖

染色程序分為二步，最終使之形成抗原-抗體-補(bǔ)體-抗補(bǔ)體抗體復(fù)合物，發(fā)出熒光?？寡a(bǔ)體染色法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)直接法特異性高，操作簡(jiǎn)便，比較快速。一種標(biāo)記抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。直接法應(yīng)設(shè)陰、陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)照，抑制試驗(yàn)對(duì)照。間接法既能檢查未知抗原，也能檢查求知抗體;用一種標(biāo)記的抗球蛋白抗體，能與在種屬上相同的所有動(dòng)物的抗體結(jié)合，檢查各種未知抗原或抗體，敏感性高。

由于參加反應(yīng)的因素較多，受干擾的可能性也較大，判定結(jié)果有時(shí)較難，操作繁瑣，對(duì)照較多，時(shí)間長(zhǎng)。間接法應(yīng)設(shè)陰、陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)照，還應(yīng)設(shè)有中間層對(duì)照(即中間層加陰性血清代替陽(yáng)性血清)。補(bǔ)體法即只需要一種標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體，便能檢測(cè)各種抗原-抗體系統(tǒng)。參與反應(yīng)的成分多，染色程序較復(fù)雜，比較麻煩。

（2）作為生物大分子篩選與鑒定的標(biāo)記物

綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein)，簡(jiǎn)稱GFP，其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光線激發(fā)下，會(huì)發(fā)出綠色熒光。在生物學(xué)研究中綠色熒光蛋白具有廣泛用途，包括有：

分子標(biāo)記利用綠色熒光的發(fā)光機(jī)制，可將GFP作為蛋白質(zhì)標(biāo)簽(proteintagging)，即利用DNA重組技術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，然后借助熒光顯微鏡便可對(duì)標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活體觀察。

煙草細(xì)胞標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的活體觀察

藥物篩選

熒光探針?lè)植际抢眯盘?hào)傳導(dǎo)中信號(hào)分子的遷移功能，將一熒光蛋白與信號(hào)分子相偶聯(lián)，根據(jù)熒光蛋白的分布情況即可推斷信號(hào)分子的遷移狀況，并推斷該分子在遷移中的功能。由于GFP分子量小，在活細(xì)胞內(nèi)可溶且對(duì)細(xì)胞毒性較小，因而常用作熒光探針。

（3）熒光原位雜交

原位雜交技術(shù)(Insituhybridization，ISH)是用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測(cè)體系，在組織，細(xì)胞、間期核及染色體上對(duì)核酸進(jìn)行定位和相對(duì)定量研究的一種手段。原理：利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測(cè)DNA或RNA互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測(cè)手段將待測(cè)核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來(lái)。（4）無(wú)機(jī)分析在無(wú)機(jī)元素分析中,主要是通過(guò)待測(cè)元素與有機(jī)試劑(或熒光試劑)生成配合物或發(fā)生熒光猝滅效應(yīng)來(lái)測(cè)定元素的含量。目前

可以通過(guò)熒光分析測(cè)定70多種金屬離子和陰離子,如Ag、

Al、As、Au、Be、Bi、Ca、Cu、Ge、Ga、Hf、Hg、In、Ir、Li、Mg、Mn、Nb、Ni、Os、Pb、

Pt、Ru、Sb、Sc、Si、Sn、Sr、Ta、Tl、Th、

Ti、V、Y、W、Zn、Ce、Dy、Eu、Gd、La、

Lu、Sm、Cd、Cr(Ⅵ)、Se、Te、Re等（5）有機(jī)物分析近年來(lái)有機(jī)物熒光分析研究在我國(guó)發(fā)展迅速,年文獻(xiàn)量不斷增加。主要應(yīng)用領(lǐng)域有中西藥和臨床、食品營(yíng)養(yǎng)和添加劑等試樣。激光誘導(dǎo)熒光法診斷惡性腫瘤,顯微熒光法研究藥物與細(xì)胞的相互作用,DNA編序及含量的熒光法測(cè)定均是目前受到關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。環(huán)境檢測(cè)領(lǐng)域:熒光分光光度計(jì)檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)成為環(huán)境污染監(jiān)測(cè)中污染物定性和定量分析的有效手段。如不同類型不同場(chǎng)地的石油及其產(chǎn)品成份各有不同,其熒光光譜也有著顯著的區(qū)別,利用油標(biāo)可在激發(fā)310nm,發(fā)射365nm處測(cè)量淤泥和海水中油污樣品中總油的含量。還可以對(duì)機(jī)油、柴油、重油、原油及液壓油進(jìn)行初步鑒定；空氣塵埃中多環(huán)芳烴的檢測(cè)。其他如陰離子表面活性劑作為洗滌劑污染的主要成份,葉綠素a、葉綠素b、脫鎂葉綠素a和脫鎂葉綠素b作為水環(huán)境浮游植物生物量和水體富營(yíng)養(yǎng)化的重要指標(biāo)以及多環(huán)芳烴等都可用熒光分光光度計(jì)測(cè)量。食品和藥物成份分析領(lǐng)域：

曾用熒光法分析食品和藥品中的化合物如：維生素A、維生素B1、B2（核黃素）、B6、維生素BC(葉酸或蝶酰谷氨酸)、維生素C、維生素D、維生素E(生育酚)、維生素P(蘆丁)、維生素F（煙酸）、維生素K，抗生素藥中的青梅毒、金霉素、四環(huán)素、抗霉素、鏈霉素和放線菌素D等，抗瘧疾藥中的奎寧、瘧滌平、撲瘧母星、嘧啶甲胺和利凡諾等，麻醉藥中的大麻醇、嘜啶鹽酸鹽、四氫大麻醇、嗎啡、可待因、罌粟堿、那可汀、吐根酚堿、依米丁、麻黃素、馬錢子堿鹽酸鹽、毛果（蕓香）鹽酸鹽、弗勒可丁、二丁卡因、麥角酸二乙胺等，鎮(zhèn)痛藥中撲熱息痛、阿司匹林、消炎痛吲哚美辛等等。OLYMPUSBX53OLYMPUSBX53觀察流程熒光分光光度計(jì)賽默飛Lumina

FluorescenceSpectrometer產(chǎn)品展覽ThermoScientific所提供的