第三章酶反應(yīng)動力學(xué)和第四章固定化酶1-4

第三章酶催化反應(yīng)動力學(xué)（2學(xué)時）主要內(nèi)容：

酶催化反應(yīng)速率與酶活的測定1底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響2酶濃度對酶促反應(yīng)速度的影響3其它因素對酶促反應(yīng)速度的影響5抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響4酶催化反應(yīng)動力學(xué)研究包括哪些內(nèi)容?重要（1）底物濃度（2）酶濃度（3）抑制劑（4）溫度（5）

pH影響因素（6）激活劑酶促反應(yīng)速度目的和意義

找到適宜的反應(yīng)條件提高或抑制酶催化反應(yīng)效率

了解酶在生理代謝過程中的作用和某些藥物的作用機(jī)制等定義：酶催化反應(yīng)動力學(xué)是研究酶促反應(yīng)速度以及影響此速度的各種因素的科學(xué)。1酶催化反應(yīng)速率與酶活力的測定酶活力是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力，其大小可以用在一定條件下該酶所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度（reactionvelocity）來表示，酶活力的高低和化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度的大小兩者呈線性關(guān)系。1.1酶催化反應(yīng)速率隨時間的變化酶催化的反應(yīng)速度可用在單位時間內(nèi)底物的減少量或者產(chǎn)物的增加量來表示。如圖3-1所示的曲線圖。酶促反應(yīng)速度隨反應(yīng)時間延長而降低。圖3-1酶促反應(yīng)的速度曲線（1）底物濃度的降低、產(chǎn)物濃度增加從而加速了逆反應(yīng)的進(jìn)行；（2）產(chǎn)物對酶的抑制作用；（3）隨著反應(yīng)時間的延長引起酶的部分失活等。引起酶促反應(yīng)速度隨反應(yīng)時間延長而降低的原因？測定反應(yīng)初速度的方法來測定相關(guān)制劑中酶的含量（活性）。如何避免影響？1.2酶活力的測定原理酶蛋白的含量很低，很難直接測定其蛋白質(zhì)的含量，且常與其他各種蛋白質(zhì)混合存在，將其提純耗時費力。故不能直接用重量或體積等指標(biāo)來衡量。分光光度法熒光法同位素法電化學(xué)方法其他方法：如旋光法、量氣法、量熱法和層析法等測定酶活力常用的方法：測定酶活力的基本原理測定底物減少量測定產(chǎn)物增加量1.3酶活力測定時需注意：（1）選擇反應(yīng)的最適溫度，根據(jù)不同的底物和緩沖液選擇反應(yīng)的最適pH。（2）速度要快，取反應(yīng)的初速度（3）底物濃度要足夠大（一般在10Km以上）使酶被底物飽和，以充分反映待測酶的活力2底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響2.1中間絡(luò)合物學(xué)說中間絡(luò)合物學(xué)說最早是由Henri和Wurtz兩位科學(xué)家提出的。在1903年，Henri在用蔗糖酶水解蔗糖實驗研究化學(xué)反應(yīng)中底物濃度與反應(yīng)速度的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶濃度不變時，可以測出一系列不同底物濃度下的化學(xué)反應(yīng)速度，以該反應(yīng)速度對底物濃度作圖，可得到如圖3-2所示的曲線。

圖3-2底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響根據(jù)這一實驗結(jié)果，Henri和Wurtz提出了酶促化學(xué)反應(yīng)的酶底物中間絡(luò)合物學(xué)說。該學(xué)說認(rèn)為：當(dāng)酶催化某一化學(xué)反應(yīng)時，酶(E)首先需要和底物(S)結(jié)合生成酶底物中間絡(luò)合物即中間復(fù)合物(ES)，然后再生成產(chǎn)物(P)，同時釋放出酶。該學(xué)說可以用下面的化學(xué)反應(yīng)方程式來表示：

酶底物中間絡(luò)合物學(xué)說E+Sk1k2k3ESE+P酶底物中間絡(luò)合物學(xué)說酶還未被底物所飽和酶已全部被底物所飽和2.2酶促反應(yīng)的動力學(xué)方程式（米氏方程）1913年Michaelis和Menten兩位科學(xué)家在前人工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)酶促反應(yīng)的中間絡(luò)合物學(xué)說，推導(dǎo)出一個數(shù)學(xué)方程式，用來表示底物濃度與酶反應(yīng)速度之間的量化關(guān)系，通常把這個數(shù)學(xué)方程式稱為米氏方程：[S]：底物濃度

V：不同[S]時的反應(yīng)速度Vmax：最大反應(yīng)速度(maximumvelocity)Ｋm：米氏常數(shù)(Michaelisconstant)米氏常數(shù)Km的含義Km值就代表著反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度，單位是mol/L。

。2＝Km+[S]

Vmax

Vmax[S]Km＝[S]Km值的推導(dǎo)：米氏常數(shù)的應(yīng)用價值Km是酶的一個特征性常數(shù)：也就是說Km的大小只與酶本身的性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無關(guān)。Km值還可以用于判斷酶的專一性和天然底物，Km值最小的底物往往被稱為該酶的最適底物或天然底物。Km可以作為酶和底物結(jié)合緊密程度的—個度量指標(biāo)，用來表示酶與底物結(jié)合的親和力大小。已知某個酶的Km值，就可以計算出在某一底物濃度條件下，其反應(yīng)速度相當(dāng)于Vmax的百分比。

Km值還可以幫助我們推斷具體條件下某一代謝反應(yīng)的方向和途徑，只有Km值小的酶促反應(yīng)才會在競爭中占優(yōu)勢。米氏方程的雙倒數(shù)作圖雙倒數(shù)作圖法(doublereciprocalplot)，又稱為林-貝氏(Lineweaver-Burk)作圖法

Vmax[S]Km+[S]V=（林－貝氏方程）+1/V=KmVmax

1/Vmax1/[S]兩邊同取倒數(shù)-1/Km1/[S]1/V03酶濃度對反應(yīng)速度的影響當(dāng)[S]＞＞[E]，酶可被底物飽和的情況下，反應(yīng)速度與酶濃度成正比關(guān)系式為：

V=K3[E]0

V

[E]

當(dāng)[S]>>[E]時，Vmax

=k3[E]酶濃度對反應(yīng)速度的影響

E+Sk1k2k3ESE+P4抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響區(qū)別于酶的變性抑制劑對酶有一定選擇性引起變性的因素對酶沒有選擇性酶的抑制劑(inhibitor)：凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)稱為酶的抑制劑。（1）是研究酶的結(jié)構(gòu)與功能、酶的催化機(jī)制以及闡明機(jī)體代謝途徑的基本手段。（2）可以為醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中設(shè)計新藥物和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中設(shè)計新農(nóng)藥提供重要的理論依據(jù)。（3）在食品生產(chǎn)和保鮮中控制酶的催化效率。研究抑制劑的意義4.1抑制作用的類型及鑒別根據(jù)抑制劑與酶的作用方式的區(qū)別以及抑制作用是否可逆，我們可以將抑制作用分為兩大類，即：不可逆的抑制作用(irreversibleinhibition)可逆的抑制作用(reversibleinhibition)鑒別不可逆抑制作用抑制劑與酶的必需基團(tuán)以共價鍵的形式結(jié)合而引起酶活力降低或喪失。是不可逆的。本質(zhì)上來說就是酶的修飾抑制可逆抑制作用由于抑制劑與酶以非共價鍵的形式結(jié)合而引起酶活力降低或喪失。是可逆的。鑒別方法（1）能否用透析、超濾和凝膠過濾等物理方法除去抑制劑？（2）化學(xué)動力學(xué)的方法（見下圖）如何鑒別？圖3-4可逆抑制劑與不可逆抑制劑的區(qū)別（一）曲線1，無抑制劑；曲線2，不可逆抑制劑；曲線3，可逆抑制劑4.2不可逆的抑制作用根據(jù)不可逆抑制劑選擇性的差異，通常把不可逆抑制劑分為兩種類型，即非專一性不可逆抑制劑和專一性不可逆抑制劑。①非專一性不可逆抑制劑有機(jī)磷化合物有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物重金屬鹽烷化劑硫化物、氰化物和CO非專一性青霉素與絲氨酸羥基共價結(jié)合與半胱氨酸的巰基共價結(jié)合使酶蛋白變性與酶多個必須基團(tuán)結(jié)合與酶中金屬離子形成穩(wěn)定絡(luò)合物機(jī)理與糖肽轉(zhuǎn)肽酶絲氨酸羥基結(jié)合舉例1：有機(jī)磷化合物對羥基酶的抑制

有機(jī)磷化合物羥基酶解毒------解磷定(PAM)路易士氣失活的酶巰基酶失活的酶酸BAL巰基酶BAL與砷劑結(jié)合物舉例2：有機(jī)砷對巰基酶的抑制砷化合物巰基酶解毒------二巰基丙醇(BAL)②專一性不可逆抑制劑a) Ks型不可逆抑制劑：具有與底物相類似的結(jié)構(gòu)例如：對甲苯磺酰-L-賴氨酰氯甲酮（TLCK）和胰蛋白酶的底物對甲苯硫磺-L-賴氨酰甲酯（TLME）具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)b) Kat型不可逆抑制劑：不但具有與天然底物相類似的結(jié)構(gòu)，而且抑制劑本身也是酶的底物，專一性極高，因此也被稱為自殺性底物。例如：β-鹵代-D-Ala是丙氨酸消旋酶的不可逆抑制劑4.3可逆的抑制作用根據(jù)可逆抑制劑與底物的關(guān)系，我們將可逆抑制作用分為三種類型。

競爭性抑制1非競爭性抑制2反競爭性抑制3①競爭性抑制(competitiveinhibition)：是最常見的一種可逆抑制作用。大多數(shù)競爭性抑制劑與底物的結(jié)構(gòu)相似，能與底物競爭酶的活性中心，從而阻礙酶底物復(fù)合物的形成，使酶的活性降低。這種抑制作用稱為競爭性抑制作用。其抑制程度取決于底物和抑制劑的相對濃度，可以通過增加底物濃度的方法來解除這種抑制作用。競爭性抑制反應(yīng)模式在競爭性抑制中，底物(S)或抑制劑(I)與酶(E)的結(jié)合都是可逆的，因此存在著如下的化學(xué)平衡式：[S]>>[I]：高濃度的底物可解除抑制圖3-5競爭性抑制曲線⑴Vm值不變，(表觀）Km值增大；⑵Km隨抑制劑濃度[I]的增加而增加；⑶雙倒數(shù)作圖所得直線相交于縱軸；⑷抑制作用可以被高濃度的底物減低以致消除。特點：與對氨基苯甲酸競爭性抑制二氫葉酸合成酶舉例：磺胺類藥物的抑菌機(jī)制②非競爭性抑制(noncompetitiveinhibition)：非競爭性抑制劑(I)和底物(S)可以同時與酶(E)結(jié)合，兩者之間不存在競爭關(guān)系。但是在酶與抑制劑結(jié)合后，還可以進(jìn)一步與底物結(jié)合形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI；酶與底物結(jié)合后，也可以進(jìn)一步與抑制劑結(jié)合形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI。這種中間的三元復(fù)合物，即酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI不能進(jìn)一步分解產(chǎn)生產(chǎn)物，因此相應(yīng)的酶促反應(yīng)速度下降。非競爭性抑制反應(yīng)模式在非競爭性抑制中，抑制劑(I)與酶(E)或酶-底物復(fù)合物(ES)以及底物(S)與酶-抑制劑復(fù)合物(EI)的結(jié)合都是可逆的，因此存在著如下的化學(xué)平衡式：+

S－S+

S－S+ESIEIEESEP圖3-6非競爭性抑制曲線⑴Vm值降低，Km值不變；Vm隨[I]的增加而降低；⑵雙倒數(shù)作圖所得直線相交于橫軸；⑶抑制劑對酶與底物的結(jié)合無影響，故底物濃度的改變對抑制程度無影響；抑制程度取決于抑制劑的濃度。特點：這類抑制最典型的例子是亮氨酸是精氨酸酶的一種非競爭性抑制劑。有某些重金屬離子如Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等對酶的抑制作用也屬于這一類。EDTA對金屬酶的抑制。舉例：③反競爭性抑制(uncompetitiveinhibition)：這類抑制作用的特點是只有在酶(E)與底物(S)結(jié)合后，才能與抑制劑(I)結(jié)合，形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI，與非競爭性抑制相似，這種中間的三元復(fù)合物，即酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI不能進(jìn)一步分解產(chǎn)生產(chǎn)物，因此相應(yīng)的酶促反應(yīng)速度下降。反競爭性抑制反應(yīng)模式反競爭性抑制的特點是，酶(E)必須先與底物(S)結(jié)合，然后才與抑制劑(I)結(jié)合，即抑制劑(I)與酶-底物復(fù)合物(ES)的結(jié)合是可逆的，因此存在著如下的化學(xué)平衡式：++ESESESIEP圖3-7反競爭性抑制曲線⑴Vm值和Km值都隨[I]的增加而降低；⑵雙倒數(shù)作圖所得為一組平行線；⑶必須有底物存在，抑制劑才能對酶產(chǎn)生抑制作用；抑制程度隨底物濃度的增加而增加。特點：舉例：這種抑制作用在單底物反應(yīng)中比較少見，而常見于多底物反應(yīng)中。目前已經(jīng)證明，肼類化合物對胃蛋白酶的抑制作用、氰化物對芳香硫酸酯酶的抑制作用、L-Phe和L-同型精氨酸等多種氨基酸對堿性磷酸酶的抑制作用都屬于反競爭性抑制。為了方便理解和記憶，我們現(xiàn)將無抑制劑和有抑制劑等不同情況下的米氏方程和Vmax及Km的變化總結(jié)歸納在表3-1中?？偨Y(jié)：5其它因素對酶促反應(yīng)速度的影響其它各種影響酶促反應(yīng)速度的因素主要包括：溫度、pH和激活劑等。5.1溫度對酶促反應(yīng)速度的影響溫度對酶促反應(yīng)的雙重影響：一、當(dāng)溫度升高時，與一般化學(xué)反應(yīng)一樣，反應(yīng)速度加快（Q10一般等于2）。二、溫度升高隨著溫度逐漸升高，酶蛋白會因逐漸變性而失活）。圖3-9溫度對酶促反應(yīng)速度的影響酶在固體狀態(tài)下比在溶液中對溫度的耐受力更高。酶的冰凍干粉制劑通常在冰箱中可存放幾個月以上，而酶溶液一般在冰箱中只能保存數(shù)周。所以酶制劑以固體保存為佳。一般來說，動物細(xì)胞內(nèi)的酶最適溫度一般為35～40℃，植物細(xì)胞中的酶最適溫度較動物細(xì)胞中稍高，通常在40～50℃之間，而微生物中的酶最適溫度差別則較大，如用于進(jìn)行PCR反應(yīng)的TaqDNA聚合酶的最適溫度可高達(dá)70℃。5.2pH對酶促反應(yīng)速度的影響通常在一定pH下，酶會表現(xiàn)出最大活力，而一旦高于或低于此pH，酶活力就會降低，我們把表現(xiàn)出酶最大活力時的pH稱為該酶的最適pH。在不同pH條件下進(jìn)行某種酶促化學(xué)反應(yīng)，然后將所測得的酶促反應(yīng)速度相對于pH來作圖，即可得到如圖3-10所示的鐘罩形曲線。圖3-10pH對酶活力的影響pH影響酶活力的原因可能包括以下3個方面：(1)過酸或過堿使酶的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，引起酶變性從而導(dǎo)致酶構(gòu)象的改變、酶活性隨之喪失。(2)pH影響了底物的解離狀態(tài)或酶分子活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離狀態(tài)或酶-底物復(fù)合物的解離狀態(tài)，而使底物不能與酶結(jié)合形成酶-底物復(fù)合物，或者形成酶-底物復(fù)合物后不能生成產(chǎn)物，使酶活性降低。(3)pH影響了與維持酶分子空間結(jié)構(gòu)有關(guān)的基團(tuán)解離，從而改變酶活性部位的構(gòu)象，進(jìn)而降低了酶的活性。與酶促化學(xué)反應(yīng)的最適溫度不同的是，各種酶在一定條件下都有其特定的最適pH，因此最適pH是酶的特性之一。但是酶的最適pH并不是一個常數(shù)，它受諸如底物種類和濃度、緩沖液種類和濃度等眾多因素的影響，因此只有在一定條件下最適pH才有意義。4種pH-酶活性曲線絕大多數(shù)酶的最適pH在5～8之間，動物體內(nèi)的酶最適pH多在6.5～8.0之間，植物及微生物中的酶酶最適pH多在4.5～6.5左右。但并不排除例外，如胃蛋白酶的最適pH為1.5，肝中精氨酸酶最適pH為9.7等等。5.3激活劑對酶促反應(yīng)速度的影響與抑制劑相對的是，凡是能提高酶活性的物質(zhì)都稱為激活劑(activator)，而激活劑中大部分是無機(jī)離子或簡單的有機(jī)化合物。無機(jī)離子

K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+及Fe2+

Cl-、Br-、I-、CN-、PO4-有機(jī)化合物EDTA可解除金屬對酶的抑制半胱氨酸、還原型谷胱甘肽、抗壞血酸對某些含巰基的酶有激活作用，保護(hù)酶分子中的巰基不被氧化激酶唾液淀粉酶一種激活劑只對某種酶起激活作用，而對另一種酶可能不起任何作用或起抑制作用。如對脫羧酶而言有激活作用的Mg2+對肌球蛋白腺三磷酶卻有抑制作用；而對脫羧酶而言有抑制作用的Ca2+對肌球蛋白腺三磷酶卻有激活作用。有時各種離子之間有拮抗作用如被K+激活的酶會受Na+的抑制，被Mg2+激活的酶會受Ca2+的抑制。有時金屬離子的作用也可以相互替代如作為激酶的激活劑的Mg2+可被Mn2+所代替。激活劑的選擇性第四章固定化酶和固定化細(xì)胞（2學(xué)時）主要內(nèi)容：

1固定化酶的定義與優(yōu)點

2酶固定化技術(shù)發(fā)展史

3固定化酶的制備方法

4固定化酶的特性

5固定化活細(xì)胞

6酶催化反應(yīng)器及其類型游離酶的使用蒸汽→酶解罐簡易圖加熱滅酶酶無法回收穩(wěn)定性差1固定化酶的定義與優(yōu)點所謂固定化酶(immobilizedenzyme)，是指在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用，并能反復(fù)和連續(xù)使用的酶。固定化酶的優(yōu)點：（1）同一批固定化酶能在工藝流程中重復(fù)多次地使用；（2）固定化后，和反應(yīng)物分開，有利于控制生產(chǎn)過程，同時也省去了熱處理使酶失活的步驟；（3）穩(wěn)定性顯著提高；（4）可長期使用，并可預(yù)測衰變的速度；（5）提供了研究酶動力學(xué)的良好模型。2酶固定化技術(shù)發(fā)展史

起始研究1916年系統(tǒng)研究1950年-工業(yè)化應(yīng)用1969年-1916年，Nelson和Griffin將蔗糖酶吸附在骨炭粉上，吸附以后酶不溶于水且具有和液體酶同樣的活性，實現(xiàn)了酶的固定化，可惜長期未得到重視。1953年Grubhofer和Schleith將聚氨基苯乙烯樹脂重氮化，然后將淀粉酶等與這種載體結(jié)合，制成了固定化酶。60年代后期，酶固定化技術(shù)迅速發(fā)展，出現(xiàn)了很多新的酶固定化方法。1969年，千畑一郎等將固定化氨基?；笐?yīng)用于DL-氨基酸的光學(xué)拆分上，來生產(chǎn)L-氨基酸，開創(chuàng)了固定化酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的先例。1973年，將固定化微生物細(xì)胞首次應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。目前，固定化技術(shù)已經(jīng)取得了許多重要成果，充分發(fā)揮了固定化酶和固定化細(xì)胞在改革工藝和降低成本方面的巨大潛力。但從目前的發(fā)展?fàn)顩r來看，盡管酶種類繁多，但已經(jīng)固定化的酶卻相對有限，采用固定化酶技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)的企業(yè)尚屬少數(shù)，真正在工業(yè)上使用的固定化酶還僅限于葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等為數(shù)不多的十幾個酶種，故仍需大力研究開發(fā)使更多的固定化酶和細(xì)胞能適用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。應(yīng)用現(xiàn)狀：3固定化酶的制備方法酶的固定化方法主要可分為四類：吸附法、包埋法、共價鍵結(jié)合法和交聯(lián)法。對于特定的目標(biāo)酶，要根據(jù)酶自身的性質(zhì)、應(yīng)用目的、應(yīng)用環(huán)境來選擇固定化載體和方法。在具體選擇時，一般應(yīng)遵循以下6個原則。

（1）酶與載體的結(jié)合部位不應(yīng)當(dāng)是酶的活性部位，固定化時應(yīng)采取盡可能溫和的條件。（2）酶與載體必須有一定的結(jié)合程度，利于反復(fù)使用。（3）用于固定化的載體必須有一定的機(jī)械強(qiáng)度，不易破壞或受損。（4）固定化應(yīng)盡可能不妨礙酶與底物的接近，以提高催化效率和產(chǎn)物的量。（5）所選載體應(yīng)不和底物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。（6）固定化酶的成本適中，以利于工業(yè)使用。3.1吸附法吸附法是通過載體表面和酶分子表面間的次級鍵相互作用而達(dá)到固定目的的方法，是固定化中最簡單的方法。酶與載體之間的親和力是范德華力、疏水相互作用、離子鍵和氫鍵等。吸附法又可分為物理吸附法和離子吸附法。物理吸附法是通過物理方法將酶直接吸附在水不溶性載體表面上而使酶固定化的方法。是制備固定化酶最早采用的方法。常用的載體：纖維素、膠原、淀粉及面筋、活性炭、氧化鋁、皂土、多孔玻璃、硅膠、二氧化鈦、羥基磷灰石等。優(yōu)點：操作簡單、價廉、條件溫和，載體可反復(fù)使用，酶與載體結(jié)合后，活性部位及空間構(gòu)象變化不大，固定化酶活力較高。缺點：酶和載體結(jié)合不牢固，在使用過程中容易脫落，常與交聯(lián)法結(jié)合使用。（1）物理吸附法離子吸附法(ionadsorption)是將酶與含有離子交換基團(tuán)的水不溶性載體以靜電作用力相結(jié)合的固定化方法，即通過離子鍵使酶與載體相結(jié)合的固定化方法。DEAE-纖維素吸附的α-淀粉酶、蔗糖酶已作為商品固定化酶。具有操作簡便、條件溫和、酶活力不易喪失等優(yōu)點。此外，吸附過程同時可以純化酶。（2）離子吸附法3.2包埋法包埋法是將酶包埋在高聚物的細(xì)微凝膠網(wǎng)格中或高分子半透膜內(nèi)的固定化方法。前者又稱為凝膠包埋法，酶被包埋成網(wǎng)格型；后者又稱為微膠囊包埋法，酶被包埋成微膠囊型。（1）凝膠包埋法凝膠包埋法常用的載體有海藻酸鈉凝膠、角叉菜膠、明膠、瓊脂凝膠、卡拉膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交聯(lián)樹脂等合成凝膠或樹脂。1-2%海藻酸鈉+酶液EEEE5%CaCl2溶液（2）微膠囊包埋法微膠囊包埋即將酶包埋在各種高聚物制成的半透膜微膠囊內(nèi)的方法。它使酶存在于類似細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境中，可以防止酶的脫落，防止微囊外的環(huán)境直接接觸，從而增加了酶的穩(wěn)定性。常用于制造微膠囊的材料有聚酰胺、火棉膠、醋酸纖維素等。適合于小分子為底物和產(chǎn)物的酶的固定化。如脲酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、過氧化氫酶等。3.3共價鍵結(jié)合法共價鍵結(jié)合法(covalentbinding）是將酶與聚合物載體以共價鍵結(jié)合的固定化方法。酶蛋白上可供載體結(jié)合的功能基團(tuán)有以下幾種：（1）酶蛋白N末端的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基。（2）酶蛋白C末端的α-羧基、天門冬氨酸殘基的β-羧基以及谷氨酸殘基的γ-羧基。（3）半胱氨酸殘基的巰基。（4）絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的羥基。（5）組氨酸殘基的咪唑基。（6）色氨酸殘基的吲哚基。（7）苯丙氨酸和酪氨酸殘基的苯環(huán)。其中最普遍的共價鍵結(jié)合基團(tuán)是氨基、羧基以及苯環(huán)。常用來和酶共價偶聯(lián)的載體的功能基團(tuán)有芳香氨基、羥基、羧基和羧甲基等。這種方法是固定化酶研究中最活躍的一大類方法，但必須注意，參加共價結(jié)合的氨基酸殘基應(yīng)當(dāng)是酶催化活性非必需基團(tuán)，如若共價結(jié)合包括了酶活性中心有關(guān)的基團(tuán)，會導(dǎo)致酶的活力損失。用共價鍵結(jié)合法制備的固定化酶，酶和載體之間都是通過化學(xué)反應(yīng)以共價鍵偶聯(lián)。由于共價鍵的鍵能高，酶和載體之間的結(jié)合相當(dāng)牢固，即使用高濃度底物溶液或鹽溶液，也不會使酶分子從載體上脫落下來，具有酶穩(wěn)定性好、可連續(xù)使用較長時間的優(yōu)點。但是采用該方法時，載體活化的難度較大，操作復(fù)雜，反應(yīng)條件較劇烈，制備過程中酶直接參與化學(xué)反應(yīng)，易引起酶蛋白空間構(gòu)象變化，酶活回收率一般為30%左右，甚至酶的底物的專一性等性質(zhì)也會發(fā)生變化，往往需要嚴(yán)格控制操作條件才能獲得活力較高的固定化酶。3.4交聯(lián)法交聯(lián)法（cross-linking）是使用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化方法。由于酶蛋白的功能團(tuán)，如氨基、酚基、巰基等參與反應(yīng)，所以酶的活性中心構(gòu)造可能受到影響，使酶明顯失活。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、異氰酸衍生物、雙偶氮聯(lián)苯和N,N′-乙烯雙順丁烯二酰亞胺等，其中使用最廣泛的是戊二醛。戊二醛和酶蛋白中的游離氨基發(fā)生Schiff反應(yīng)，形成薛夫堿，從而使酶分子之間相互交聯(lián)形成固定化酶。以上四種固定化酶方法各有其優(yōu)缺點（見表4-1）。往往一種酶可以用不同方法固定化，但沒有一種固定化方法可以普遍地適用于每一種酶。在實際應(yīng)用時，常將兩種或數(shù)種固定化方法并用，以取長補(bǔ)短。4固定化酶的特性4.1固定化酶的形狀固定化酶的形式多樣，依不同用途有顆粒、線條、薄膜和酶管等形狀。其中顆粒占絕大多數(shù)，它和線條主要用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，如裝成酶柱用于連續(xù)生產(chǎn)，或在反應(yīng)器中進(jìn)行批式攪拌反應(yīng)；薄膜主要用于酶電極，應(yīng)用于分析化學(xué)；酶管機(jī)械強(qiáng)度較大，亦宜用于工業(yè)生產(chǎn)。4.2酶活力固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶的活力低，其原因可能是：①酶活性中心的重