第三節(jié)酶的作用機(jī)理和酶的調(diào)節(jié)

第三節(jié)酶的作用機(jī)制和酶的調(diào)節(jié)一、必需基團(tuán)與活性中心必需基團(tuán):2.活性中心（活性部位）activecenter（site）

指與酶活性有關(guān)的基團(tuán)。常見的有Ser–OH,His咪唑基，Asp和Glu-COOH等。指酶分子中直接和底物結(jié)合并和酶的催化作用直接相關(guān)的部位。3.必需基團(tuán)與活性中心的關(guān)系必需基團(tuán)活性中心內(nèi)必需基團(tuán)活性中心外必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán)結(jié)合底物參與催化維持酶的空間結(jié)構(gòu)結(jié)合：酶與底物以次級鍵（H鍵、鹽鍵、范德華力等）結(jié)合。催化：酶催化底物鍵的斷裂和新鍵的形成4.活性中心的特點：1）活性部位只占酶分子的相當(dāng)小的部位。2）由少數(shù)幾個氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)組成。3）對于結(jié)合酶，輔因子往往也是活性中心的組分。4）構(gòu)成酶活性中心的這些基團(tuán)在空間上相距很近。酶氨基酸殘基數(shù)活性部位的氨基酸殘基溶菌酶129Asp52,Glu35胰凝乳蛋白酶241His57,Asp102,Ser195羧肽酶307Arg127,Glu270,Tyr248,Arg145，

Zn2+某些酶活性中心的氨基酸殘基4.研究酶活性中心的主要方法：（1）酶的專一性研究（2）酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾法DFP(二異丙基氟磷酸)TPCK(對甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲基酮)專一性底物的結(jié)構(gòu)特點競爭性抑制劑的必需結(jié)構(gòu)活性中心結(jié)構(gòu)與胰凝乳蛋白酶His57共價結(jié)合與胰凝乳蛋白酶Ser195共價結(jié)合親和標(biāo)記法（Affinitylabelling）（3）X射線晶體結(jié)構(gòu)分析法

對酶的空間構(gòu)象進(jìn)行分析，了解酶活性部位氨基酸殘基的位置及狀態(tài)。（4）基因定點誘變法胰蛋白酶：Asp102→Asn102,水解效率降低5000倍。

例：PCR定點突變技術(shù)二、酶的作用機(jī)理酶反應(yīng)的獨特性質(zhì)：酶反應(yīng)包括兩類：①電子轉(zhuǎn)移；②電子+質(zhì)子以及其它基團(tuán)轉(zhuǎn)移。

催化作用涉及氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)和輔因子。

巨大酶的結(jié)構(gòu)對于穩(wěn)定活性部位的構(gòu)象是必需的?；钚灾行木哂幸粋€以上的催化基團(tuán)，有利于協(xié)同催化；結(jié)合部位可使底物以固定方位結(jié)合。與酶的高效率有關(guān)的因素：鄰近與定向效應(yīng)底物形變與誘導(dǎo)契合共價催化酸堿催化多元催化和協(xié)同效應(yīng)活性中心是低介電區(qū)域1.鄰近與定向效應(yīng)鄰近效應(yīng)（proximity）指底物分子與酶活性中心的靠近。

定向效應(yīng)（orientation）指底物的反應(yīng)基團(tuán)與酶活性中心的結(jié)合和催化基團(tuán)嚴(yán)格地‘定向’。（靠近）（定向）例：羧肽酶A的催化機(jī)制Fig.2-16Structureofcarboxypeptidase.307aa，催化C末端肽鍵的水解,活性中心含Arg127,Glu270,Tyr248,Arg145,Zn2+38%螺旋17%折疊Fig.2-17Zn2+islocatedintheactivecenterofcarboxypeptidase.Fig.2-18Theconformationalchangeinducedincarboxypeptidasebythebindingofasubstrate(Gly-Tyr).Arg145:胍基移動0.2nm,與末端羧基形成鹽鍵Glu270：羧基移動0.2nmTyr248：酚基移動1.2nm,與N端氨基形成H鍵，封閉疏水空腔。誘導(dǎo)契合Fig.2-19Themechanismforcarboxypeptidasereaction.–(A)①H2O的OH-親核攻擊羰基C②Glu270（廣義堿）接受H2O的H+（底物：苯甲酰甘氨酰苯丙氨酸）Fig.2-20Themechanismforcarboxypeptidasereaction.–(B)③

Zn2+和Arg127胍基通過靜電作用穩(wěn)定帶負(fù)電荷的四面體過渡態(tài)中間體④Glu270（廣義酸）的

-COOH提供一個H+給肽基-NH-Fig.2-21Themechanismforcarboxypeptidasereaction–(C)⑤肽鍵斷裂2.底物的形變(distortion)例：溶菌酶的催化機(jī)制含義：

酶使底物敏感鍵產(chǎn)生“電子張力”或變形，從而促使敏感鍵更易斷裂。

129aa,活性中心含Asp52,Glu35，催化某些細(xì)菌細(xì)胞壁多糖的水解。Fig.2-22Thestructureoflysozyme（溶菌酶）.Glu35andAsp52areshowninwhile.25%螺旋還具折疊Fig.2-23Enzyme-substrateinteractionsatthelysozymeactivesite.活性部位可容納六糖殘基DECFFig.2-24Thelysozymereaction.NAG:N-乙酰氨基葡糖NAM：

N-乙酰氨基葡糖乳酸細(xì)胞壁多糖：NAG-NAM的共聚物水解NAMC1和NAGC4之間的（1-4）糖苷鍵Fig.2-25Themechanismforlysozymereaction.-(A)Asp52側(cè)鏈羧基為-COO-,Glu35為-COOH①Glu35–COOH提供一個H+給糖苷鍵上O原子②D環(huán)C1與糖苷鍵O原子間的鍵斷開，形成C+過渡態(tài)中間物H+H2OOH-—HOHFig.2-26Themechanismforlysozymereaction.-(B)③C+結(jié)合來自H2O的OH-，Glu35質(zhì)子化④產(chǎn)物離開酶分子Fig.

2-27Themechanismforthelysozymereaction.-(C)D環(huán)形變，由椅式構(gòu)象→半椅式構(gòu)象，C1,C2,C5,O位于一個平面，O的負(fù)電性可穩(wěn)定C+

。3.共價催化（covalentcatalysis）親核催化

指酶分子中親核基團(tuán)對底物中親電基團(tuán)進(jìn)行攻擊。

親電催化指酶分子中親電基團(tuán)對底物中親核基團(tuán)進(jìn)行攻擊。如：H+，Mn2+,Fe3+,Mg2+,磷酸吡哆醛PC+HO指底物與酶生成一個反應(yīng)活性很高的共價中間物，從而降低反應(yīng)活化能，使反應(yīng)加速。底物親電中心?；柞；腔傅挠H核基團(tuán)：含多電子的原子或基團(tuán)。例：Ser-OH,

Cys–SH,His咪唑基磷酰酶酰基化酶葡糖酶例：蛋白水解酶類（Ser蛋白酶）對肽鍵的共價催化自發(fā)緩慢快快?；?4.酸堿催化(acid-basecatalysis)狹義的酸堿催化（specificacid-basecatalysis）酶活性中心的某些基團(tuán)可作為質(zhì)子供體和受體對底物進(jìn)行酸堿催化。廣義的酸堿催化（generalacid-basecatalysis）H+和OH-對反應(yīng)的催化。

質(zhì)子受體和供體對反應(yīng)的催化。Functionalgroupsinvolvedingeneralacid-basecatalysis例：胰凝乳蛋白酶催化反應(yīng)機(jī)制Fig.2-28Structureofchymotrypsin(white)inacomplexwitheglinC(blueribbonstructure),atargetprotein.His57（blue）、Asp102（red）

、Ser195（yellow）含241aa,活性中心含His57,Asp102,Ser195(催化三聯(lián)體)Fig.

2-29Thecatalytictriad(催化三聯(lián)體)ofchymotrypsin.①?；A段:His57從Ser195上吸收一個H+；Ser195的O-親核攻擊肽鍵羰基C原子;肽鍵羧基部分與Ser195共價相連，肽鍵氨基部分以H鍵與His57相連（ES）。（Asp102穩(wěn)定His57正電荷形式）ESFig.2-30Adetailedmechanismforthechymotrypsinreaction.肽鍵斷裂，肽鍵氨基部分從His57獲得一個H+，氨基部分釋放；肽鍵羧基部分與Ser195相連，形成?；浮＂诿擋ｋA段：水分子攻擊?；福琀is57

吸收一個H+，OH-攻擊羰基C；His57供出一個H+給Ser195，釋放C末端產(chǎn)物。酶恢復(fù)原狀。?；敢鹊鞍酌敢饶榈鞍酌笍椥缘鞍酌?41aa240aa223aa絲氨酸蛋白酶家族具有相似的催化機(jī)制Fig.2-31Comparisonoftheaminoacidsequencesofchymotrypsinogen,trypsinogen,andelastase.

Fig.2-32Thesubstrate-bindingpocketsoftrysin,chymotrypsin,andelastase.Ser189Gly226Gly216Ser189Thr226Val216Gly216Gly226堿性aa

芳香族aa

小的中性aa選擇裂解5.多元催化和協(xié)同效應(yīng)在酶催化反應(yīng)中，常常由幾個催化反應(yīng)配合在一起共同起作用。羧肽酶A：鄰近與定向；酸堿催化溶菌酶：鄰近與定向；底物形變；酸堿催化胰凝乳蛋白酶：鄰近與定向；共價催化；酸堿催化6.活性中心是低介電環(huán)境

酶的活性中心是一個非極性環(huán)境，可加強(qiáng)帶電基團(tuán)的靜電作用，并使得底物分子敏感鍵和酶的催化基團(tuán)有更大的反應(yīng)力。三、酶活性的調(diào)節(jié)控制別構(gòu)調(diào)節(jié)可逆的共價修飾調(diào)控酶原的激活（一）別構(gòu)調(diào)節(jié)（allostericeffect）1.別構(gòu)酶的特點和性質(zhì)（1）寡聚酶活性部位別構(gòu)部位結(jié)合底物結(jié)合底物外其它物質(zhì)（效應(yīng)劑）通過改變酶分子構(gòu)象而改變酶活力的調(diào)節(jié)。別構(gòu)酶別構(gòu)效應(yīng)劑：引起別構(gòu)效應(yīng)的物質(zhì)。（2）具有別構(gòu)效應(yīng)別構(gòu)激活劑（正效應(yīng)劑）別構(gòu)抑制劑（負(fù)效應(yīng)劑）凡是和酶分子結(jié)合使酶反應(yīng)速度加快的物質(zhì)。凡是和酶分子結(jié)合使酶反應(yīng)速度減慢的物質(zhì)。一般為代謝反應(yīng)序列的終產(chǎn)物。通過調(diào)節(jié)別構(gòu)酶的活力，可對代謝反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。（3）別構(gòu)酶的動力學(xué)：S型曲線[S]vAllostericenzymeNonregulatoryenzymeVmax10%Vmax90%VmaxFig.2-33Effectof[S]onthevelocityoftwokindsofcatalyticreaction.非調(diào)節(jié)酶[S]90%Vmax10%Vmax[S]=81[S]90%Vmax10%Vmax[S]=3別構(gòu)酶底物濃度只需增加3倍，就可使酶反應(yīng)速度由10%Vmax快速增加到90%Vmax。

S型曲線表明當(dāng)?shù)孜餄舛劝l(fā)生微小變化時，酶反應(yīng)速度可以快速增加，反應(yīng)出別構(gòu)酶可以靈敏地調(diào)節(jié)酶反應(yīng)速度。2.別構(gòu)酶舉例天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（ATCase）UMPCTP氨甲酰磷酸+AspATCase氨甲酰天冬氨酸Pi-ATP+催化的反應(yīng)：結(jié)構(gòu)特點：Mr.310,00012條多肽鏈6條催化鏈（C）6條調(diào)節(jié)鏈（R）2個催化三聚體3個調(diào)節(jié)二聚體CCCCCCRRRRRR每個C鏈具一個活性中心（結(jié)合底物）每個R鏈具一個別構(gòu)中心（結(jié)合ATP或CTP）Fig.2-34Thethree-dimensionalsubunitarchitectureoftheregulatoryenzymeaspartate

transcarbamylase.Fig.2-35Vversus[S]curvesforanallostericsystem.加激活劑ATP增加酶對底物的親和力加抑制劑CTP降低酶對底物的親和力3.別構(gòu)模型齊變模型（WMC）序變模型（KNF）(二)可逆的共價修飾調(diào)控共價調(diào)節(jié)酶共價修飾類型：某種酶可由于其它酶對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行共價化學(xué)修飾，從而使其在活性形式與非活性形式之間相互轉(zhuǎn)變。包括磷酸化、腺苷?；?、尿苷?；?、甲基化等。

作用特點：級連放大作用磷酸化腺苷?；蜍挣；疉DP-核糖基化甲基化（最為普遍）Fig.2-36Regulationofglycogenphosphorylaseactivitybycovalentmod