第三章 發(fā)酵培養(yǎng)基

第三章發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基設(shè)計第一節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的要求和種類第二節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及來源第三節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計原理與優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的要求①培養(yǎng)基能夠滿足產(chǎn)物最經(jīng)濟的合成。②發(fā)酵后所形成的副產(chǎn)物盡可能的少。③培養(yǎng)基的原料應(yīng)因地制宜，價格低廉；且性能穩(wěn)定，資源

豐富，便于采購運輸，適合大規(guī)模儲藏，能保證生產(chǎn)上的

供應(yīng)。④所選用的培養(yǎng)基應(yīng)能滿足總體工藝的要求，如不應(yīng)該影響

通氣、提取、純化及廢物處理等。二、培養(yǎng)基的類型及功能1、按純度合成培養(yǎng)基

:原料其化學(xué)成分明確、穩(wěn)定重復(fù)性強

天然培養(yǎng)基:采用天然原料適合于各類微生物的生長，而一般自養(yǎng)生物不能生長半合成養(yǎng)基:既含有天然原料，又含有化學(xué)藥品

應(yīng)用范圍廣泛2、按物理狀態(tài)固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基3、按用途（從發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用考慮）

培養(yǎng)基按其用途可分為孢子（斜面）培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基三種

孢子培養(yǎng)基是供制備孢子用的培養(yǎng)基；營養(yǎng)不宜豐富種子培養(yǎng)基是滿足菌種生長的培養(yǎng)基；營養(yǎng)豐富，濃度不高；與發(fā)酵培養(yǎng)基成分接近發(fā)酵培養(yǎng)基是滿足大生產(chǎn)中大量菌體生長和繁殖以及代謝產(chǎn)物積累的營養(yǎng)基質(zhì)。第二節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及來源

一、碳源1、作用提供微生物菌種的生長繁殖所需的能源和合成菌體所必需的碳成分

提供合成目的產(chǎn)物所必須的碳成分2、來源糖類、油脂、有機酸、烴和醇類3、工業(yè)上常用的糖類①葡萄糖

所有的微生物都能利用葡萄糖

但是會引起葡萄糖效應(yīng)

工業(yè)上常用淀粉水解糖，但是糖液必須達到一定的質(zhì)量指標不同的制糖工藝生產(chǎn)的糖液質(zhì)量差別很大②糖蜜糖蜜是制糖生產(chǎn)時的結(jié)晶母液，它是制糖工業(yè)的副產(chǎn)物。

糖蜜主要含有蔗糖，總糖可達50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。不用加工方法對甘蔗糖蜜的影響糖蜜使用的注意點：除糖份外，含有較多的雜質(zhì)，其中有些是有用的，但是許多都會對發(fā)酵產(chǎn)生不利的影響，需要進行預(yù)處理。例：谷氨酸發(fā)酵有害物資：膠體成分（起泡、結(jié)晶）、鈣鹽（結(jié)晶）

生物素（發(fā)酵控制）預(yù)處理：澄清→脫鈣→脫除生物素例：檸檬酸發(fā)酵有害物質(zhì)：鐵離子含量高（導(dǎo)致異檸檬酸的生成）預(yù)處理：→黃血鹽②淀粉、糊精使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類缺點：難利用、

發(fā)酵液比較稠、一般>2.0%時加入一定的α-淀粉酶

成分比較復(fù)雜，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等等。優(yōu)點：來源廣泛、價格低

難利用，可以解除葡萄糖效應(yīng)例：地衣芽孢桿菌生產(chǎn)α-淀粉酶碳源對生長和產(chǎn)酶的影響碳源細胞量α-淀粉酶葡萄糖4.20蔗糖4.020糊精3.0638.2淀粉3.0940.2該淀粉酶是誘導(dǎo)酶。4.油和脂肪微生物需具有脂肪酶。分解脂肪的需氧量大。低濃度的高級脂肪酸可刺激細菌生長，但濃度較高時往往有毒害作用。常用：豆油、花生油、菜籽油、棉籽油等5.有機酸如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等低級脂肪酸；乳酸、檸檬酸、反丁烯二酸、琥珀酸、蘋果酸、α-酮酸、酒石酸等。注意發(fā)酵液酸堿度變化。6.烴和醇類正烷烴已用于有機酸、氨基酸、維生素、抗生素和酶制劑的工業(yè)發(fā)酵中。醇類中甘露醇、甘油、低濃度的乙醇都可作為碳源。二、氮源主要用于構(gòu)成菌體細胞物質(zhì)（氨基酸，蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物。常用的氮源可分為兩大類：有機氮源和無機氮源。

1、無機氮源種類：銨鹽、硝酸鹽和氨水特點：微生物對它們的吸收快，所以也稱為快速利用的氮源。但無機氮源的迅速利用常會引起pH的變化如：

(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2

→NH3+2H2O+NaOH

無機氮源被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質(zhì)，這種經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質(zhì)的無機氮源叫生理酸性物質(zhì)，如硫酸銨，若菌體代謝后能產(chǎn)生堿性物質(zhì)的則此種無機氮源稱為生理堿性物質(zhì)，如硝酸鈉。正確使用生理酸堿性物質(zhì)，對穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的pH有積極作用。所以選擇合適的無機氮源有兩層意義：

滿足菌體生長

穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH在黑曲霉發(fā)酵過程中用硫酸銨作氮源，培養(yǎng)液中留下的SO42-使pH下降，而這對提高糖化型淀粉酶的活力有利，且較低的pH還能抑制雜菌的生長，防止污染。氨水在發(fā)酵中除可以調(diào)節(jié)pH外，它也是一種容易被利用的氮源，在許多抗生素的生產(chǎn)中得到普遍使用。在制液體曲時，用NaNO3作氮源，菌絲長得粗壯，培養(yǎng)時間短，且糖化力較高。這是因為NaNO3的代謝而得到的NaOH可中和曲霉生長中所釋放出的酸，使pH穩(wěn)定在工藝要求的范圍內(nèi)。2、有機氮源工業(yè)上常用的有機氮源都是一些廉價的原料來源：尿素，動、植物粉類，玉米漿等動、植物粉類：花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、廢菌絲體和酒糟。尿素：很常用的氮源，但其加熱滅菌時不穩(wěn)定，在工業(yè)上使用受到一定的限制。成分復(fù)雜：除提供氮源外，有些有機氮源還提供大量的無機鹽及生長因子。例玉米漿：①可溶性蛋白、生長因子（生物素）、苯乙酸②較多的乳酸③硫、磷、微量元素等玉米漿是玉米淀粉生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，含有各種必須的氨基酸、維生素和無機鹽以及還原糖、磷、微量元素和生長素，是一種很容易被微生物利用的良好氮源，被廣泛用于發(fā)酵工業(yè)制備培養(yǎng)基。

有機氮源成分復(fù)雜可以從多個方面對發(fā)酵過程進行影響，而另一方面有機氮源的來源具有不穩(wěn)定性。所以在有機氮源選取時和使用過程中，必須考慮原料的波動對發(fā)酵的影響。

有機氮源除提供氮源外，一般還提供前體、生長因子、無機鹽及微量元素等。氮源使用的一些相關(guān)問題：

有機氮源和無機氮源應(yīng)當混合使用早期：容易利用易同化的氮源—無機氮源中期：菌體的代謝酶系已形成，則利用蛋白質(zhì)

有些產(chǎn)物會受氮源的誘導(dǎo)和阻遏例：蛋白酶的生產(chǎn)

有機氮源選取時也要考慮微生物的同化能力

開發(fā)效果好、有針對性的有機氮源仍然是令人感興趣

的課題三、無機鹽及微量元素1、作用：各種不一樣2、來源：C、N源，以鹽的形式補充3、用量：根據(jù)具體的產(chǎn)品，以實驗決定，P454、使用注意點對于其它渠道有可能帶入的過多的某種無機離子和微量元素在發(fā)酵過程中必須加以考慮例：鐵離子青霉素發(fā)酵中，鐵離子的濃度要小于20μg/ml

發(fā)酵罐必須進行表面處理B、使用時注意鹽的形式（pH的變化）例：黑曲酶NRRL-330,生產(chǎn)α-淀粉酶，P對酶活的影響pH酶活不加4.25120分鐘加K2HPO45.4530分鐘加KH2PO44.6275分鐘四、生長因子、前體和產(chǎn)物促進劑

從廣義上講，凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長因子。

1、生長因子

如以糖質(zhì)原料為碳源的谷氨酸生產(chǎn)菌均為生物素缺陷型，以生物素為生長因子,生長因子對發(fā)酵的調(diào)控起到重要的作用。

有機氮源是這些生長因子的重要來源，多數(shù)有機氮源含有較多的B簇維生素和微量元素及一些微生物生長不可缺少的生長因子，如玉米漿。前體指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中合成到產(chǎn)物物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。2、前體青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136COOHCH2作用：前體有助于提高產(chǎn)量和組份用量：前體的用量可以按分子量衡算，具體使用有個轉(zhuǎn)化率的問題例：6000單位/ml的青霉素G-Na（MW356),需要多少苯乙酸(MW136)1mg=1667u

青霉素＝6000*0.6（微克）＝36mg/ml

苯乙酸＝（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%實際使用時的轉(zhuǎn)化率在46-90%之間

例某廠單耗為：0.337（kg/10億青霉素）

轉(zhuǎn)化率為：0.6/(0.337*36/13.8)=68%

前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利

用法：前體使用時普遍采用流加的方法前體相對價格較高，添加過多，容易引起揮發(fā)和氧化，流加也有利于提高前體的轉(zhuǎn)化率。苯乙酸，一般基礎(chǔ)料中僅僅添加0.07%3、產(chǎn)物促進劑指那些非細胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。

促進劑提高產(chǎn)量的機制還不完全清楚，其原因是多方面的。

有些促進劑本身是酶的誘導(dǎo)物；

有些促進劑是表面活性劑，可改善細胞的透性，改善

細胞與氧的接觸從而促進酶的分泌與生產(chǎn)，

也有人認為表面活性劑對酶的表面失活有保護作用；

有些促進劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。五、水

對于發(fā)酵工廠來說，恒定的水源是至關(guān)重要的，因為在不同水源中存在的各種因素對微生物發(fā)酵代謝影響甚大。

水源質(zhì)量的主要考慮參數(shù)包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量。對于釀造行業(yè)，水的重要性不言而喻對于常規(guī)發(fā)酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清潔的水。第三節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計和優(yōu)化

目前還不能完全從生化反應(yīng)的基本原理來推斷和計算出適合某一菌種的培養(yǎng)基配方，只能用生物化學(xué)、細胞生物學(xué)、微生物學(xué)等的基本理論，參照前人所使用的較適合某一類菌種的經(jīng)驗配方，再結(jié)合所用菌種和產(chǎn)品的特性，采用搖瓶、玻璃罐等小型發(fā)酵設(shè)備，按照一定的實驗設(shè)計和實驗方法選擇出較為適合的培養(yǎng)基。

一、培養(yǎng)基成分選擇的原則

菌種的同化能力

代謝的阻遏和誘導(dǎo)

合適的C、N比100∶0.2～2.0

pH的要求

（一）、理論轉(zhuǎn)化率與實際轉(zhuǎn)化率

理論轉(zhuǎn)化率是指理想狀態(tài)下根據(jù)微生物的代謝途徑進行物料衡算，所得出的轉(zhuǎn)化率的大小。

實際轉(zhuǎn)化率是指實際發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化率的大小

如何使實際轉(zhuǎn)化率接近于理論轉(zhuǎn)化是發(fā)酵控制的一個目標

二、成分含量的確定例:

如在酒精生產(chǎn)中葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的理論轉(zhuǎn)化率計算如下∶

葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的代謝總反應(yīng)衡算式為∶C6H12O6─→2C2H5OH+2CO2

葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的理論得率為∶2*46

Y=───=0.51180（二）、實驗設(shè)計

培養(yǎng)基成分的含量最終都是通過實驗獲得的

合理的實驗方法多因子實驗：均勻設(shè)計、

正交實驗設(shè)計、

響應(yīng)面分析等。單因子實驗③當培養(yǎng)基成分確定后，剩下的問題就是各成分最適的濃度，由于培養(yǎng)基成分很多，為減少實驗次數(shù)常采用一些合理的實驗設(shè)計方法。三、培養(yǎng)基設(shè)計的步驟①根據(jù)前人的經(jīng)驗和培養(yǎng)基成分確定時一些必須考慮的問題，初步確定可能的培養(yǎng)基成分；②通過單因子實驗最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分；類胡蘿卜素高產(chǎn)菌Y11的鑒定及培養(yǎng)條件的優(yōu)化郭秒,食品與工業(yè)發(fā)酵，2004類胡蘿卜素的作用：色素、營養(yǎng)保健產(chǎn)生菌：類球紅細菌

原培養(yǎng)基:

初步確定可能的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)

通過單因子實驗確定適宜的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)考慮到成本：乙酸鈉是較為合適的碳源進一步：乙酸鈉的濃度2%比較好

正交設(shè)計確定優(yōu)化的配方結(jié)果：碳源：乙酸鈉0.2%氮源：氯化銨0.2%

酵母膏0.03%無機鹽:復(fù)合無機鹽0.05%改進后培養(yǎng)基原培養(yǎng)基第三章發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的設(shè)計改進后培養(yǎng)基的發(fā)酵結(jié)果四、搖瓶水平到反應(yīng)器水平的優(yōu)化配方搖瓶、反應(yīng)器培養(yǎng)基研究的兩個層次

搖瓶——培養(yǎng)基設(shè)計的第一步

反應(yīng)器—最終的優(yōu)化的基礎(chǔ)配方例：青霉素發(fā)酵發(fā)酵搖瓶：玉米漿4%，乳糖10%，(NH4)SO40.8%

輕質(zhì)碳酸鈣1%發(fā)酵罐:葡萄糖流加控制總量10-15%，玉米漿總量4-8%

補加硫酸、前體等搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵罐培養(yǎng)基差別可能很大很大搖瓶優(yōu)化配方：菌種篩選，反應(yīng)器研究的基礎(chǔ)發(fā)酵罐：反應(yīng)器水平,

可以得出最終優(yōu)化的基礎(chǔ)配方pH控制搖床：反應(yīng)器水平上的搖瓶研究五、培養(yǎng)基設(shè)計時注意的一些相關(guān)問題

原料及設(shè)備的預(yù)處理

原材料的質(zhì)量

發(fā)酵特性的影響

在抗生素發(fā)酵生產(chǎn)中往往喜歡所謂的“稀配方”，因為它既降低成本、滅菌容易、且使氧傳遞容易而有利于目的產(chǎn)物的生物合成。如果營養(yǎng)成分缺乏，則可通過中間補料方法予以彌補。

滅菌

在大規(guī)模發(fā)酵中應(yīng)該盡可能的采取連續(xù)滅菌的操作，而且保證滅菌條件的穩(wěn)定是保證發(fā)酵穩(wěn)定的前提

有時避免營養(yǎng)物質(zhì)在加熱的條件下，相互作用，可以將營養(yǎng)物質(zhì)分開消毒。

有些物質(zhì)由于揮發(fā)和對熱非常敏感，就不能采用濕熱的滅菌方法

Na2HPO4+CaCO3→CaHPO4+Na2CO3第四節(jié)、重組產(chǎn)品培養(yǎng)基的介紹

大腸桿菌高密度度培養(yǎng)：碳源：葡萄糖、甘油氮源：胰蛋白胨、酵母粉無機鹽：磷、鎂等蛋白胨、酵母粉(OXOID)章越，生物工程學(xué)報，2004

動物細胞培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基:F12、DMEM等血清(5-10%)：胎牛(FBS)、小牛(CS)、馬(HS)水：超純水其它：NaHCO3（CO2）、抗生素GONG,J.B.B.2003本章小節(jié)：

培養(yǎng)基—菌體生長所需的營養(yǎng)以及其它必須的條件

了解發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，發(fā)酵培養(yǎng)基常用的原料以

及其中的基本概念

發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化與設(shè)計是發(fā)酵工程的基本問題，掌握發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化與設(shè)計的思路、了解其中的方法。習(xí)題1、生物技術(shù)的幾大組成部分：基因工程、細胞工程、酶工程和發(fā)酵工程，雖可自成體系，構(gòu)成獨立完整的技術(shù)，但它們又是相互(

)

，形成了對社會的廣泛影響。A加強

B補充

C滲透

D作用2、酶工程和發(fā)酵工程是生物技術(shù)實現(xiàn)(

)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

A產(chǎn)業(yè)化

B商品化

C社會化

D安全化一、選擇題BC3．以下發(fā)酵產(chǎn)品中不屬于微生物代謝產(chǎn)物的是（）

A．味精B．啤酒C．“人造肉”

D．人生長激素5．微生物代謝的調(diào)節(jié)屬于（）A．神經(jīng)調(diào)節(jié)B.激素調(diào)節(jié)C．酶的調(diào)節(jié)

D.基因調(diào)節(jié)4．關(guān)于單細胞蛋白敘述正確的是(）A．是微生物細胞中提取的蛋白質(zhì)B．通過發(fā)酵生產(chǎn)的微生物菌體C．是微生物細胞分泌的抗生素D．單細胞蛋白不能作為食品CB6．用于谷氨酸發(fā)酵的培養(yǎng)基需添加的生長因子是（）A．氨基酸B．堿基C．核苷酸D．生物素8．不能作為異養(yǎng)微生物碳源的是（）

A．牛肉膏B．含碳有機物

C．石油D．含碳無機物7.不能以糖類作為碳源的細菌是（）

A．假單胞菌B．乳酸菌

C．甲基營養(yǎng)菌D．固氮菌DCD9．配制培養(yǎng)基的敘述中正確的是（）A．制作固體培養(yǎng)基必須加入瓊脂B．加入青霉素可得到放線菌C．培養(yǎng)自生固氮菌不需要氮源D．發(fā)酵工程一般用半固體培養(yǎng)基10．發(fā)酵是利用微生物大量生產(chǎn)有用代謝產(chǎn)物的一種生產(chǎn)方式。通常說的谷氨酸發(fā)酵又屬于

（）A.液體發(fā)酵和需氧發(fā)酵B．液體發(fā)酵和厭氧發(fā)酵

C．固體發(fā)酵和需氧發(fā)酵D．固體發(fā)酵和厭氧發(fā)酵C11．在賴氨酸發(fā)酵中，應(yīng)用的不能合成高絲氨酸脫氫酶的黃色短桿菌是如何選育的（

）

A自然界中菌種的篩選

B人工誘變

C基因工程

D細胞工程12.在次級代謝物的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，添加前體一般是（）添加。A少量多次B多量少次C在細胞生長期13．在實驗中我們所用到的淀粉水解培養(yǎng)基是一種（

）培養(yǎng)基A基礎(chǔ)培養(yǎng)基B加富培養(yǎng)基C選擇培養(yǎng)基D鑒別培養(yǎng)基15.要從多種細菌中分離某種細菌，培養(yǎng)基要用（）A.加入青霉素的培養(yǎng)基B．加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基C．固體培養(yǎng)基

D.液體培養(yǎng)基16．根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，劃分的發(fā)酵種類是

(

)A抗生素發(fā)酵

B、維生素發(fā)酵

C、氨基酸發(fā)酵

D、液體發(fā)酵工業(yè)發(fā)酵的發(fā)展經(jīng)歷了以下幾個階段：

、

、

、

、

、和

。2.制備淀粉水解糖的方法有

、

、和

。（天然發(fā)酵階段、純培養(yǎng)技術(shù)的建立、通氣攪拌發(fā)酵技術(shù)的建立、代謝控制發(fā)酵技術(shù)的建立、開拓新型發(fā)酵原料時期、基因工程段。）（酸法、酸酶法、雙酶法）3.培養(yǎng)基的種類繁多，一般可根據(jù)其營養(yǎng)物質(zhì)的不同來源分為（）、（）和（），根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)的不同分為（