實驗 血清甘油三酯與膽固醇的測定

酶法測定血清中的甘油三酯

一.目的要求了解血清甘油三酯酶法測定的原理了解血清甘油三酯測定的臨床意義掌握酶標(biāo)儀測定法的原理和操作二．實驗原理血清甘油三酯的測定是血脂分析的重要內(nèi)容之一。目前，國內(nèi)多數(shù)醫(yī)院采用酶法測定。酶法又分為：一步終點比色法和兩步終點比色法。兩步法的主要優(yōu)點是消除了游離甘油的干擾。脂蛋白脂肪酶（LPL）可將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。甘油在甘油激酶催化下，生成磷酸甘油，后者在磷酸甘油氧化酶（GPO）催化下，生成磷酸二羥丙酮和H2O2。H2O2在過氧化物酶（POD）催化下與4-氨基安替比林（4-AAP）及ESPAS（3-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺）反應(yīng)生成紫色醌亞胺染料。形成的醌亞胺染料色澤強(qiáng)度與樣品中甘油三酯的含量成正比。測定標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液和待測血清樣品反應(yīng)生成的醌亞胺染料吸光度（A）值，即可求出待測血清樣品中甘油三酯的濃量。二．實驗原理反應(yīng)如下：甘油三酯（TG）＋3H2O甘油＋ATP甘油-1-磷酸＋O2H2O2＋4-AAP＋ESPAS

目前，TG測定試劑盒多根據(jù)以上原理配制，用一步終點法測定。甘油＋3RCOOH（脂肪酸）甘油-1-磷酸＋ADP磷酸二羥丙酮＋H2O2醌亞胺染料＋4H2OLPL????三．器材及試劑1．器材：

酶標(biāo)儀，酶標(biāo)板，37度恒溫箱，移液槍。2.試劑：一步法：Tris-HCl緩沖液（pH7.6，濃度為150mmlo/L），LPL或脂肪酶（3000u/L），甘油激酶（GK）（250u/L），ATP（0.5mmol/L），磷酸甘油氧化酶（GPO）（3000u/L），過氧化物酶（POD；辣根）（1000u/L），膽酸鈉（3.5mmol/L），硫酸鎂（17.5mmol/L），4-氨基安替比林（4-AAP）（1mmol/L），4-氯酚（3.5mmol/L），TritonX-100（0.1g/L）。四．操作步驟取酶標(biāo)條1個（每個樣品2個重復(fù)），按下表操作：

試劑（ul）空白管標(biāo)準(zhǔn)管測定管蒸餾水3－－2.26mmol/L標(biāo)準(zhǔn)品(TG)－3－樣本——3酶試劑（工作液）30030030037℃保溫5min，空白調(diào)零，550nm處測定各孔A值。五．計算（標(biāo)準(zhǔn)液濃度=2.26mmol/L）（mmol/L）正常參考值：0.56~~1.7mmol/L，老年約為：2.26mmol/L。美國國家膽固醇教育計劃對空腹TG水平分解線的修訂意見為（1993年）：TG正常：<2.3mmol/LTG增高的比緣：2.3~4.5mmol/L高TG血癥：>4.5mmol/L胰腺炎高危：>11.3mmol/L六．注意事項試劑出現(xiàn)紅色不能再用，試劑空白吸光度A550nm<0.05；兩步法37℃4分鐘能完全排除游離甘油；GPO純度不高時，因其它氧化酶的存在而產(chǎn)生額外的H2O2，使得結(jié)果偏高；溫度控制、吸量的準(zhǔn)確度對結(jié)果影響較大；甘油三酯增高常見于肥胖、糖尿病、腎病綜合癥、糖原沉積癥、高血壓、冠心病等，也隨年齡而上升。降低多見于甲狀腺功能亢進(jìn)、腎上腺皮質(zhì)功能低下、肝功能嚴(yán)重低下。七．臨床意義血脂是血漿所含脂類的統(tǒng)稱血漿所含脂類統(tǒng)稱血脂，包括：甘油三酯、磷脂、膽固醇及其酯以及游離脂酸。外源性——從食物中攝取

內(nèi)源性——肝、脂肪細(xì)胞及其他組織合成后釋放入血定義：來源：血脂含量受膳食、年齡、性別、職業(yè)及代謝等的影響，波動范圍很大。七．臨床意義十二指腸下段及空腸上段。中鏈及短鏈脂酸構(gòu)成的TG

乳化

吸收

脂肪酶甘油+FFA門靜脈血循環(huán)腸粘膜細(xì)胞飲食脂肪在小腸被吸收吸收部位：吸收方式：七．臨床意義消化吸收和內(nèi)源性合成的脂酸，以游離的形式存在較少，大多數(shù)以酯化的形式存在于甘油三酯之中而存在于體內(nèi)。（二）甘油三酯的主要作用是為機(jī)體提供能量（一）甘油三酯是脂酸的主要儲存形式1.甘油三酯是機(jī)體重要的能量來源2.甘油三酯是機(jī)體的主要能量儲存形式男性：21%，女性：26％

1gTG=38kJ七．臨床意義（三）甘油三酯是3分子長鏈脂肪酸和甘油形成的脂肪分子。甘油三酯是人體內(nèi)含量最多的脂類，大部分組織均可以利用甘油三酯分解產(chǎn)物供給能量。甘油三酯大部分是從飲食中獲得的，同時肝臟、脂肪等組織還可以進(jìn)行甘油三酯的合成，在脂肪組織中貯存。（四）甘油三酯增高常見于肥胖、糖尿病、腎病綜合癥、糖原沉積癥、高血壓、冠心病等，也隨年齡而上升。降低多見于甲狀腺功能亢進(jìn)、腎上腺皮質(zhì)功能低下、肝功能嚴(yán)重低下。八．思考題簡述酶法測定甘油三酯的原理。正常人空腹血清TG濃度是多少？說明TG的測定的臨床意義。酶法測定血清中的膽固醇一.目的要求了解血清膽固醇氧化酶法測定的原理了解血清膽固醇測定的臨床意義鞏固酶標(biāo)儀測定法的原理和操作二．實驗原理膽固醇脂酶可將膽固醇酯水解成膽固醇和脂肪酸。膽固醇在膽固醇氧化酶催化下，生成膽甾烯酮和H2O2。H2O2在過氧化物酶（POD）催化下與4-氨基安替比林（4-AAP）及ESPAS（3-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺）反應(yīng)生成紫色醌亞胺染料。形成的醌亞胺染料色澤強(qiáng)度與樣品中膽固醇的含量成正比。測定標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液和待測血清樣品反應(yīng)生成的醌亞胺染料吸光度（A）值，即可求出待測血清樣品中總膽固醇的濃量。反應(yīng)如下：膽固醇酯（TC）＋H2OH2O2＋4-AAP＋ESPAS醌亞胺染料＋H2O膽固醇+RCOOH膽固醇+O24-膽甾烯酮+H2O2膽固醇脂酶膽固醇氧化酶過氧化物酶三．器材及試劑1．器材：（1）酶標(biāo)儀（2）恒溫水浴箱三．器材及試劑2．試劑：四．操作步驟取酶標(biāo)條1個（每個樣品2個重復(fù)），按下表操作：

37℃保溫5min，空白調(diào)零，550nm處測定各孔A值。

試劑（ul）空白孔標(biāo)準(zhǔn)孔測定孔蒸餾水3－－5.17mmol/L標(biāo)準(zhǔn)品－3－樣本——3酶試劑（工作液）300300300五．計算標(biāo)準(zhǔn)液濃度=5.17mmol/L（mmol/L）六．相關(guān)知識與臨床意義膽固醇為固醇類中的重要物質(zhì)，是環(huán)戊烷多氫菲的衍生物。膽固醇酯化的位點六．相關(guān)知識與臨床意義1．膽固醇的生理功能是生物膜的重要成分，對控制生物膜的流動性有重要作用；是合成膽汁酸、類固醇激素及維生素D等生理活性物質(zhì)的前體。六．相關(guān)知識與臨床意義2．膽固醇在體內(nèi)含量及分布含量：約140克分布：廣泛分布于全身各組織中大約1/4分布在腦、神經(jīng)組織肝、腎、腸等內(nèi)臟、皮膚、脂肪組織中也較多肌肉組織含量較低腎上腺、卵巢等合成類固醇激素的腺體含量較高存在形式：游離膽固醇30%膽固醇酯70%六．相關(guān)知識與臨床意義3．膽固醇的合成部位⑴組織定位：除成年動物腦組織及成熟紅細(xì)胞外，幾乎全身各組織均可合成，（肝最旺盛，其次為小腸）⑵細(xì)胞定位：胞液、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)六．相關(guān)知識與臨床意義4．膽固醇的合成步驟

一般認(rèn)為乙酸等物質(zhì)在動物體內(nèi)是合成膽固醇的原料。限速酶：HMGCoA還原酶合成前體——乙酸需要NADPH和ATP高度調(diào)控發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞液六．相關(guān)知識與臨床意義5．膽固醇合成的調(diào)節(jié)限速酶HMG-CoA還原酶①酶的活性具有晝夜節(jié)律性(午夜最高，中午最低）②可被磷酸化而失活，脫磷酸可恢復(fù)活性③受膽固醇的反饋抑制作用④胰島素甲狀腺素能誘導(dǎo)肝HMG-CoA還原酶的合成，又促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懼峥墒寡心懝檀枷陆盗嚓P(guān)知識與臨床意義6．膽固醇的降解

目前一般認(rèn)為膽固醇主要經(jīng)由膽汁排出體外。由于環(huán)結(jié)構(gòu)不能代謝，體內(nèi)膽固醇的清除是將其轉(zhuǎn)變成膽汁酸，在分泌到小腸以后，部分隨糞便排出。六．相關(guān)知識與臨床意義7．膽固醇的轉(zhuǎn)變類固醇激素（腎上腺皮質(zhì)激素、孕激素、雄激素、雌激素等）膽固醇膽汁酸７－脫氫膽固醇維生素D六．相關(guān)知識與臨床意義8．血清膽固醇測定的臨床意義(1)血清膽固醇濃度可作為酯類代謝的標(biāo)志，對糖尿病患者的預(yù)后有重要意義。糖尿病昏迷患者幾乎都伴有血清膽固醇濃度的增加。膽固醇增加還見于動脈粥樣硬化、腎病綜合征、總膽管阻塞及粘液性水腫。其他如肥大性骨關(guān)節(jié)炎、老年性白內(nèi)障、牛皮癬等，血清膽固醇濃度間或也有增加。（2）在惡性貧血、溶血性貧血以及甲狀腺功能亢進(jìn)時，血清膽固醇含量降低，其他如感染、營養(yǎng)不良等情況下，膽固醇總量常見減低。（3）膽固醇酯系由膽固醇與脂肪酸結(jié)合而成，此反應(yīng)主要在肝臟內(nèi)進(jìn)行。肝臟有實質(zhì)性病變時，膽固醇的含量可顯著地減少，同時在膽固醇總量內(nèi)所占的比例亦明顯減低，故其測定有助于肝臟疾病診斷。膽固醇酯的含量與比例日漸減低是預(yù)后不良的征兆。六．相關(guān)知識與臨床意義9．參考值血清膽固醇水平與性別、年齡、飲食、生活習(xí)慣、精神因素、工作性質(zhì)、運動及吸煙等有關(guān)。成人參考值為：2.8－6.0mmol/L（100－230mg/dl）

血清正常上限值：<5.20mmol/L危險閾值：5.20-6.20mmol/L高膽固醇血癥：≥6.20mmol/L

六．相關(guān)知識與臨床意義膽固醇增高、降低的常見疾病

膽固醇增高膽固醇降低家族性高膽固醇血癥無β脂蛋白血癥

LDL-R缺陷低β脂蛋白血癥混合性高脂蛋白血癥α脂蛋白缺乏癥家族性高HDL血癥家族性LCAT缺乏癥家族性Ⅲ型高脂蛋白血癥內(nèi)分泌疾病嚴(yán)重肝臟疾病甲狀腺功能減低急性肝壞死糖尿?。ɑ杳裕└斡不闻K疾病甲狀腺功能亢進(jìn)阻塞性黃疸