【課件】2.2.2動物細胞工程課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第2節(jié)

動物細胞工程02植物細胞工程的應(yīng)用ZHIWUXIBAOGONGCHENGDEYINGYONG

02動物細胞融合技術(shù)與單克隆抗體DONGWUXIBAORONGHEJISHUYUDANKELONGKANGTI

教學(xué)目標1.闡明動物細胞培養(yǎng)的條件和過程。2.簡述干細胞在生物醫(yī)學(xué)工程中有廣泛的應(yīng)用價值。3.闡明利用動物細胞融合技術(shù)制備單克隆抗體的過程,認同單克隆抗體在臨床上有重要的應(yīng)用價值。4.闡明利用動物體細胞核移植技術(shù)克隆動物的過程和該技術(shù)的應(yīng)用前景。本節(jié)聚焦1.什么是動物細胞融合技術(shù)?2.單克隆抗體是如何制備的?

在臨床上有哪些應(yīng)用?

我們知道，運用植物體細胞雜交技術(shù)，可以跨越不同種植物之間生殖隔離的屏障，培育出新的作物類型。那么，有沒有技術(shù)能讓不同種動物的體細胞進行雜交，培育出集不同細胞的優(yōu)勢于一身的動物細胞呢?

動物細胞融合技術(shù)就是指兩個或多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的技術(shù)。利用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)動物細胞融合。（1）自然發(fā)生：

受精卵（2）人工誘導(dǎo)：1.動物細胞融合概念一、動物細胞融合技術(shù)2.誘導(dǎo)動物細胞融合的常用方法：物理法：電融合法化學(xué)法：聚乙二醇（PEG)融合法生物法：滅活的病毒誘導(dǎo)法

（仙臺病毒——應(yīng)用最為廣泛）一、動物細胞融合技術(shù)病毒的滅活滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒失去感染能力，但是并不破壞病毒的抗原結(jié)構(gòu)。仙臺病毒紫外線滅活喪失感染活性（不感染細胞）保留融合活性（誘導(dǎo)細胞融合）滅活病毒誘導(dǎo)細胞融合的原理病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞互相凝聚，細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。3.動物細胞融合過程一、動物細胞融合技術(shù)3.細胞融合的過程一、動物細胞融合技術(shù)兩親本細胞相互接觸接觸的細胞因細胞膜磷脂分子和蛋白質(zhì)分子的運動而融合4.動物細胞融合的原理細胞膜的流動性

正在融合的雞血細胞正在融合的淋巴細胞與骨髓瘤細胞一、動物細胞融合技術(shù)5.融合實質(zhì)及完成的標志____________________6.應(yīng)用①細胞融合技術(shù)已經(jīng)成為研究_________、_________、_____和_________________等的重要手段。②利用動物細胞融合技術(shù)發(fā)展起來的__________，為_______________開辟了新途徑。細胞核的融合細胞遺傳細胞免疫腫瘤培育生物新品種雜交瘤技術(shù)制造單克隆抗體一、動物細胞融合技術(shù)7.植物體細胞雜交和動物細胞融合比較植物體細胞雜交動物細胞融合原理細胞融合前的處理方法誘導(dǎo)細胞融合的方法細胞融合成功的標志主要用途意義細胞膜具有一定的流動性植物細胞的全能性細胞膜具有一定的流動性用果膠酶和纖維素酶去除細胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細胞分散成單個細胞電融合法、離心法、聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法再生出細胞壁細胞核的融合獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體打破生殖隔離，實現(xiàn)遠緣雜交育種，培育植物新品種。突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能。1.抗體是機體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。抗體如何識別抗原？二、單克隆抗體及其應(yīng)用2.體液免疫流程3.傳統(tǒng)的獲取抗體的方法長期以來，人們?yōu)榱双@得抗體，采用的方法是把某種抗原反復(fù)注射到動物體內(nèi)，使動物產(chǎn)生抗體，然后從動物血清中分離出所需的抗體。用這種方法獲得的抗體，不僅產(chǎn)量低，而且抗體的特異性差，純度低，反應(yīng)不靈敏。P49二、單克隆抗體及其應(yīng)用為了解決這一難題，科學(xué)家們進行了多年的研究和探索。他們發(fā)現(xiàn)，哺乳動物感染病原體（如病毒、細菌等）后，體內(nèi)會形成相應(yīng)的B淋巴細胞。B淋巴細胞能分泌抗體，凝聚或殺死這些病原體。動物在免疫反應(yīng)的過程中，體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類可多達百萬種以上，但是每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體。4.一個美麗的發(fā)現(xiàn)二、單克隆抗體及其應(yīng)用5.單克隆抗體定義：

生物體內(nèi)有上百萬種B淋巴細胞，而每一種B淋巴細胞只產(chǎn)生一種特異的抗體。由一個B淋巴細胞增殖形成的細胞群所產(chǎn)生的單一型抗體分子就稱為單克隆抗體（monoclonalantibody）。二、單克隆抗體及其應(yīng)用B淋巴細胞與抗體（2）動物體內(nèi)的B淋巴細胞可以產(chǎn)生百萬種以上的抗體，每種抗體對特定的抗原具有特異性免疫作用。（1）B淋巴細胞受抗原刺激后，可以產(chǎn)生抗體。（3）每一個B淋巴細胞只能分泌一種特異性抗體。如何提高產(chǎn)量、提高抗體特異性差、純度低、反應(yīng)不靈敏的問題呢？二、單克隆抗體及其應(yīng)用二、動物細胞融合技術(shù)與單克隆抗體（二）單克隆抗體及應(yīng)用AG1234B1B2B3B4B3B3B3B3二、動物細胞融合技術(shù)與單克隆抗體（二）單克隆抗體及應(yīng)用因此，要想獲得大量的單一抗體，必須克隆單一的B淋巴細胞，形成細胞群。遺憾的是，在體外培養(yǎng)條件下，一個B淋巴細胞是不可能無限增殖的，怎么樣解決這一問題呢？4.一個大膽的設(shè)想將能夠產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細胞和具有無限增殖能量的骨髓瘤細胞融合在一起，形成雜交瘤細胞。那這樣就能夠提高抗體的產(chǎn)量、同時提高純度和靈敏性?？评盏聡谞査固褂鴦?chuàng)立抗原選擇抗體學(xué)說，發(fā)明了單克隆抗體技術(shù)，因此獲得了1984年的諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎。二、單克隆抗體及其應(yīng)用怎樣才能得到純的抗體？想要獲得單一的純抗體，就必須從一個B細胞出發(fā)。光純還不行，還要大量，怎么辦？讓B細胞大量繁殖（克?。┚涂梢援a(chǎn)生大量抗體了。但，有問題：找，什么細胞能無限增殖呢？B細胞是不能無限增殖的，怎么辦？癌細胞，只有癌細胞。但它不能產(chǎn)生抗體。二、單克隆抗體及其應(yīng)用思路就出來了：

癌細胞能無繁殖，但不能產(chǎn)生抗體。B細胞能產(chǎn)生抗體，但不能大量繁殖。融合，只要將兩個細胞融合即可互補。二、單克隆抗體及其應(yīng)用二、單克隆抗體及其應(yīng)用5.制備單克隆抗體的過程p49圖2-16從細胞培養(yǎng)液或小鼠腹水中獲取大量的單克隆抗體。5.制備單克隆抗體的過程注射特定的抗原多種B淋巴細胞骨髓瘤細胞誘導(dǎo)融合①

未融合的細胞②

多種雜交細胞動物細胞融合B淋巴細胞-B淋巴細胞骨髓瘤細胞-骨髓瘤細胞B淋巴細胞-骨髓瘤細胞①

未融合的細胞②

多種雜交細胞雜交瘤細胞抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞（能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞）用特定的選擇培養(yǎng)基第一次篩選克隆化培養(yǎng)、抗體檢測第二次篩選（可進行多次）注射到小鼠腹腔內(nèi)體外培養(yǎng)獲取單克隆抗體從小鼠腹水中從細胞培養(yǎng)液中動物細胞培養(yǎng)①未融合的細胞

②多種雜交細胞雜交瘤細胞抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞（能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞）用特定的選擇培養(yǎng)基第一次篩選克隆化培養(yǎng)、抗體檢測第二次篩選（可進行多次）注射到小鼠腹腔內(nèi)體外培養(yǎng)獲取單克隆抗體從小鼠腹水中從細胞培養(yǎng)液中注射特定的抗原多種B淋巴細胞骨髓瘤細胞誘導(dǎo)融合動物細胞融合動物細胞培養(yǎng)（1）該過程中應(yīng)用到的技術(shù)__________________________（2）原理____________________________（3）注射特定抗原的目的____________________________________________________________________________________（4）誘導(dǎo)融合的方法_______________________________動物細胞特有的為______________動物細胞融合、動物細胞培養(yǎng)細胞膜具有一定的流動性、細胞增殖用特定的抗原對小鼠進行免疫，并從該小鼠的脾中得到能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細胞。PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法*不是為了得到抗體！滅活病毒誘導(dǎo)法思考：只考慮兩兩融合，誘導(dǎo)融合之后，一定會得到所需的雜交瘤細胞嗎？未融合的親本細胞兩兩融合的細胞融合的具有同種核的細胞融合的雜交瘤細胞B-B細胞瘤-瘤細胞（5）第一次篩選的目的__________________________（6）如何篩選____________________________（7）篩選原理____________________________________________________________________________________（8）雜交瘤細胞的特點____________________________篩選獲得雜交瘤細胞用特定的選擇培養(yǎng)基進行篩選在選擇培養(yǎng)基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長。既能迅速大量繁殖，又能產(chǎn)生抗體補充了解——HAT選擇培養(yǎng)基的篩選原理①

細胞合成DNA有兩條途徑，正常細胞內(nèi)兩種途徑都有，若全合成途徑被阻斷，可以通過補救合成途徑合成DNA；②

骨髓瘤細胞不能合成轉(zhuǎn)化酶和激酶，因此只能進行全合成途徑；③

全合成途徑能被氨基喋（dié）呤（A）阻斷；④

次黃嘌呤（H）、胸腺嘧啶（T）是補救合成途徑的原料；⑤

無增殖能力的細胞在培養(yǎng)基中存活僅5-7天，細胞的多聚體也容易死去。將誘導(dǎo)融合后的細胞接種于HAT培養(yǎng)基后兩周，則細胞生存狀況及原因為：B細胞和B-B細胞________________________________________骨髓瘤細胞和瘤-瘤細胞__________________________________________雜交瘤細胞_____________________________________________死亡；能進行補救合成途徑，但是無增殖能力；死亡；兩種途徑均無法進行，無法合成DNA，無法增殖；存活；能進行補救合成途徑，能合成DNA，可大量增殖。思考：得到的雜交瘤細胞一定是所需的嗎？

雜交瘤細胞并不純，因為從脾臟獲得的B淋巴細胞不純（既有未免疫的B淋巴細胞，又有產(chǎn)其他抗體的B淋巴細胞，以及能產(chǎn)所需抗體的B淋巴細胞），因此要進行第二次篩選。（9）第二次篩選的目的________________________________________________________（10）如何篩選____________________________________________________________________________________（11）選擇抗體檢測呈___性的雜交瘤細胞，即_______________________（12）抗體檢測原理__________________________________獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細胞用96孔板培養(yǎng)，在每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞的情況下，進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測（進行多次篩選）陽分泌的抗體能與特定的抗原結(jié)合抗原和抗體能夠特異性結(jié)合(分子水平的鑒定）補充了解——克隆化培養(yǎng)和抗體檢測★有限稀釋法每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞側(cè)面模擬圖克隆化培養(yǎng)一段時間取上清液進行抗體檢測補充了解——不同水平的克隆及實例分子水平細胞水平個體水平DNA復(fù)制、PCR技術(shù)動物細胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)、動物細胞核移植思考：單克隆抗體的制備涉及什么水平的克??？細胞水平（13）如何獲取大量所需雜交瘤細胞________________________________________________________（14）如何獲取單克隆抗體①體外培養(yǎng)____________________________②小鼠腹腔內(nèi)培養(yǎng)____________________________（15）單克隆抗體的優(yōu)點______________________________________________________________在體外條件下大規(guī)模培養(yǎng)（接種于培養(yǎng)液中）或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖從細胞培養(yǎng)液中獲取從小鼠腹水中獲取能準確地識別抗原的細微差異，與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合，并且可以大量制備。思考：試比較兩次篩選的原因、方法和結(jié)果第一次篩選第二次篩選原因方法結(jié)果誘導(dǎo)融合后得到的細胞中，除雜交瘤細胞之外，還有未融合的親本細胞，也有融合的具有同種核的細胞。由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經(jīng)第一次篩選之后獲得的雜交瘤細胞中有能產(chǎn)生其他抗體的細胞。用特定的選擇培養(yǎng)基進行篩選用96孔板培養(yǎng)，在每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞的情況下，進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測（進行多次篩選）篩選獲得雜交瘤細胞獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細胞

第二次篩選：在“多孔培養(yǎng)板上”培養(yǎng)雜交瘤細胞系列，每孔只放一個雜交瘤細胞。“克隆化培養(yǎng)”每個雜交瘤細胞，并進行“單一抗體檢測”，“檢測陽性”的孔內(nèi)即是所需要的雜交瘤細胞。注意分離B淋巴細胞（B）；找到骨髓瘤細胞（G）。注意B淋巴細胞是一個系列。（B1,B2,B3,---Bn）細胞融合——三種融合方式:（BB；BG；GG）

第一次篩選：在“選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)”上培養(yǎng)篩選雜交瘤細胞（只有BG雜交瘤細胞存活。但BG雜交瘤細胞也是一個系列：如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培養(yǎng)基上不能存活。）二、單克隆抗體及其應(yīng)用（3）為何要進行兩次篩選？（4）如何進行第2次篩選？培養(yǎng)在多孔培養(yǎng)板上，每孔只有一個雜交瘤細胞。第1次篩選得到雜交瘤細胞（多種）。第2次篩選得到能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細胞群。問題強化：（1）本過程利用了哪些原理？免疫原理，細胞融合原理和動物細胞培養(yǎng)原理（2）為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與B細胞融合？這樣融合成的雜交瘤細胞，繼承了雙親細胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有B細胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體。二、單克隆抗體及其應(yīng)用

19世紀30年代，科學(xué)家曾在患肺結(jié)核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中觀察到多核細胞。如何解釋這一現(xiàn)象?旁欄思考p49

病人體內(nèi)的病毒等誘導(dǎo)多個體細胞融合形成了多核細胞。二、單克隆抗體及其應(yīng)用二、單克隆抗體及其應(yīng)用單克隆抗體的應(yīng)用

資料1用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”，在妊娠第8天就可以作出診斷，這比原來的診斷方法提前了10d左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準確率在90%以上。

資料2使用高效的細胞毒素類藥物進行化療可以有效殺傷腫瘤細胞。但細胞毒素月滿西樓:沒有特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時還會對健康細胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應(yīng)用?？贵w一藥物偶聯(lián)物（antibody-drugconjugates,ADC)通過將細胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合，實現(xiàn)了對腫瘤細胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物（如細胞毒素）三部分組成，它的作用機制如下圖所示。二、單克隆抗體及其應(yīng)用

單抗隆抗體的應(yīng)用（1）ADC的抗體和藥物各具有什么作用?（2）除了細胞毒素,還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物?（3）單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應(yīng)用上各具有什么優(yōu)勢?（4）單克隆抗體在臨床上還有哪些應(yīng)用？你可以課后搜集資料,然后以“單克隆抗體在臨床上的應(yīng)用”為主題,出一期黑板報或制作電子板報宣傳相關(guān)知識。

（1）ADC的抗體和藥物各具有什么作用？

抗體主要發(fā)揮靶向運輸作用，即通過特異性結(jié)合靶細胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細胞;藥物發(fā)揮治療效應(yīng)，如殺傷靶細胞。（2）除了細胞毒素，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？

可以用放射性同位素標記單克隆抗體進行靶向放療。一些作用于細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進行治療。（3）單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應(yīng)用上各具有什么優(yōu)勢？

單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原反應(yīng)，因此檢測的特異性和靈敏度大大提高；生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細胞可以傳代培養(yǎng)、冷凍保存和復(fù)蘇利用，有利于控制產(chǎn)品的質(zhì)量和標準化生產(chǎn)診斷試劑盒。ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識別的靶向作用和細胞毒素對腫瘤細胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點清楚、毒副作用小等優(yōu)點。

（4）單克隆抗體在臨床上還有哪些應(yīng)用？你可以課后搜集資料,然后以“單克隆抗體在臨床上的應(yīng)用”為主題,出一期黑板報或制作電子板報宣傳相關(guān)知識。

單克隆抗體在臨床上的應(yīng)用涉及治療、診斷等方面。

單克隆抗體藥物已被廣泛用于腫瘤、自身免疫病等疾病的治療，如利妥昔單抗被用于治療復(fù)發(fā)難治的低分化B細胞淋巴瘤；曲妥珠單抗被用于治療乳腺癌等。在臨床診斷方面，單克隆抗體被廣泛用于一些感染性疾病的檢測、腫瘤的診斷、激素和細胞因子的測定等。以單克隆抗體在診斷腫瘤方面的應(yīng)用為例，用放射性同位素或熒光標記抗腫瘤表面抗原的單克隆抗體，可以用這些抗體來對體內(nèi)的腫瘤進行定位，輔助診斷并確定腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移等。

單克隆抗體能準確地識別抗原的細微差異，與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合，并且可以大量制備，因此被廣泛用作診斷試劑，在多種疾病的診斷和病原體鑒定中發(fā)揮重要的作用。例如,利用同位素或熒光標記的單克隆抗體在特定組織中成像的技術(shù)，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。除前面介紹的單克隆抗體可以運載藥物外，單克隆抗體自身也能用于治療疾病。在醫(yī)藥領(lǐng)域，單克隆抗體藥物占有非常重要的地位。2015年，全球銷售額排名前十位的藥物中，單克隆抗體藥物就有5種。同年,，我國的單克隆抗體藥物市場規(guī)模已達72億元。二、單克隆抗體及其應(yīng)用單克隆抗體的應(yīng)用（1）作為診斷試劑——最廣泛的應(yīng)用

準確、高效、