神經(jīng)系統(tǒng)安全性評(píng)價(jià)3 - 副本

藥物的神經(jīng)系統(tǒng)安全性評(píng)價(jià)

第一節(jié)：概述

第二節(jié)：藥物神經(jīng)系統(tǒng)安全性評(píng)價(jià)的內(nèi)容

第三節(jié)：藥物安全性評(píng)價(jià)的意義

一、概述

近年新藥研發(fā)領(lǐng)域，大量藥物由于神經(jīng)系不良反應(yīng)而退出市場(chǎng)，甚至有藥物由于神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)不能進(jìn)入臨床試驗(yàn)，從而造成人力資源的巨大浪費(fèi)，人為地拉長(zhǎng)了新藥研發(fā)的周期，給患者造成了嚴(yán)重的身心危害。

藥物的神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)包括：

1.藥物致腦炎樣反應(yīng)：人用狂犬病疫苗、麻疹毒活疫苗、咪唑類驅(qū)蟲(chóng)藥等。

2.藥物致腦血管損害：三環(huán)類抗抑郁藥、腎上腺皮質(zhì)激素、雄激素等，均可致血壓升高，造成腦出血。

3.藥物致顱內(nèi)壓增高：皮質(zhì)激素類、氨節(jié)西林、氟喹諾酮類等。

4.藥物致中毒性腦?。侯^孢菌素類、抗結(jié)核藥、苯妥英鈉、丙戊酸鈉、卡馬西平等。

5.藥物致錐體外系反應(yīng)：吩噻嗪類三氟拉嗪、三氟丙嗪、甲哌氯丙嗪、氟奮乃靜和奮乃靜、氯丙嗪；某些鈣離子拮抗劑:鹽酸氟桂嗪以及甲氧氯普胺等。

6.藥物致周圍神經(jīng)損害：抗結(jié)核藥物、氨基糖苷類、利尿劑等。

7.藥物致神經(jīng)—肌肉阻滯型病變：腎上腺皮質(zhì)激素類、氨基糖苷類抗生素、氯喹、苯妥英鈉等。

8.藥物致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其它不良反應(yīng)：甲硝唑、萬(wàn)古霉素、洋地黃、喹諾酮類抗生素等。神經(jīng)系統(tǒng)安全性在體研究1.運(yùn)動(dòng)/感覺(jué)反射：采用熱刺激大鼠尾部的方法，測(cè)定甩尾潛伏期(TFL)作為痛閾，以痛閾提高的百分?jǐn)?shù)作為評(píng)判對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)影響的指標(biāo)。2.自發(fā)活動(dòng)計(jì)數(shù)：小鼠自主活動(dòng)記錄儀是通過(guò)檢測(cè)大小鼠自發(fā)的水平運(yùn)動(dòng)或直立運(yùn)動(dòng)的頻度從而評(píng)價(jià)小鼠自主活動(dòng)的能力。3.運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性：轉(zhuǎn)棒式疲勞儀可做疲勞實(shí)驗(yàn)，骨骼肌松馳實(shí)驗(yàn)、中樞神經(jīng)抑制實(shí)驗(yàn)，以及其它需用運(yùn)動(dòng)方式檢測(cè)藥物作用的實(shí)驗(yàn)。4.學(xué)習(xí)記憶：被動(dòng)回避跳臺(tái)試驗(yàn)和方位水迷宮是簡(jiǎn)單的學(xué)習(xí)模式,可綜合反映動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶能力。5.體溫的變化(一)動(dòng)物:SPF級(jí)動(dòng)物昆明種小鼠共207只，符合納入標(biāo)準(zhǔn)200只。200只小鼠雌雄各半，體重18-22g，飼養(yǎng)于國(guó)家成都中藥安全性評(píng)價(jià)中心普通動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境。選擇健康(雌性須未孕)動(dòng)物作為受試動(dòng)物，雄性、雌性動(dòng)物分開(kāi)飼養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)5只，飼養(yǎng)條件符合國(guó)標(biāo)GB14925-2001，室溫21士5℃，相對(duì)濕度55士15%,12小時(shí)明暗交替。動(dòng)物以鼠飼料喂養(yǎng)，去離子水自由飲用。以丙泊酚為例：從運(yùn)動(dòng)/感覺(jué)反射、自發(fā)活動(dòng)計(jì)數(shù)、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性和學(xué)習(xí)記憶四方面評(píng)價(jià)HX0507對(duì)小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的安全性。(二)儀器1.小鼠自主活動(dòng)測(cè)試儀:儀器型號(hào)為JXDH-I，由河北冀星試驗(yàn)儀器公司提供?；顒?dòng)儀中裝有定位的紅外線光束，小鼠在有機(jī)玻璃格中活動(dòng)可切斷光束，活動(dòng)儀則自動(dòng)記錄小鼠切斷光線的次數(shù)，即記錄自發(fā)活動(dòng)數(shù)。2.小鼠甩尾儀:由BiologicalReseachApparatus(Italy)公司提供。有輻射熱加熱點(diǎn)，可記錄小鼠逃避熱反射的時(shí)間。3.轉(zhuǎn)桿儀:XZC-4B轉(zhuǎn)棒式疲勞儀。調(diào)整傳送帶位置，按動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)按鈕，轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)動(dòng)，調(diào)整疲勞儀的轉(zhuǎn)速為巧轉(zhuǎn)/分。提小鼠尾將小鼠放到轉(zhuǎn)棒上按下清零按鈕，清零后開(kāi)始記時(shí)，當(dāng)小鼠跌落下來(lái)后壓動(dòng)下踏板，記時(shí)器被鎖住，顯示時(shí)間為小鼠在轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間。4.Morris水迷宮:北京天壇公司制造，由平臺(tái)、不銹鋼圓形水槽、不銹鋼支架，攝像機(jī)支架、攝像機(jī)及廣角鏡頭、圖像采集卡和軟件等部分組成。5.其他:電子天平、秒表、Iml注射器、小鼠固定器等。(三)實(shí)驗(yàn)分組:根據(jù)《化學(xué)藥物一般藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)應(yīng)“定性和定量評(píng)價(jià)給藥后動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能、行為改變、協(xié)調(diào)功能、感覺(jué)/運(yùn)動(dòng)反射和體溫等的變化”。小鼠共計(jì)207只，符合納入標(biāo)準(zhǔn)200只。200只小鼠分為四大組。第一大組觀測(cè)甩尾潛伏期第二大組觀測(cè)自發(fā)活動(dòng)計(jì)數(shù)第三大組觀測(cè)小鼠轉(zhuǎn)桿疲勞儀落下個(gè)數(shù)第四大組觀測(cè)逃避潛伏期每一大組各用5O只(體溫的測(cè)定在Beagle犬中進(jìn)行)，雌雄各25只，隨機(jī)再分為5小組，即HX0507高、中、低3個(gè)劑量組、DIPRIVAN對(duì)照組及溶劑(生理鹽水)對(duì)照組，每小組10只動(dòng)物。

神經(jīng)系統(tǒng)安全性離體研究對(duì)小鼠腦組織重量的影響：

腦組織臟器系數(shù)的測(cè)定：

腦組織蛋白含量的測(cè)定：對(duì)小鼠腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化作用的影響：腦組織SOD活力，GSH-Px活力，MDA含量的測(cè)定

對(duì)小鼠腦組織神經(jīng)遞質(zhì)的影響：腦組織乙酰膽堿，NO，Glu含量的測(cè)定

對(duì)小鼠腦組織能量代謝的影響：腦組織SDH活性，ATPase活性的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康小鼠48只,體重（18士2）g，雌雄各半。按照隨機(jī)分組的原則，將小鼠分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，劑量（高、中、低）分別為21.Omg/m3(1/24LC50),42.Omg/m3(1/12LC50)和84.0mg/m3(1/6LC50)。每組12只小鼠，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)分組染毒方法采用靜式吸入染毒，每天2h，每周6d，共染毒12w，對(duì)照組吸入新鮮空氣，染毒組吸入既定濃度的甲醛。主要試劑與儀器氯化乙酞膽堿(Ach)超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒谷膚甘膚過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒丙二醛(MDA)試劑盒一氧化氮(NO)試劑盒谷氨酸(Glu)試劑盒琥珀酸脫氫酶(SDH)試劑盒ATP酶(ATPase)試劑盒考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒752紫外光柵分光光度計(jì)電熱恒溫水浴箱離心機(jī)臺(tái)式離心機(jī)磁力加熱攪拌器TN-1OOB型托盤式扭力天平結(jié)果甲醛對(duì)小鼠腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化作用的影響1/6LC50組小鼠腦組織SOD活力明顯低于對(duì)照組和1/24LC50組(P<0.05)，各染毒組小鼠腦組織GSH-Px活性明顯低于對(duì)照組(P<0.01或P<0.05)，而MDA含量顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。甲醛對(duì)小鼠腦組織神經(jīng)遞質(zhì)的影響各染毒組小鼠腦組織Ach含量低于對(duì)照組，其中1/12LC50劑量組和1/6LC50。劑量組有顯著性差異(P<0.O1),1/12LC50和l/6LC50。劑量組小鼠腦組織Ach含量顯著低于1/24LC50組(P<0.0l);NO較對(duì)照組有所降低，但均沒(méi)有顯著性差異;各染毒組小鼠腦組織Glu含量明顯高于對(duì)照組(P<0.01)o甲醛對(duì)小鼠腦組織能量代謝的影響各染毒組小鼠腦組織SDH均下降，其中1/6LC50組與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)，各染毒組Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase的活性均下降，但都沒(méi)有顯著性差異?！嬉詥岱葹槔懻撍幬飳?duì)神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)丘腦內(nèi)側(cè)與疼痛整合、感受有關(guān)邊緣系統(tǒng)及藍(lán)斑核與情緒、精神有關(guān)延髓孤束核阿片受體與呼吸、咳嗽有關(guān)腦干極后區(qū)阿片受體與胃腸道有關(guān)水通道AQP4參與嗎啡依賴的機(jī)制研究

水通道4（Aquaporin4，AQP4）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富的水通道亞型，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)水代謝和滲透壓調(diào)節(jié)中占據(jù)主導(dǎo)地位。我室前期實(shí)驗(yàn)證明AQP4與嗎啡成癮密切相關(guān)，在嗎啡依賴形成過(guò)程中，AQP4與GLT-1(谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1)的表達(dá)均下調(diào)。AQP4基因敲除能夠抑制嗎啡慢性處理所致的GLT-1表達(dá)下調(diào)、谷氨酸重?cái)z取能力的降低及突觸間隙谷氨酸水平的改變，并且給予GLT-1特異性抑制劑二氫卡因酸鹽（Dihydrokainate，DHK）能夠增加AQP4基因敲除小鼠嗎啡軀體依賴的形成。但AQP4與GLT-1之間是否有直接關(guān)系仍然不清楚。大鼠采用遞增給藥的方式，從第1天至第5天皮下注射嗎啡，劑量分別10、20、30、40、50mg/kg，每天兩次（8:00和17:00），建立慢性嗎啡軀體依賴模型。用戒斷癥狀評(píng)分以判斷模型建立是否成功。癥狀：死狗樣搖體、齒抓、咀嚼、縱涎、流淚、毛發(fā)直立、眼瞼下垂、腹瀉等戒斷癥狀進(jìn)行評(píng)分

通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timePCR)Westernblot方法，從mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)AQP4、GLT-1、μ阿片受體（MuOpiateReceptor，MOR）在大鼠前額葉皮層、海馬、伏隔核及紋狀體的表達(dá)變化。

引物設(shè)計(jì)與合成經(jīng)PrimerExpress3.0引物軟件對(duì)大鼠AQP4、GLT-1、MOR和β-actin的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物由北京博邁德科技發(fā)展有限公司合成。

AQP4:Forwardprimer：5’TGGCAGTTTTGTGTCTGTGG3’Reverseprimer：5’CGCCTTGGTTCTGTAGGTTC3’GLT-1:Forwardprimer：5’GCAGGTGGAAGTGCGCATGCAC3’Reverseprimer：5’CACATACTGCTCCCAGGATGACA3’MOR:Forwardprimer：5’GCCTGATGATCTTACGACTCAAGA3’Reverseprimer：5’GCGCAGATTCCTGTCCTTTT3’β-actin:Forwardprimer：5’GGGAAATCGTGCGTGACATT3’Reverseprimer：5’GCGGCAGTGGCCATCTC3’

QP4、GLT-1、MOR在大鼠嗎啡軀體依賴模型中伏隔核mRNA表達(dá)的變化QP4、GLT-1、MOR在大鼠嗎啡軀體依賴模型中紋狀體mRNA表達(dá)的變化QP4、GLT-1、MOR在大鼠嗎啡軀體依賴模型中海馬mRNA表達(dá)的變化W-BQP4、GLT-1、MOR在大鼠嗎啡軀體依賴模型中前額葉皮層蛋白表達(dá)的變化AQP4、GLT-1、MOR在星形膠質(zhì)細(xì)胞嗎啡依賴模型中表達(dá)變化新生SD大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

用熒光顯微鏡及CCD進(jìn)行圖像采集。

嗎啡激動(dòng)阿片受體后，通過(guò)G蛋白抑制腺苷酸環(huán)化酶，降低細(xì)胞內(nèi)的CAMP（環(huán)磷腺苷酸）水平。

星形膠質(zhì)細(xì)胞嗎啡依賴模型的建立實(shí)驗(yàn)分組嗎啡組(Mor)、納洛酮伴隨嗎啡給藥組（Nalo+Mor）。按照隨機(jī)分組原則，將培養(yǎng)至第15天的星形膠質(zhì)細(xì)胞分為如下幾組：對(duì)照組(Con)、嗎啡組(Mor)、納洛酮伴隨嗎啡給藥組（Nalo+Mor）。

所有細(xì)胞均采用3次獨(dú)立培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)，避免不同細(xì)胞培養(yǎng)造成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異。

DMEM（Dulbecco’sModifiedEagleMedium，高糖型）培養(yǎng)基、MEM（ModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基、馬血清（Equineserum）、胎牛血清（FetalBovineSerum）均購(gòu)自Gibco公司；L-多聚賴氨酸（poly-L-lysine，P1524）、阿糖胞（cytosinearabinofuranoside，Ara-C）、谷氨酰胺（L-glutamine）、dBcAMP（N6,2’-O-Dibutyryladenosine3’5’-cyclicmonophosphatesodiumsalt）、納洛酮（Naloxone）均購(gòu)自Sigma公司；4′,6-二脒基-乙苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）購(gòu)自Amresco公司；GFAP抗體購(gòu)自antaCruz公司；山羊抗兔Ig-G/FITC、山羊血清工作液、一抗稀釋液均購(gòu)自北京中杉金橋公司

時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移免疫實(shí)驗(yàn)（LANCEcAMP試劑盒）該試劑盒是一種時(shí)間分辨的熒光共振能量轉(zhuǎn)移免疫分析，該反應(yīng)是一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)，即銪標(biāo)的cAMP示蹤復(fù)合物與體系中的cAMP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合標(biāo)有AlexaFlour47染料的cAMP抗體。銪標(biāo)cAMP示蹤復(fù)合物是通過(guò)Biotin標(biāo)記的cAMP與銪標(biāo)的抗生物素蛋白鏈菌素與抗體的復(fù)合物緊密結(jié)合產(chǎn)生的。當(dāng)抗體結(jié)合到示蹤劑上時(shí)，340nm的激發(fā)光激發(fā)銪標(biāo)分子，導(dǎo)致能量轉(zhuǎn)移到AlexaFluor647染料上，結(jié)果產(chǎn)生665nm的發(fā)射光。熒光的強(qiáng)度與樣品中的cAMP含量成反比。本試劑盒用于檢測(cè)在GPCR激動(dòng)劑刺激下活細(xì)胞或者細(xì)胞膜制備品產(chǎn)生的cAMP。對(duì)于偶聯(lián)Gas的受體，激動(dòng)劑刺激導(dǎo)致665nm的熒光強(qiáng)度降低，而拮抗劑則可以逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)嗎啡慢性處理細(xì)胞72h后，用10μM的納洛酮處理催促(30min),觀察cAMP發(fā)生超射的情況。cAMP的變化具有顯著差異（F=21.45p=0.0018<0.05）。嗎啡處理組（Mor）納洛酮催促30min，胞內(nèi)cAMP含量明顯升高，與對(duì)照組（Con