細(xì)胞骨架組分的熒光染色觀察

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告細(xì)胞骨架組分的熒光染色觀察姓名:學(xué)號(hào):班級(jí):專業(yè):同組成員:一、實(shí)驗(yàn)原理鬼筆環(huán)肽(phalloidin)是從一種毒性菇類中分離的劇毒生物堿，它同細(xì)胞松弛素的作用相反，只與聚合的微絲結(jié)合，而不與肌動(dòng)蛋白單體分子結(jié)合。它同聚合的微絲結(jié)合后，抑制了微絲的解體，因而破壞了微絲的聚合和解聚的動(dòng)態(tài)平衡。由于鬼筆環(huán)肽非常特異地結(jié)合并穩(wěn)定聚合態(tài)肌動(dòng)蛋白，因而對(duì)肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)平衡造成嚴(yán)重影響.此外，較高濃度的鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞有毒害作用。因此，用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記微絲并不是用于研究活體細(xì)胞的理想方法。二、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握細(xì)胞骨架的顯示方法掌握熒光顯微鏡的使用方法了解熒光顯微鏡下細(xì)胞骨架的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)三、 實(shí)驗(yàn)器材材料：CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞)、雞胚成纖維細(xì)胞試劑：PEM：50mMpipes(pH6.9),5mMEGTA,5mMMgSO4,0.225M山梨醇0.5%TritonX-100溶于PEM緩沖液。4%多聚甲醛溶于PEM緩沖液。儀器超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、熒光顯微鏡其它用品：蓋玻片(無(wú)菌)、35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿、試管、移液管，滴管，酒精燈、75%酒精棉球、廢液缸。四、 方法與步驟由于上節(jié)課雞胚成纖維細(xì)胞被污染，本次實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為CHO細(xì)胞準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)器材。(本次實(shí)驗(yàn)無(wú)需在超凈臺(tái)中進(jìn)行)將上節(jié)課進(jìn)行細(xì)胞爬片的培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中取出，取出蓋片，于小平皿中。37°C預(yù)溫PEM洗3次(每次1mL)TritonX-100處理約10min(1mL)37°C預(yù)溫PEM洗3次(每次1mL)37C預(yù)溫4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min(1mL)37C預(yù)溫PEM洗3次55nMAlex-phalloidin10UL濕盒中室溫染色30min。(避光)在parafilm膜上加PEM，待蓋玻片被沖起后，再輕輕揭下蓋玻片。37C預(yù)溫PEM洗數(shù)3次，滴加10叱Ho.33342復(fù)染色。熒光顯微鏡下觀察并拍照。五、注意事項(xiàng)蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時(shí)動(dòng)作要輕。注意不要弄碎蓋片，分清細(xì)胞所在面；各步洗細(xì)胞要輕，勿使細(xì)胞脫落；熒光觀察注意避光操作，防止熒光淬滅。節(jié)約試劑。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果本次實(shí)驗(yàn)我們對(duì)CHO細(xì)胞爬片結(jié)果進(jìn)行了熒光染色，在熒光顯鏡下用不同波長(zhǎng)的激發(fā)光

對(duì)細(xì)胞骨架微絲結(jié)構(gòu)及細(xì)胞核進(jìn)行了觀察、拍攝照片并將結(jié)果疊加。得到以下的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象:圖1.CHO細(xì)胞微絲熒光染色圖

圖2.CHO細(xì)胞核熒光染色圖圖3.CHO細(xì)胞微絲及細(xì)胞核熒光染色合成圖從拍攝的照片可以較為清晰的看到CHO細(xì)胞骨架的微絲被染成了綠色，細(xì)胞核被染成藍(lán)色；微絲的形狀為長(zhǎng)條的紡錘狀細(xì)絲，遍布整個(gè)細(xì)胞，在細(xì)胞中起到了類似骨架般的支撐作用；細(xì)胞核為橢圓形，之后再將兩圖合成，可觀察到細(xì)胞核被遍布的微絲結(jié)構(gòu)包圍。實(shí)驗(yàn)較為成功。在實(shí)驗(yàn)時(shí)要注意熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，所以要盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。每步洗滌要充分，并吸去水分（但也不要干透），以免稀釋下一步的抗體或試劑，這樣才能得到清晰的熒光圖像?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】桑建利，譚信.細(xì)胞生