羅氏診斷二代測序技術在HBV耐藥檢測中的應用

羅氏診斷二代測序技術在HBV耐藥檢測中的應用

羅氏診斷應用科學市場部劉璐璐HBV耐藥性產生病毒每天高速復制，并在復制時發(fā)生錯誤，這些自發(fā)突變導致突變株出現(xiàn)。突變株增殖能力通常低于野生型，因而在未用藥的群體中占少數(shù)。但在病毒藥物作用下，藥物對于耐藥性的突變有選擇作用，導致了耐藥菌株成為優(yōu)勢株，導致藥物治療的失敗。耐藥是核苷酸類藥物的共性耐藥檢測的意義治療前檢測，有助于臨床判斷用藥是否有效；治療中每3~6個月檢測，有助于觀察療效，及時調整用藥EASLClinicalPracticeGuidelines：ManagementofchronichepatitisB.EuropeanAssociationfortheStudyoftheLiver.JHepatol,2009,50:227-242.用藥后出現(xiàn)耐藥拉米夫定阿德福韋酯恩替卡韋替比夫定替諾福韋測序用于病毒耐藥檢測

深度測序可檢出低頻準種超深焦磷酸測序可檢測低于1%的準種普通焦磷酸測序僅限5%及以上的準種毛細管電泳測序僅限20%及以上的準種提早判斷準種組成，在劣勢菌種未發(fā)展成為優(yōu)勢菌種之前，即調整用藥策略；降低治療失敗可能性，減少對身體傷害。454高深度測序優(yōu)勢已經成功實現(xiàn)對于RT基因區(qū)段1%突變位點的發(fā)現(xiàn)，比目前常用的一代測序及線性探針反向雜交法更加靈敏進行相對定量，對于病毒群體中突變數(shù)量改變進行跟蹤深度測序的運用將較傳統(tǒng)方法提前3-6個月檢測出突變，因此能夠更好的抓住治療的時機并給出治療的方案—454測序系統(tǒng)發(fā)展

測序通量及讀長不斷增加，大小測序平臺齊備—GS20GSFLXStandard20Mb~100Mb200520072008—FutureEvenLongerReadsHigherDensityLaterGSFLXTitanium~500MbGSJuniorTitaniumGSFLX+2011獨立實驗室適用型

精巧型二代測序平臺

GSJuniorGSJunior測序步驟概覽MixssDNA&capturebeads454測序流程

文庫構建1.454文庫構建：ShotgunPaired-end300bp~1Kb,3Kb,8Kb,20Kb*PCR產物可直接測序傳統(tǒng)文庫構建：BAC克隆->Shotgun/PCR一個片段=一個反應珠454測序流程

emPCR2.emPCR每個DNA分子獨立進行PCR反應后獨立測序擴增效果好，適應高GC含量片段、甚至FFPE樣本一個反應珠=一個讀長單克隆測序的價值

通過emPCR實現(xiàn)單克隆直接閱讀每一種分子結果突變比例的計算（低頻）基于實際的序列信息每個DNA分子獨立進行PCR反應后獨立測序擴增效果好，適應高GC含量片段、甚至FFPE樣本Sanger流程-混合測序454流程-單克隆測序454測序流程

測序

特異的測序引物和單鏈DNA模板結合,加入一種dNTP

DNA聚合酶的作用下，單個dNTP與模板的下一個堿基配對，同時釋放出一個分子的焦磷酸(PPi)

在ATP硫酸化酶的作用下，PPi和APS結合形成ATP在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結合形成氧化熒光素，同時產生可見光，被CCD捕捉Apyrase降解剩余的dNTP和殘留的少量ATP加入另一種dNTP重復2-5步驟在每一個測序循環(huán)里，堿基以同樣的次序(TACG)流過PicoTiterPlate板當模板鏈的互補核苷酸加入延伸鏈時，會產生了熒光信號熒光信號強度與所加入的核苷酸數(shù)目成比例熒光信號被CCD照相機記錄熒光素酶ATP硫酸化酶氧化熒光素可見光3.基于焦磷酸反應的邊合成邊測序13SequencingBySynthesisAATCGGCATGCTAAAAGTCACTARepeateddNTPflowsequence:GGTCAGTCAGTTTTCAGGATCCCGATTGCTAAnnealPrimerProcesscontinuesuntiluser-definednumberofnucleotideflowcyclesarecompleted.邊合成邊測序實驗體系的不斷優(yōu)化使得當前可獲得Junior平均為400bp的讀長并將繼續(xù)以提升讀長為技術的發(fā)展方向之一454測序流程

數(shù)據(jù)獲取

圖像處理信號處理454測序流程

數(shù)據(jù)分析

測序與分析同時進行，10小時完成10小時產出10萬條以上的序列自帶4套軟件，滿足多數(shù)應用需求軟件自動過濾，高質量序列比例高400bp的位置仍可保持Q20的準確性GSJunior在德國大腸桿菌事件中

NicholasJLomanetal.,Performancecomparisonofbenchtophigh-throughputsequencingplatforms,NatureBiotechnology,2012[DOI:10.1038/nbt.2198]454GSJunior擁有最長的讀長，平均讀長在522個堿基，99%的序列可以用于基因組拼接6月3日收到樣本，6月5日完成全部測序與機制確認工作數(shù)據(jù)分析僅由HPA的非專業(yè)生信團隊，不到半天時間即得到結果序列讀長分布圖

Junior測序系統(tǒng)運行產生的讀長范圍為50-600bp，甚至更長shotgun實驗將利用幾乎全部數(shù)據(jù)平均讀長為400bp典型讀長在450-550bp范圍Amplion實驗將主要根據(jù)典型讀長進行PCR引物設計NumberofreadsReadlength(bases)SimplesimpleCGTAGGCTAGATGCATGCAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATATAGCGATCTCGACATGCTComplex454longreadsShortreadtechnology?????454長測序能夠帶來什么

emPCR保證樣本的獲得，長焦磷酸確保閱讀

長讀長的價值

一條reads通讀一個目標序列，無需拼接，避免錯誤產生與時間消耗通過一條reads判斷突變的連鎖關系更少引物獲得更多目標引物設計的區(qū)間更靈活Junior1條reads既可通讀HBV耐藥相關基因的PCR產物HBV耐藥RT基因(1032nt)檢測有overlap的4個片段Fragment1(372nt)9Fragment2(401nt)9Fragment3(396nt)9Fragment4(314nt)9TheJournalofInfectiousDisease,May2009;199(9):1275-85.PCR擴增子文庫的設計

長讀長給予更多引物設計空間，1條reads通讀熱點突變區(qū)域454B-primer(19bp)LocusspecificPCRamplificationemPCR&雙向測序Targetspecificsequence(ca.25bp)454A-primer(19bp)ABSequenceofinterest200–400bp通過MID序列，可以混合多個樣本測序同時測序DataanalysisRT基因可設計3個PCR產物片段S基因可設計2個PCR產物片段C基因可設計1個PCR產物片段X基因可設計1個PCR產物片段Pre-C基因可設計1個PCR產物片段454測序在HBV耐藥基因測序的應用方案Day1DNA提取Day1PCR產物的獲取Day1PCR產物純化Day1PCR產物樣品定量(Agilent2100,qPCR儀)Day1PCR產物樣品均一化Day1PCR產物混樣Day1454測序建庫加接頭(10min)Day2emPCR擴增(2h手工操作+6h機器運行)Day3454Junior測序(10h)Day4數(shù)據(jù)分析454測序步驟

HBV耐藥檢測應用emPCR(乳滴PCR)擴增每一帶有MID與測序引物的HBV耐藥突變高發(fā)DNA片段在其各自的微乳滴中進行獨立擴增，排除了其它競爭性或污染性序列對PCR反應的影響。焦磷酸測序將所有結合有DNA片段的磁珠置于PicoTiterPlate(PTP板)中進行測序。PTP板的孔徑恰好僅能容納一顆磁珠。將PTP板置于GS測序儀中，單個核苷酸依次流經孔洞和DNA捕獲磁珠間。當所加入的核苷酸與模板互補時，便產生化學發(fā)光信號，進而被GS系統(tǒng)的CCD相機記錄。454的分析結果呈現(xiàn)

可檢測單點突變454的分析結果呈現(xiàn)

可關注已知突變MultipleMutationsinaCodonAssociatedwithNRTIResistanceT69ConfidentialMultipleMutationsinaCodonAssociatedwithNRTIResistanceThr6935%Alanine,42%Asparagine,and1.2%SerineConfidential454的分析結果呈現(xiàn)

可檢測有意義的連鎖突變位點已有RT基因突變數(shù)據(jù)庫

StandfordHBVSeq

StandfordHBVSeq結果展示近兩年使用454發(fā)表HBV耐藥檢測文獻AnalysisofhepatitisBvirusdrug-resistantmutanthaplotypesbyultra-deeppyrosequencing.KoSY,OhHB,ParkCW,LeeHC,LeeJE.(2012)ClinMicrobiolInfectePub:Ultra-deeppyrosequencingdetectsconservedgenomicsitesandquantifieslinkageofdrug-resistantaminoAcidchangesinthehepatitisBvirusgenome.Rodriguez-FríasF,TaberneroD,QuerJ,EstebanJI,OrtegaI,DomingoE,CuberoM,CamósS,Ferrer-CostaC,SánchezA,JardíR,SchaperM,HomsM,Garcia-CehicD,GuardiaJ,EstebanR,ButiM.(2012)PLoSOne7(5):e37874.Long-termmonitoringdrugresistancebyultra-deeppyrosequencinginachronichepatitisBvirus(HBV)-infectedpatientexposedtoseveralunsuccessfultherapyschemes.SedeM,OjedaD,CassinoL,WestergaardG,VazquezM,BenettiS,FayF,TannoH,QuarleriJ.(2012)AntiviralResearchePub:Ultra-deeppyrosequencinganalysisofthehepatitisBviruspreCoreregionandmaincatalyticmotifoftheviralpolymeraseinthesameviralgenome.HomsM,ButiM,QuerJ,JardíR,SchaperM,TaberneroD,O