實時熒光定量PCR技術(shù)原理應(yīng)用及實踐

實時熒光定量PCR技術(shù)原理應(yīng)用及實踐第一頁，共六十九頁，2022年，8月28日2北京康為世紀生物科技有限公司康為的目標：成為中國的Invitrogen您的問題解決專家！第二頁，共六十九頁，2022年，8月28日3北京康為世紀生物科技有限公司

分子生物學核酸提取PCR、RT-PCR及熒光定量PCRDNA分子量標準克隆與轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)學相關(guān)蛋白提取與純化蛋白定量、蛋白Marker及蛋白電泳產(chǎn)品WesternBlot產(chǎn)品

免疫學相關(guān)免疫組化產(chǎn)品、免疫沉淀標簽抗體內(nèi)參抗體二抗完善的產(chǎn)品線第三頁，共六十九頁，2022年，8月28日4五大平臺一站式服務(wù)第四頁，共六十九頁，2022年，8月28日5園區(qū)公共服務(wù)平臺2010年康為世紀公司依托江蘇省泰州市政府及中國醫(yī)藥城的支持政策，成立江蘇康為世紀，主要進行創(chuàng)新的臨床診斷試劑的研發(fā)、生產(chǎn)與相應(yīng)的技術(shù)服務(wù)，占地面積約3300平米2700平米的實驗區(qū):

臨床生化診斷試劑研發(fā)平臺免疫診斷試劑研發(fā)平臺分子診斷試劑研發(fā)平臺免疫組化診斷試劑研發(fā)平臺約300平米GMP標準的生產(chǎn)車間總投資6500萬元泰州國家生物產(chǎn)業(yè)基地臨床診斷試劑研發(fā)與生產(chǎn)公共服務(wù)平臺第五頁，共六十九頁，2022年，8月28日6熒光定量PCR儀芯片點樣儀芯片掃描儀全自動核酸提取儀超速離心機焦磷酸DNA測序儀分子生物學平臺凝膠成像儀泰州國家生物產(chǎn)業(yè)基地臨床診斷試劑研發(fā)與生產(chǎn)公共服務(wù)平臺芯片雜交儀第六頁，共六十九頁，2022年，8月28日康為世紀生物科技有限公司7完善的產(chǎn)品線分子生物學全系列產(chǎn)品蛋白質(zhì)學產(chǎn)品免疫學相關(guān)產(chǎn)品一站式服務(wù)平臺實驗設(shè)計平臺分子生物學平臺蛋白表達與純化平臺抗體制備純化平臺免疫學檢測平臺北京康為世紀生物科技有限公司我們的客戶我們的合作伙伴北京大學、清華大學、復(fù)旦大學等中國科學院協(xié)和醫(yī)院、上海瑞金、軍事醫(yī)學科學院301醫(yī)院、醫(yī)院華大基因、諾華制藥九強、博奧等第七頁，共六十九頁，2022年，8月28日

用我們的產(chǎn)品發(fā)表的部分SCI文章a-Bisabololinducesdose-andtime-dependentapoptosisinHepG2cellsviaaFas-andmitochondrial-relatedpathway,involvesp53andNFkBStateKeyLaboratoryofVirology,CollegeofLifeSciences,WuhanUniversity,Wuhan430072,ChinaCCR4-NOTDeadenylatesmRNAAssociatedwithRNA-InducedSilencingComplexesinHumanCellsStateKeyLaboratoryofMolecularBiologyandCellBiology,ShanghaiInstitutesforBiologicalSciences,ChineseAcademyofSciences,Shanghai,ChinaCoadministrationofhuperzineAandligustrazinephosphateeffectivelyreversesscopolamine-inducedamnesiainratsSchoolofPharmacy,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,PRChinaEffectsofMicrogravityModeledbyLargeGradientHighMagneticFieldontheOsteogenicInitiationofHumanMesenchymalStemCellsCCR4-NOTdeadenylatesRISC-associatedmRNAinhumancells

StateKeyLaboratoryofMolecularBiology,InstituteofBiochemistryandCellBiologyShanghaiInstitutesforBiologicalSciences,ChineseAcademyofScienceshanghai,china第八頁，共六十九頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容

Real-timeqPCR的定量原理2Real-timeqPCR的檢測方法3Real-timeqPCR的基本概念1Real-timeqPCR的解析方法4第九頁，共六十九頁，2022年，8月28日PCR：偉大的天才發(fā)明UseofLSDSynthesisandself-testingofnovelpsychoactivesubstancesBeliefinastrology第十頁，共六十九頁，2022年，8月28日PCR：基本原理Denaturation:94–96°CAnnealing:50–65°CExtension:70–75°C基本要素：

TemplatePrimersDNApolymerasedNTP,N=A,G,CorT第十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日

PCR：基本原理理想的PCR反應(yīng)：

N=N0*2n實際的PCR反應(yīng)：

N=N0*(1+E)nN0：初始模板量N：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量n：擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)

E：擴增效率S形曲線，具有平臺效應(yīng)第十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日

與普通PCR的對比同一個樣本進行96次重復(fù)傳統(tǒng)PCR檢測RealtimePCR檢測RealtimePCR--起點檢測：--起點量是樣本中起始的DNA量--“加入了500個拷貝”--具有重現(xiàn)性，誤差小傳統(tǒng)PCR--終點檢測：--終點產(chǎn)物量經(jīng)過PCR放大的DNA量--“生成了500，0000，0000個拷貝”--不恒定，誤差大傳統(tǒng)PCR檢測第十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日Real-timeqPCR激發(fā)光發(fā)射光--在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團。--熒光基團在激發(fā)光的作用下，產(chǎn)生波長更長的發(fā)射光。--利用熒光信號的變化動態(tài)監(jiān)測整個反應(yīng)過程。

熒光基團第十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日

擴增曲線（primarycurve）擴增曲線：隨著PCR反應(yīng)的進行，擴增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強度不斷增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次熒光信號，通過熒光強度的變化監(jiān)測擴增產(chǎn)物量的變化，從而得到擴增曲線圖。縱坐標：Rn（熒光值）橫坐標：cyclenumber（循環(huán)數(shù)）線性圖對數(shù)圖第十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日

熒光閾值（threshold）基線(baseline)：一般以PCR反應(yīng)前15個循環(huán)的熒光信號作為本底信號熒光閥值(threshold)：擴增曲線上人為設(shè)定的一個值--缺省設(shè)置：PCR反應(yīng)前3-15個循環(huán)熒光本底信號標準偏差的10倍--手動設(shè)置：大于樣本的熒光背景值第十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日Ct

值(CycleThreshold)Ct值：PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時，熒光值所對應(yīng)的PCR循環(huán)次數(shù)。起始模板量基線閾值Ct值第十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日

Ct

值(CycleThreshold)Ct值的特點：相同模板進行96次擴增，平臺期DNA拷貝數(shù)波動很大，但Ct值相對固定；Ct值則極具重現(xiàn)性第十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日Ct值可以確定初始模板量？

Rn=RB+X0

(1+E)N*RS第n個循環(huán)的總信號=本底信號+起始DNA數(shù)目*PCR擴增效率*單位信號強度當循環(huán)次數(shù)n=Ct時RCt=RB+X0

(1+E)Ct*RS兩邊同時取對數(shù)得:lg(RCt-RB)=lgX0+Ctlg(1+E)+lgRSCt=-lgX0/lg(1+E)+lg(RCt-RB)-lgRS/lg(1+E)

Ct=-klgX0+bCompanynamelgX0與Ct值呈線性關(guān)系根據(jù)Ct值可以計算出樣本中起始模板所含有的拷貝數(shù)起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。第十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日CompanynameRnvs.Cyclenumber--擴增曲線LogDNAvs.Ct--標準曲線.未知10410310610510210標準曲線(standardcurve)標準曲線分析--對已知或未知樣本進行系列濃度梯度稀釋第二十頁，共六十九頁，2022年，8月28日y=-ax+b測定熒光定量PCR反應(yīng)的有效性--線性的標準曲線：相關(guān)系數(shù)R2--擴增效率：擴增效率(E)=10-1/斜率-1標準曲線分析第二十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日

熒光定量PCR檢測方法染料標記：

SYBRGreenI探針標記：水解探針：

TaqMan非水解探針：Molecularbeacon

第二十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日SYBRGreenI工作原理SYBRGreenI

是一種與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料。SYBRGreenI只與雙鏈DNA結(jié)合才能發(fā)出熒光。熒光信號與雙鏈DNA分子數(shù)成正比，隨著擴增產(chǎn)物增加而增加。熒光信號強度與反應(yīng)體系中所有雙鏈DNA分子成正比。第二十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日5’3’5’3’SGSGSGSG5’3’5’3’SGSGSGSGEmissionExcitation--變性時，DNA雙鏈分開，無熒光信號。--延伸結(jié)束時，采集熒光信號。SYBRGreenI工作原理第二十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日SYBRGreenI優(yōu)點：

使用方便，成本低--僅需設(shè)計兩個引物通用性好--對DNA模板沒有選擇性需要在反應(yīng)結(jié)束時，對產(chǎn)物做融解曲線分析。缺點：SYBRGreen與所有雙鏈DNA結(jié)合--引物二聚體或錯誤擴增產(chǎn)物造成假陽性--只能檢測單一模板，無法進行多重檢測第二十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日將溫度對熒光強度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)

融解曲線(dissociationcurve)確認PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性對數(shù)圖譜原始圖譜第二十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日融解曲線分析--非特異性產(chǎn)物--引物二聚體第二十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日

Taqman

工作原理探針與靶序列配對（一段序列，兩個基團，5’

報告基團、3’淬滅基團）完整的探針，報告基團R發(fā)射的熒光被淬滅基團Q淬滅，沒有熒光產(chǎn)生。聚合酶的5’外切酶活性報告基團R與淬滅基團Q分離，發(fā)射熒光。RQReporterQuencherRQ熒光信號強度與結(jié)合探針的DNA分子成正比。第二十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日Taqman工作原理

在退火過程中，探針與靶序列結(jié)合探針被Taq酶的5’-3’外切酶活性剪切成片斷游離報告基團發(fā)出熒光在延伸過程中，探針部分與靶序列分離第二十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日

SYBRGreenI與Taqman對比Taqman特異性高--與特異靶序列結(jié)合對模板有選擇性--可進行多重PCR反應(yīng)

SYBRGreenI

使用方便，成本低--僅需設(shè)計兩個引物通用性好--對DNA模板沒有選擇性第三十頁，共六十九頁，2022年，8月28日

熒光定量PCR解析方法絕對定量

樣本中核酸的量（拷貝數(shù)、微克）--檢測某給定血液樣本中的病毒顆粒數(shù)，有6000個拷貝相對定量

不同樣本中目的基因表達量的差異--腫瘤組織和正常組織相比

某個基因的表達量mRNA改變了多少倍，改變了60倍第三十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日絕對定量的步驟

拷貝數(shù)計算對標準品進行梯度濃度稀釋熒光定量PCR反應(yīng)建立標準品未知樣品Ct代入標準曲線確定拷貝數(shù)質(zhì)粒提取OD值測定計算待測樣本濃度/樣本分子量/待測樣本拷貝數(shù)標準品進行5-6個梯度稀釋標準品稀釋倍數(shù)為10第三十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日絕對定量Sample--樣本起始濃度與Ct呈線性關(guān)系，根據(jù)已知拷貝的標準品作出標準曲線。--根據(jù)未知樣品的Ct值，推算出未知樣本量。以標準品為標桿第三十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日相對定量參照樣本Calibrator用于比較結(jié)果的基準。第三十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日相對定量特點選擇內(nèi)參基因內(nèi)參基因beta-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因housekeepinggene在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響較小--文獻檢索--實驗篩選內(nèi)參基因--同樣體積或重量的樣本所來源的細胞數(shù)目不同。--RNA抽提、反轉(zhuǎn)效率不同，操作中存在誤差。對樣本初始濃度差異進行均一化校正。第三十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日2-ΔΔCt法成立條件：假設(shè)擴增效率為100%滿足條件：1）內(nèi)參基因和目標基因的擴增效率接近2）內(nèi)參基因和目標基因的擴增效率均為90%-110%假設(shè)條件：內(nèi)參基因和目標基因擴增效率差異大于5%1）優(yōu)化實驗條件，使擴增效率接近2）使用其他方法

相對定量方法第三十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日2-ΔΔCt法

相對定量舉例第三十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日

相對定量分析

待測樣品目的基因濃度待測樣品內(nèi)參基因濃度

F=對照樣品目的基因濃度

對照樣品內(nèi)參基因濃度假設(shè)條件：內(nèi)參基因和目標基因擴增效率不同優(yōu)點：實驗優(yōu)化簡單缺點：每一輪實驗都必需做標準曲線

雙標準曲線法80%第三十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日

相對定量舉例

雙標準曲線法第三十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日

實驗流程第四十頁，共六十九頁，2022年，8月28日

SYBRGreen法實驗流程樣本處理RNA提取qPCR數(shù)據(jù)分析逆轉(zhuǎn)錄第四十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日樣本處理與RNA提取外界刺激

–10min

–可檢測的表達改變樣品離開定義環(huán)境–2min–裂解、固定細胞TRIzon（酚、異硫氰酸胍）

裂解液（氰酸胍，異硫氰酸胍，SDS）液氮RNA保存液小心DNA污染！使用DNase陰性對照第四十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄引物選擇下游應(yīng)用：是否檢測其它基因？AbundantRNA的干擾：mRNAortotalRNA？檢測靈敏度是否足夠？第四十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日

RT-PCR一步法還是兩步法？兩步法:反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增分兩步進行。步驟多但靈活多樣。cDNA可長期保留檢測多個基因。便于反應(yīng)優(yōu)化。在工作的初期。一步法：反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增在同一管內(nèi)完成。

簡便、快捷但只做一個基因，一旦失敗難以查找原因。在工作的成熟階段。第四十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日熒光定量PCR體系Template

PrimersDNA聚合酶BufferanddNTPsDye第四十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日總原則與普通PCR相同：避免引物二聚體，避免二級結(jié)構(gòu)擴增片段長度（80-300bp)推薦做跨intron設(shè)計引物設(shè)計原則第四十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日Mastermix使用Mastermix有效降低系統(tǒng)誤差--熱啟動酶Hotstar化學修飾，低溫下酶活抑制性強，熱復(fù)活需10minFastHotstar抗體修飾，熱復(fù)活僅需幾十秒--Buffer反應(yīng)增強劑減少模板二級結(jié)構(gòu)影響控制Mg2+濃度穩(wěn)定劑--DyeRealSYBRGreenmixRealSupermix第四十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日Mastermix的優(yōu)化

新型熒光染料(SuperGreen)激發(fā)、發(fā)射波長與SYBRGreen近似對PCR反應(yīng)抑制更輕微可使用較高濃度(>1uM,SYBRgreen<0.3uM)更亮，靈敏度更高較短的鏈延長時間對小片段DNA和ssDNA結(jié)合更弱減少背景，有效信號更強與更強的信號協(xié)同，使溶解曲線峰更窄，適合于HRM分析化學性質(zhì)更穩(wěn)定致突變性與毒性更弱SYBRGreenSuperGreen第四十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日MasterMixROXPassiveReference不參與、不干擾PCR反應(yīng)恒定發(fā)射熒光信號用于校正因信號檢測器到各孔間光路不同而導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差。有不同系統(tǒng)，需參照儀器要求選擇。第四十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日

誤差控制使用Mastermix配置預(yù)混體系設(shè)置生物學重復(fù)（不同個體）

技術(shù)性重復(fù)（復(fù)孔）陽性和陰性對照實驗環(huán)境控制試劑準備區(qū)核酸制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)熒光定量PCR反應(yīng)區(qū)熒光定量PCR體系第五十頁，共六十九頁，2022年，8月28日數(shù)據(jù)分析融解曲線：單一特異性產(chǎn)物擴增曲線：--Ct值大小--各復(fù)孔之間重復(fù)性--不同濃度梯度稀釋的間隔性標準曲線：--R2＞0.980或∣

r∣

＞0.990--反應(yīng)效率盡可能高：90%-110%--目的基因的擴增效率接近內(nèi)參基因第五十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日操作注意事項為避免加樣誤差，保證重復(fù)性，配制預(yù)混體系配制反應(yīng)體系時，液體要緩慢加至管底，減少吹打低速離心，充分混勻，如有氣泡短暫離心不要直接在八連管上進行標記避光保存，試劑分裝避免反復(fù)凍融酒精擦拭移液器的吸頭設(shè)置反應(yīng)重復(fù)（至少二個）設(shè)置對照第五十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日熒光定量PCR儀ABI730075007900Roche羅氏Bio-rad伯樂第五十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日熒光定量PCR儀Agilent安捷倫QiagenRotor-GeneQCorbettRotor-Gene6000第五十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日案例分析總體原則偶然因素--操作原因?qū)嶒炛貜?fù)–

生物學重復(fù)、技術(shù)性重復(fù)機器因素–

儀器加樣孔結(jié)合擴增曲線、融解曲線、標準曲線分析單孔和多孔分析內(nèi)參基因和目的基因?qū)Ρ确治龅谖迨屙?，共六十九頁?022年，8月28日案例分析–擴增曲線曲線拐點清楚，特別是低濃度樣本指數(shù)期明顯。擴增曲線整體平行性好，基線平而無上揚現(xiàn)象。模板進行梯度稀釋時，各濃度間隔性好。

Ct15-35重復(fù)性

第五十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日擴增曲線--低濃度樣本沒有稀釋好--重復(fù)性差，加樣存在誤差案例分析–擴增曲線第五十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日案例分析–擴增曲線無信號或Ct值偏大內(nèi)參基因和目的基因均無信號--RNA降解內(nèi)參基因和目的基因均偏大--模板量低--對未知濃度的樣品應(yīng)從稀釋最高濃度做起內(nèi)參基因正常，而目的基因偏大或無信號

--引物設(shè)計--目的基因表達量低第五十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日案例分析Q．內(nèi)參基因與目的基因的Ct值之差在多大范圍內(nèi)可以接受？A：--在使用2-△△Ct法計算的前提是，公式成立的條件是內(nèi)參基因和目的基因的擴增效率相接近并且足夠高，在90%-110%之間，因此內(nèi)參基因與目的基因的差值是可以接受的。--內(nèi)參基因和目的基因的Ct值在15-35以內(nèi)，并且重復(fù)管之間的重復(fù)性很好，這樣的數(shù)據(jù)都是可以接受的。第五十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日案例分析–擴增曲線擴增曲線不平滑--樣本濃度太低--原始信號弱關(guān)閉ROX校正信號第六十頁，共六十九頁，2022年，8月28日案例分析–擴增曲線擴增曲線很早揚起--樣本濃度太高（稀釋樣品濃度）第六十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日案例分析–熔解曲線熔解曲線出現(xiàn)雙峰引物峰：--陰性對照（體系污染，配合擴增曲線）--降低引物濃度--重新設(shè)計引物非特異性擴增--基因組污染--非特異片段（重新設(shè)計引物）第六十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日案例分析–熔解曲線非正常熔解曲線--試劑污染--儀器需要校正第六十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日各點之間線性關(guān)系各孔的重復(fù)性R2相關(guān)系數(shù)Slope~E反應(yīng)效率案例分析–標準曲線第六十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日案例分析–標準曲線標準曲線的線性關(guān)系不佳--加樣存在誤差--樣品稀釋不準確使得標準曲線不呈梯度。第六十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日