實(shí)驗(yàn)六抗體效價(jià)的Elisa測(cè)定

實(shí)驗(yàn)六抗體效價(jià)的Elisa測(cè)定第一頁，共三十二頁，2022年，8月28日2.基本原理免疫酶技術(shù):酶標(biāo)Ab/Ag,酶結(jié)合物的酶在免疫反應(yīng)后，作用于厎物后顯色，根據(jù)顏色的有無和深淺，定量測(cè)定Ab/Ag。免疫反應(yīng)：一次或數(shù)次具Ag,Ab特異的免疫學(xué)反應(yīng)酶促反應(yīng)：只進(jìn)行一次

顯示出生物放大作用，靈敏度ng,pg第二頁，共三十二頁，2022年，8月28日60年代初期，Averameas&Ram等建立了免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)

利用特殊的交聯(lián)劑研制出辣根過氧化物酶---人血清白蛋白及酸性磷酸酯酶---抗體，統(tǒng)稱為酶標(biāo)記物或酶結(jié)合物，用于抗原或抗體的示蹤、定位或定量測(cè)定第三頁，共三十二頁，2022年，8月28日酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linkedimmunosorbentassay簡(jiǎn)稱為Elisa)-----是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)。本法兼有靈敏度高和特異性強(qiáng)兩方面的優(yōu)點(diǎn)。第四頁，共三十二頁，2022年，8月28日1974年Voller等用聚苯乙烯微量反應(yīng)板作為免疫吸附劑吸附抗體(抗原)，再與相應(yīng)的酶標(biāo)記物結(jié)合操作更方便，易重復(fù)靈敏度可高達(dá)ng（10-9g）至pg(10-12g)，第五頁，共三十二頁，2022年，8月28日(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)第六頁，共三十二頁，2022年，8月28日免疫標(biāo)記技術(shù)第七頁，共三十二頁，2022年，8月28日應(yīng)用各種液相和固相免疫分析方法，對(duì)體液中的半抗原、抗原或抗體進(jìn)行定性和定量測(cè)定標(biāo)記抗體或抗原熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)(或生物)發(fā)光劑鏡檢觀察或進(jìn)行自動(dòng)化測(cè)定熒光顯微鏡，射線測(cè)量?jī)x，酶標(biāo)檢測(cè)儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測(cè)定儀等直接在細(xì)胞、亞細(xì)胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上,對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定性和定位研究第八頁，共三十二頁，2022年，8月28日酶------性能穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)易得、底物無色、產(chǎn)物顯色，便于檢測(cè)常用的酶:堿性磷酸酯酶、辣根過氧化物酶(horseradperoxidase簡(jiǎn)稱HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。酶標(biāo)技術(shù)第九頁，共三十二頁，2022年，8月28日戊二醛法，過碘酸氧化法將酶與Ab交聯(lián)在一起Ag-Ab-抗Ab-HRPTMB+H2O2產(chǎn)物（黃色，OD450)+H2O第十頁，共三十二頁，2022年，8月28日?qǐng)D一直接型Elisa

第十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日?qǐng)D二間接型Elisa第十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日?qǐng)D三雙抗體夾心型ELISA第十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日?qǐng)D四固相抗體競(jìng)爭(zhēng)型ELISA未知抗原量=A（1）-A（2）第十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日每次反應(yīng)后都要反復(fù)洗滌？保證反應(yīng)的定量反應(yīng)防止重疊反應(yīng)，引起非特異現(xiàn)象。第十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日第十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日Partiallypurified,inactivatedHIVantigensantigenspre-coatedontoanELISAplatePatientserumwhichcontainsantibodies.IfthepatientisHIV+,thenthisserumwillcontainantibodiestoHIV,andthoseantibodieswillbindtotheHIVantigensontheplate.

Anti-humanimmunoglobulincoupledtoanenzyme.Thisisthesecondantibody,anditbindstohumanantibodies.

substratewhichchangescolorwhencleavedbytheenzymeattachedtothesecondantibody.HIV(humanimmunodeficiencyvirus)detection第十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日positivenegative第十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日第十九頁，共三十二頁，2022年，8月28日Proteinproteininteraction---ELISA1.DirectelisadifferentepitopeCoatwithpreyproteinIncubatewithbaitproteinPimaryAbantibaitprotein-----第二十頁，共三十二頁，2022年，8月28日2.CompetitiveelisasameepitopeCoatwithbaitprIncubatewithprimaryantibodyantibaitprandvariousconcentrationpreyprotein第二十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日4.操作方法4.1包被特異性抗原:固體抗原(如蛋白質(zhì))用包被液稀釋至10Oμg/ml，每凹孔加100μL，加蓋置4℃過夜(37℃2h)【已完成】次日傾去凹孔內(nèi)液體，用滴管取洗滌液在每孔中加滿稀釋/洗滌液洗滌3次，首次洗滌靜置2min后傾去，后兩次靜置1min。將反應(yīng)板扣放在濾紙上，以除凈液體。4.2封閉:每孔中加滿封閉液（約300ul多），加蓋或用封口膜封板，置37℃恒溫箱60min，傾去孔內(nèi)液體，按上法洗滌3次。第二十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日4.3加待測(cè)血清(內(nèi)含抗體)、陰性血清(無抗體)及稀釋液(PBS/Tween):待測(cè)血清按倍比法用稀釋液稀釋(1:100、1:200等)，陰性血清也稀釋成1:100，取不同稀釋度的待測(cè)血清，陰性血清及稀釋液(PBS/Tween)各1OOμL加至相應(yīng)的凹孔中，加蓋或封板，置37℃恒溫箱1h，使抗體與固相抗原進(jìn)行特異性結(jié)合，反復(fù)洗滌3次。第二十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日12345678PBS/Tween1:100陰性血清1:1,0001:5,0001:10,0001:50,0001:100,0001:500,000陽性血清第二十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日4.4加酶標(biāo)抗體:加入HRP-抗體(抗抗體，本實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)根據(jù)說明書稀釋一千倍)，每孔加l00μL，封板后置37℃溫育lh，按上法至少洗滌5次，最后用蒸餾水洗滌2次，扣在濾紙上吸干水分。4.5顯色:首先按每10mLOPD應(yīng)用液加入0.15mLH2O2處理。每孔加入OPD應(yīng)用液1OOuL、反應(yīng)板置室溫暗處5～30min。當(dāng)顯示明顯黃色時(shí)應(yīng)及時(shí)終止反應(yīng)。4.6終止反應(yīng):每孔加入10OμL2mol/LH2SO4。由黃色變?yōu)槌壬?。穩(wěn)定3～5min即可比色測(cè)定。第二十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日4.7檢測(cè):用酶聯(lián)免疫測(cè)定儀，以PBS/Tween孔為對(duì)照、測(cè)波長(zhǎng)為49Onm時(shí)各孔光吸收（A）。計(jì)算陽性血清與陰性血清A值之比(Positive/negative，P/N)，當(dāng)P/N≥2.1時(shí)為陽性，P/N<2.1而≥1.5為可疑，P/N<1.5為陰性。用目測(cè)法則以較陰性對(duì)照深色的最高稀釋度作為抗體效價(jià)。用“＋”“－”表示，超過規(guī)定吸收值（0.2－0.4）的標(biāo)本均屬陽性。第二十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日

注意事項(xiàng)

(1)聚苯乙烯微量反應(yīng)板應(yīng)選擇高質(zhì)量、非特異性吸附小的產(chǎn)品。包被物應(yīng)具有較高的純度，其濃度一般在1～100μg之間，在偏堿條件下易吸附于反應(yīng)板的凹孔中，4℃放置過夜較理想，若暫時(shí)不用，可加入終濃度為0.02%NaN3，4℃貯存，也可傾去包被液，干燥后置硅膠干燥器中，室溫存放3個(gè)月以上不影響測(cè)定效果。(2)反應(yīng)各步均應(yīng)充分洗滌，以除去殘留物，減少非特異性吸附。為使結(jié)果重復(fù)應(yīng)固定洗滌次數(shù)及放置時(shí)間，切忌相互污染。(3)為使顯色反應(yīng)便于比較，顯色后置室溫暗處的時(shí)間應(yīng)一致，終止反應(yīng)3～5min后應(yīng)立即比色。必要時(shí)可設(shè)陽性對(duì)照，以固定顯色及終止時(shí)間。(4)待測(cè)抗體或抗原與酶標(biāo)抗體應(yīng)具有相同的免疫特異性，否則無法結(jié)合。第二十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日自動(dòng)酶標(biāo)儀（Elx800UV）使用程序1開機(jī)，進(jìn)行Systemself-test…2按“DEFINE”鍵，進(jìn)入“SELECTASSAYNUMBER”，用“NUMERIC”或“OPTION”鍵輸入測(cè)試號(hào)（注：assay01為quickread，最大測(cè)試號(hào)為55）；按“ENTER”鍵修改測(cè)試的“NAME”；再按“ENTER”鍵進(jìn)入下列菜單：按“METHOD”鍵選擇測(cè)試的波長(zhǎng)類型（Single或Dual）、波長(zhǎng)大小(340、405、450、490或630nm)、微孔板類型(96孔、48孔或24孔)。按“MAP”鍵選擇閱讀方式(Auto或Manual)、閱讀方向（Down或Across）、重復(fù)方向（Down或Across）、閱讀起始位置（輸入編號(hào)）、空白Map（Air、Full、Const、Column、P-Down、P-Across）。第二十九頁，共三十二頁，2022年，8月28日3按“READ”鍵，酶標(biāo)板推進(jìn)入儀器，開始讀數(shù)并計(jì)數(shù)，打印機(jī)輸出數(shù)據(jù)。4按“MAINMENU”鍵回到主菜單，關(guān)閉電源。

第三十頁，共三十二頁，2022年，8月28日酶標(biāo)板的清洗：采用ELx50TM型微孔板洗板機(jī)，注射泵驅(qū)動(dòng)的液體輸送，條狀單排清洗或全板清