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文檔簡介
免疫標記技術
用可以微量檢測的標記物(示蹤物質)標記抗原或抗體,作為試劑,與相應抗體或抗原結合反應后,測定抗原抗體復合物中的標記物,從而推斷所測抗體或抗原有無及量的多少。免疫標記技術
=抗原抗體反應示蹤物標記靈敏性特異性免疫標記技術的主要特點:高特異性、高靈敏性免疫技術+標記技術酶熒光素同位素常用標記物
熒光素酶同位素膠體金可發(fā)光化學物質試驗命名:
根據(jù)標記物命名如:免疫熒光技術免疫酶技術等第七章熒光免疫技術(fluoroimmunoassay)(P61)
原理:用熒光素標記抗原或抗體,與待測標本中相應抗體或抗原結合,通過檢測熒光,確定標本中有無待測的抗體或抗原。特點:特異性、敏感性、直觀性熒光免疫技術分類:免疫熒光顯微技術(定性、定位)免疫熒光測定技術---熒光免疫分析(定量)一.熒光、熒光素及熒光顯微鏡(一)熒光
一種光照射某種物質時,該物質由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài),當回復至基態(tài)時,可發(fā)射出比照射光波長更長的光,稱為熒光。照射光:可見光、紫外光(二)熒光素
能產生熒光的物質,可作為染料。
常用熒光素:1.異硫氰酸熒光黃(FITC)
可發(fā)出黃綠色熒光2.四乙基羅丹明(RB200)
發(fā)出橘紅色熒光3.藻紅蛋白(PE)
發(fā)出橙色熒光4.鑭系螯合物:銪(Eu3+)、鉍(Tb3+)、鈰(Ce3+)等螯合物。熒光衰變時間長,適合時間分辨熒光免疫測定(三)熒光顯微鏡
1.結構:主要組成
A.白熾光源(超高壓汞燈):發(fā)射紫外光或蘭紫光;
B.兩組濾光板:激發(fā)濾板(選擇合適的激發(fā)光譜);抑制濾板(抑制紫外光或蘭紫光進入視野,只允許熒光通過。
C.顯微鏡:普通的光學顯微鏡。
光路程序:白熾光源——發(fā)射紫外光or蘭紫光——激發(fā)濾板——紫外光
——被檢物(熒光染色標本)——紫外光+熒光
——抑制濾板——熒光(顯微鏡下可見)目鏡阻擋濾鏡載玻片熒光顯微鏡光路示意圖光源隔熱濾片激發(fā)濾片聚光器物鏡熒光顯微鏡光路示意圖熒光顯微鏡據(jù)光源路徑分
透射式(光源從下面經聚光器會聚后到達樣品,適用于觀察對光可透的標本)落射式(光源從上面到達樣品,經標本反射進入物鏡。適用于觀察透明度不好的標本及各種活性組織等)2.使用注意事項:染色后立即檢查(熒光易猝滅)準備好后開啟白熾光源,不能隨時啟滅。打開后15分鐘才能關閉每次使用2小時保持室內通風
熒光素可以標記(染色)抗原,也可以標記抗體標記抗原用得少標記抗體用得多
一般免疫熒光顯微技術均標記抗體二.免疫熒光顯微技術(一)熒光抗體的制備(二)片子的制作(三)熒光抗體染色方法(一)熒光抗體的制備:
純化的一定量抗體加一定量FITC(攪拌使結合)去除游離熒光素測抗體效價、測熒光素與蛋白質(Ab)結合比(F/P)
小量分裝保存?zhèn)溆肍/P是評價熒光抗體的重要指標?;罴毎旧篎/P=2.4
固定標本染色:F/P=1.5
抗體效價:>1:16(二)片子的制作:1.常做切片(組織)、涂片(細菌)、印片(細胞),要求薄、均勻,并與玻片充分固定。固定后不能被洗脫。2.注意保持抗原完整性3.不同材料固定方法不同(無水已醇、丙醇、聚甲醛等)(三)熒光抗體染色法
1.直接法
待測標本固定(Ag?)+Ab
快、直接、干擾因素少用于檢測抗原每檢測一種抗原需標記相應的熒光抗體,較麻煩洗滌,AgAb2.間接法
分兩步:第一步:熒光素標記抗抗體(如熒光標記的羊抗人IgG);
第二步:已知Ag固定+待測標本(Ab?)——洗滌,+熒光標記的抗抗體——洗滌,熒光顯微鏡鏡檢
間接法用得最多優(yōu)點:制備一種熒光標記二抗(抗抗體)可用于多種Ab檢測靈敏度高3.補體法:第一步:熒光素標記抗補體;第二步:已知Ag固定+待測標本(Ab?)+補體——洗滌,+熒光標記的抗補體——洗滌,熒光顯微鏡鏡檢特點:
靈敏度高,制備一種熒光抗補體用于多
種檢測
干擾因素多,補體不穩(wěn)定,易失活,該法少用4.雙標記法
用兩種熒光素(FITC、羅丹明)分別標記針對同一Ag上不同抗原表位的抗體,對同一標本染色,當Ag有兩種相應抗原表位存在時,可同時見到黃綠和橙紅兩種熒光。(四)免疫熒光顯微技術優(yōu)缺點優(yōu)點:
1.特異性、敏感性高
2.快速
3.可定位
4.既可測Ag(各種病原體、腫瘤相關抗原)、可測Ab(自身抗體)缺點:1.需要熒光顯微鏡2.存在非特異熒光干擾(產生原因:自發(fā)、抗體不純、交叉反應、技術問題)3.定性測定、判斷結果不客觀4.制備的片子難以長期保存(熒光猝滅)4.免疫熒光顯微技術的優(yōu)缺點5.熒光顯微鏡的光源分幾種?三.熒光免疫分析時間分辨熒光免疫測定---液相檢測原理:用銪(Eu3+)等具有較長熒光壽命的稀土金屬作熒光標記物來標記Ab或Ag,從而檢測待測標本中相應Ag或
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