業(yè)務(wù)員測(cè)序常見問題解答

測(cè)序常見問題解答為什么提供新鮮的菌液？如何提供新鮮的菌液？DNA測(cè)序樣品用什么溶液溶解比較好？提供DNA測(cè)序樣品時(shí)，提供何種形態(tài)的比較好？提供的測(cè)序樣品為菌體時(shí)，以什么形態(tài)提供為好？PCR產(chǎn)物直接測(cè)序有什么要求？為什么PCR產(chǎn)物直接測(cè)序必須進(jìn)行Agarose膠純化？如何進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化？&對(duì)于測(cè)序用的質(zhì)粒DNA的要求有哪些？如何鑒定質(zhì)粒DNA濃度和純度？對(duì)測(cè)序引物的要求有哪些？為什么測(cè)序引物必須特異地與DNA模板結(jié)合？測(cè)序結(jié)果有很多套峰（出現(xiàn)很多N）,還照常收費(fèi)，為什么？為什么用PCR產(chǎn)物測(cè)序時(shí)，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)套峰現(xiàn)象？出現(xiàn)套峰的原因是什么？測(cè)序結(jié)果不到800Bases，還照常收費(fèi)了，為什么？為什么在測(cè)序報(bào)告上找不到引物序列？在測(cè)序結(jié)果上，找不到測(cè)序用引物后面的序列，為什么？怎樣使用擎科提供的測(cè)序報(bào)告？PCR片段直接測(cè)序和PCR片段經(jīng)克隆后測(cè)序的結(jié)果有何區(qū)別？測(cè)序結(jié)果和文獻(xiàn)資料不一樣，為什么？我的基因序列與標(biāo)準(zhǔn)序列為什么有差別？DNA片段很長(zhǎng)，一個(gè)反應(yīng)讀不到頭，怎么辦？測(cè)序完成后，測(cè)序樣品和引物將如何處理（或保存）？24怎樣選擇（設(shè)計(jì)）測(cè)序用引物？覺得你給我的結(jié)果完全不是我需要的序列？我的樣品上有一個(gè)雜合位點(diǎn)，為什么在你們的報(bào)告上看不到雜合的信號(hào)？超過6Kb的DNA片斷如何進(jìn)行測(cè)序？全自動(dòng)熒光測(cè)序的準(zhǔn)確性如何？用測(cè)序的方法檢測(cè)點(diǎn)突變可靠嗎？我要求5'到3'正向測(cè)序，為什么你們給我的序列是反的？我的樣品在你們所說的可靠范圍內(nèi)有一處存在疑問，能否重新測(cè)一次？我的樣品你們已經(jīng)測(cè)通了，但為什么在overlap區(qū)有這么多的錯(cuò)配，給出的全序列和單個(gè)報(bào)告也存在差異，我該相信誰？你們?yōu)槭裁丛趐rimerwalking時(shí)總將引物設(shè)計(jì)的那么靠前？我有一個(gè)4KB的PCR片段，希望你們幫我測(cè)通。樣品送測(cè)序前已經(jīng)鑒定過了，有插入片段的，為什么測(cè)序結(jié)果是一個(gè)空質(zhì)粒？對(duì)于測(cè)序結(jié)果有疑問怎么辦？Q-1.為什么提供新鮮的菌液？如何提供新鮮的菌液？返回頂端A-1.首先，新鮮的菌液易于培養(yǎng)，可以獲得更多的DNA，同時(shí)最大限度地保證菌種的純度。如果您提供新鮮菌液，用封口膜封口以免泄露；也可以將培養(yǎng)好的4~5ml菌液沉淀下來，倒去上清液以方便郵寄。同時(shí)郵寄時(shí)最好用盒子以免郵寄過程中壓破。Q-2.DNA測(cè)序樣品用什么溶液溶解比較好？返回頂端A-2.溶解DNA測(cè)序樣品時(shí)，用滅菌蒸餾水溶解最好。DNA的測(cè)序反應(yīng)也是Taq酶的聚合反應(yīng)，需要一個(gè)最佳的酶反應(yīng)條件。如果DNA用緩沖液溶解后，在進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)時(shí)，DNA溶液中的緩沖液組份會(huì)影響測(cè)序反應(yīng)的體系條件，造成Taq酶的聚合性能下降。有很多客戶在溶解DNA測(cè)序樣品時(shí)使用TEBuffer。的確，TEBuffer能增加DNA樣品保存期間的穩(wěn)定性，并且TEBuffer對(duì)DNA測(cè)序反應(yīng)的影響也較小，但根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，我們還是推薦使用滅菌蒸餾水來溶解DNA測(cè)序樣品。Q-3.提供DNA測(cè)序樣品時(shí)，提供何種形態(tài)的比較好？返回頂端A-3?我們推薦客戶提供菌體，由我們來提取質(zhì)粒，這樣DNA樣品比較穩(wěn)定。如果您可以提供DNA樣品，我們也很歡迎，但一定要注意樣品純度和數(shù)量。如果提供的DNA量不夠，我們就需要對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，此時(shí)需收取轉(zhuǎn)化費(fèi)。有些質(zhì)粒提取法提取的DNA質(zhì)量很好，象TaKaRa、Qiagen、Promega的質(zhì)粒制備試劑盒等。提供的測(cè)序樣品為PCR產(chǎn)物時(shí)，特別需要注意DNA的純度和數(shù)量。PCR產(chǎn)物必須進(jìn)行切膠回收，否則無法得到良好的測(cè)序效果。有關(guān)DNA測(cè)序樣品的詳細(xì)情況請(qǐng)嚴(yán)格參照“測(cè)序樣品的提供”部分的說明。Q-4.提供的測(cè)序樣品為菌體時(shí)，以什么形態(tài)提供為好?返回頂端A-4.一般，菌體的形態(tài)有：平板培養(yǎng)菌、穿刺培養(yǎng)菌，甘油保存菌或新鮮菌液等。我們提倡寄送穿刺培養(yǎng)菌或新鮮菌液。平板培養(yǎng)菌運(yùn)送特別不方便，我們收到的一些平板培養(yǎng)菌的培養(yǎng)皿在運(yùn)送過程中常常已經(jīng)破碎，面目全非，需要用戶重新寄樣。這樣既誤時(shí)間，又浪費(fèi)客戶的樣品。一旦是客戶非常重要的樣品時(shí)，其后果更不可設(shè)想。而甘油保存菌則容易污染。制作穿刺菌時(shí)，可在1.5ml的Tube管中加入瓊脂培養(yǎng)基，把菌體用牙簽穿刺于瓊脂培養(yǎng)基(固體)中，37°C培養(yǎng)一個(gè)晚上后便可使用。穿刺培養(yǎng)菌在4°C下可保存數(shù)個(gè)月，并且不容易污染，便于運(yùn)送。Q-5.PCR產(chǎn)物直接測(cè)序有什么要求？返回頂端A-5.(1)擴(kuò)增產(chǎn)物必須特異性擴(kuò)增，條帶單一。如果擴(kuò)增產(chǎn)物中存在非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，一般難以得到好的測(cè)序結(jié)果。必須進(jìn)行膠回收純化。DNA純化在1.6~2.0之間，濃度50ng/M以上。Q-6.為什么PCR產(chǎn)物直接測(cè)序必須進(jìn)行Agarose膠純化？返回頂端A-6.如果不進(jìn)行膠純化而直接用試劑盒回收，經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致測(cè)序出現(xiàn)雙峰甚至亂峰。這主要是非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物或者原來的PCR產(chǎn)物去除不干凈導(dǎo)致。大多數(shù)所謂的PCR“純化試劑盒”實(shí)際上只是回收產(chǎn)物而不能起到純化的作用。對(duì)于非特異擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)物肯定是無法去除，而且通常它們不能夠完全去除所有的PCR引物，這會(huì)造成殘留的引物在測(cè)序反應(yīng)過程中參與反應(yīng)而導(dǎo)致亂峰。Q-7.如何進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化？返回頂端A-7.PCR產(chǎn)物首先必須用Agarose膠電泳，將目的條帶切割下，然后純化。使用凝膠回收試劑盒回收。產(chǎn)物用ddH20溶解。A-8.對(duì)于測(cè)序用的質(zhì)粒DNA的要求有哪些？返回頂端A-8.對(duì)于測(cè)序用質(zhì)粒DNA的一般要求：DNA純度高，1.6~2.0之間，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色體DNA，蛋白質(zhì)等。溶于ddH20中，溶液不能含雜質(zhì)，如鹽類或EDTA等螯合劑，否則將干擾測(cè)序反應(yīng)的正常進(jìn)行。Q-9.如何鑒定質(zhì)粒DNA濃度和純度？返回頂端A-9?我們使用水平瓊脂糖凝膠電泳，并在膠中加入0.5ug/ml的EB,加入一個(gè)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品。電泳結(jié)束后在紫外燈下比較亮度，判斷濃度和純度。此方法可以更直接、準(zhǔn)確地判斷樣品中是否含有染色體DNA、RNA等，也可以鑒別抽提的質(zhì)粒DNA的不同構(gòu)型。質(zhì)粒DNA的3種構(gòu)型是指在抽提質(zhì)粒DNA過程中，由于各種原因的影響，使得超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒(SC)的一條鏈斷裂，變成開環(huán)狀(0C)分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就變成線狀(L)。這3種分子有不同的遷移率，通常，超螺旋(SC)遷移速度最快，其次是線狀(L)分子,最慢為開環(huán)狀(0C)分子。使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，或者用EB-標(biāo)準(zhǔn)濃度DNA比較法只能檢測(cè)抽提到的產(chǎn)物中的濃度，甚至由于抽提的質(zhì)粒DNA中含有RNA、蛋白質(zhì)、染色體DNA等因素的干擾,濃度檢測(cè)的數(shù)值也是沒有多少意義的。Q-10.對(duì)測(cè)序引物的要求有哪些？返回頂端A-10.對(duì)測(cè)序引物的一般要求：特異性與測(cè)序模板結(jié)合，不能有多于4個(gè)堿基以上的錯(cuò)配現(xiàn)象不能含有混合堿基長(zhǎng)度17~25堿基純度高，最好PAGE純化用ddH20溶解，不要用TE緩沖液溶解。Q-11.為什么測(cè)序引物必須特異地與DNA模板結(jié)合？返回頂端A-11.測(cè)序引物與待測(cè)樣品DNA分子只能有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是測(cè)序成功的關(guān)鍵。如果測(cè)序引物在DNA模板分子上有不只一個(gè)的結(jié)合位點(diǎn)，將造成測(cè)序反應(yīng)過程中引物鏈在幾個(gè)結(jié)合位點(diǎn)處同時(shí)擴(kuò)增，反映在測(cè)序峰圖上將出現(xiàn)雙峰或亂峰，無法讀取序列。Q-12.測(cè)序結(jié)果有很多套峰(出現(xiàn)很多N),還照常收費(fèi)，為什么？返回頂端A-12.DNA模板上出現(xiàn)二處以上的引物結(jié)合位點(diǎn)，或者DNA模板上有嚴(yán)重的重復(fù)序列，以及測(cè)序引物不純時(shí)，測(cè)序結(jié)果便會(huì)出現(xiàn)套峰現(xiàn)象(見圖4)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因由DNA模板本身或者引物本身所造成，對(duì)這些結(jié)果(公司保證進(jìn)行2次以上的測(cè)序工作)，公司會(huì)根據(jù)具體情況進(jìn)行收費(fèi)(詳細(xì)見測(cè)序結(jié)果說明)。Q-13.為什么用PCR產(chǎn)物測(cè)序時(shí)，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)套峰現(xiàn)象？返回頂端A-13.PCR產(chǎn)物測(cè)序出現(xiàn)套峰現(xiàn)象，一般有以下幾種原因：PCR用模板不純或PCR用引物特異性不好，擴(kuò)增出的產(chǎn)物除了目的片段外，還有與目的片段長(zhǎng)度相近的片段，即使用凝膠電泳也無法分離開，這樣的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果是套峰。結(jié)構(gòu)上的原因，造成了PCR產(chǎn)物測(cè)序出現(xiàn)套峰的現(xiàn)象。PolyA/G/C/T以及原因不明的復(fù)雜結(jié)構(gòu)的存在，都會(huì)出現(xiàn)測(cè)序結(jié)果套峰的情況。Q-14.出現(xiàn)套峰的原因是什么？返回頂端A-14.在測(cè)序反應(yīng)中，模板或引物的原因都可能造成套峰的形成，歸結(jié)其形成原因有以下幾點(diǎn)測(cè)序引物在模板上有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)形成套峰模板不純，如果是質(zhì)?；蚴蔷海蚴欠菃慰寺?，如果是PCR,原因?yàn)榉翘禺愋詶l帶模板序列的特殊結(jié)構(gòu)，如poly結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等引物降解，引物不純，或引物的特異性不好Q-15.測(cè)序結(jié)果不到800Bases，還照常收費(fèi)了，為什么？返回頂端A-15.如在DNA樣品中的DNA序列分布勻稱，沒有復(fù)雜結(jié)構(gòu)時(shí)，正常的測(cè)序反應(yīng)能保證達(dá)到800Bases以上。但有一些DNA樣品立體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，造成聚合酶延伸反應(yīng)終止，測(cè)序信號(hào)突然減弱或消失，或者測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)套峰現(xiàn)象。出現(xiàn)這些現(xiàn)象的原因由DNA模板本身所造成（公司保證進(jìn)行2次以上的測(cè)序工作）。對(duì)這些結(jié)果，公司會(huì)根據(jù)具體測(cè)序情況，進(jìn)行收費(fèi)（詳細(xì)見測(cè)序結(jié)果說明）。出現(xiàn)這些情況的原因分析如下：（1） G/Crich、G/CCluster：這種情況一般表現(xiàn)為測(cè)序信號(hào)突然減弱或消失（見圖1）；（2） A、T的連續(xù)結(jié)構(gòu)：這種情況一般表現(xiàn)為A、T連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)套峰（見圖2）。根據(jù)文獻(xiàn)記載，原因在于聚合酶進(jìn)行聚合反應(yīng)時(shí)，由于A或T的連續(xù)，聚合酶難以識(shí)別完整的每個(gè)A或T,在某個(gè)A或T的后面便開始進(jìn)行A或T連續(xù)結(jié)構(gòu)以后序列的聚合反應(yīng)（打滑現(xiàn)象），造成測(cè)序結(jié)果紊亂，出現(xiàn)套峰。出現(xiàn)這樣的情況，建議反向測(cè)序。一般在多少個(gè)A或T的后面能出現(xiàn)這種情況呢？現(xiàn)在還沒有這方面的報(bào)道。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，這一情況的出現(xiàn)和A或T的連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的序列的排列情況有著直接的關(guān)系。有時(shí)10多個(gè)A或T的連續(xù)結(jié)構(gòu)后面便出現(xiàn)套峰，但有時(shí)60?70個(gè)A或T的連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的序列也一樣可以完整地讀出來。具體情況還有待考證。一般來說，PCR片段直接測(cè)序時(shí)，A或T的連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的序列測(cè)序結(jié)果都會(huì)出現(xiàn)套峰。原因在于測(cè)序時(shí)經(jīng)歷了PCR反應(yīng)及測(cè)序反應(yīng)（測(cè)序反應(yīng)本身也是PCR反應(yīng)）二次聚合酶的打滑現(xiàn)象。（3） 原因不明的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)突然信號(hào)減弱或消失。從序列上看，DNA堿基排列并無特別異常。估計(jì)是DNA整體出現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)，從某一位置開始聚合酶的聚合反應(yīng)便無法進(jìn)行（見圖3）。查看大圖Q-16.為什么在測(cè)序報(bào)告上找不到引物序列？返回頂端A-16.這里分四種情況：（1） 的確找不到測(cè)序使用的引物序列。目前使用的測(cè)序方法是在ddNTP上做熒光標(biāo)記，測(cè)序儀通過檢測(cè)ddNTP上的熒光來讀取序列，因?yàn)橐锉旧硎遣蛔鰺晒鈽?biāo)記的，所測(cè)序列是從引物3'末端后第一個(gè)堿基開始的，所以在測(cè)序結(jié)果上找不到測(cè)序引物的序列。如果是PCR產(chǎn)物，要想得到PCR引物的序列，可以將PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙鏈測(cè)通或者將PCR產(chǎn)物克隆到載體上，用載體上的引物（注意此引物也不能離插入片段太近）測(cè)序（2） 找不到克隆片段的擴(kuò)增引物。原因可能是您在構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)采用的工具酶的酶切位點(diǎn)距離您的測(cè)序引物太近，由于熒光染料的干擾在序列開始的部分不會(huì)十分準(zhǔn)確（3） 還有一種可能是您的插入片段的插入方向是反的，這時(shí)您不妨找一下您引物的互補(bǔ)序列（4） 存在單引物擴(kuò)增，有一條引物的特異性不好，有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)導(dǎo)致只有一條引物參與擴(kuò)Q-17?在測(cè)序結(jié)果上，找不到測(cè)序用引物后面的序列，為什么？返回頂端A-17.由于測(cè)序儀自身缺陷，緊接引物之后的測(cè)序結(jié)果信號(hào)較弱，一般在測(cè)序用引物后面幾個(gè)至數(shù)十個(gè)（嚴(yán)重時(shí)40~50個(gè)）堿基會(huì)讀不出來（或者讀錯(cuò)），請(qǐng)引起注意。Q-18.怎樣使用擎科提供的測(cè)序報(bào)告？返回頂端A-18?在我們提供的測(cè)序報(bào)告中，有一份打印的（并用E-mail提供）DNA堿基排列順序的測(cè)序結(jié)果。這個(gè)結(jié)果是我們根據(jù)測(cè)序儀的自動(dòng)分析結(jié)果，并經(jīng)嚴(yán)格確認(rèn)后打?。ú⒂肊-mail提供）的測(cè)序結(jié)果。但測(cè)序儀有時(shí)會(huì)發(fā)生誤讀或漏讀現(xiàn)象，而我們的工作人員在檢查時(shí)也沒有發(fā)現(xiàn)，這時(shí)的打印結(jié)果（并用E-mail提供）會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤。只有原始的測(cè)序彩色波形圖才是最正確的，請(qǐng)客戶拿到結(jié)果后，進(jìn)行詳細(xì)確認(rèn)。如有不明白的地方，請(qǐng)立即和我們聯(lián)系，我們會(huì)及時(shí)確認(rèn)并進(jìn)行解決。Q-19.PCR片段直接測(cè)序和PCR片段經(jīng)克隆后測(cè)序的結(jié)果有何區(qū)別？返回頂端A-19?眾所周知，PCR擴(kuò)增過程中會(huì)出現(xiàn)很多錯(cuò)配現(xiàn)象，但不可能所有的錯(cuò)配都發(fā)生在同一位置。PCR片段直接測(cè)序時(shí)，其結(jié)果是PCR片段眾多分子的混合物的結(jié)果。如果在某一個(gè)點(diǎn)上出現(xiàn)了幾十次錯(cuò)配現(xiàn)象，但大多數(shù)分子（或許是幾十萬個(gè)分子）在這個(gè)點(diǎn)上應(yīng)該還是正確的，在測(cè)序時(shí)，錯(cuò)配現(xiàn)象也就反映不出來了。因此，PCR片段直接測(cè)序的結(jié)果反映的是PCR用模板最原始的結(jié)果。而PCR片段經(jīng)克隆后測(cè)序是測(cè)定了某一個(gè)分子的DNA序列。在幾十個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增過程中，很難保證某一個(gè)分子的任何點(diǎn)都不發(fā)生錯(cuò)配。因此，PCR片段經(jīng)克隆后的測(cè)序結(jié)果，往往存在著一些錯(cuò)配的序列，和PCR片段直接測(cè)序的結(jié)果相比有些堿基會(huì)有所不同。這種錯(cuò)配現(xiàn)象的多少取決于PCR擴(kuò)增時(shí)使用的DNA聚合酶的保真性能。要減少PCR擴(kuò)增過程中的錯(cuò)配現(xiàn)象，在PCR反應(yīng)時(shí)，請(qǐng)選用保真性能高的DNA聚合酶。Q-20.測(cè)序結(jié)果和文獻(xiàn)資料不一樣，為什么?返回頂端A-20.原因有很多，如同一種動(dòng)物，在不同的種族之間，或者不同的個(gè)體之間，基因序列也不一定完全一樣。如果是PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序，那還有PCR過程中的錯(cuò)配因素等等。我們提供的測(cè)序結(jié)果是客戶樣品序列的忠實(shí)結(jié)果，不能保證和文獻(xiàn)序列完全一致，請(qǐng)理解。Q-21.我的基因序列與標(biāo)準(zhǔn)序列為什么有差別？返回頂端A-21.—段基因序列經(jīng)擴(kuò)增后，克隆到載體中進(jìn)行測(cè)序。在兩個(gè)層次上可能導(dǎo)致序列發(fā)生變化。首先，在PCR擴(kuò)增過程中就可能產(chǎn)生錯(cuò)誤，將片段克隆到載體中也有可能發(fā)生突變；其次，測(cè)序的準(zhǔn)確率問題。ABI公司承諾其儀器的測(cè)序精度在一定范圍內(nèi)可以達(dá)到98.5%以上。由于儀器準(zhǔn)確率的限制，在一個(gè)較長(zhǎng)的序列中發(fā)生堿基序列錯(cuò)誤是難以避免的。在確認(rèn)克隆無誤的情況下，通過雙向測(cè)序可以最大限度減少測(cè)序的錯(cuò)誤。您如果想得到您的最準(zhǔn)確的序列，進(jìn)行雙向測(cè)序是很有必要的。只進(jìn)行簡(jiǎn)單的單向測(cè)序，我們無法保證所測(cè)序列的完全準(zhǔn)確性，這是由儀器的精度決定的。Q-22.DNA片段很長(zhǎng)，一個(gè)反應(yīng)讀不到頭，怎么辦？返回頂端A-22?如果DNA片段在載體上，可以用載體上兩端的引物同時(shí)測(cè)序，讓其中間交叉互補(bǔ)，便可完全測(cè)通。如果這樣還讀不通，可根據(jù)已經(jīng)測(cè)出的序列設(shè)計(jì)測(cè)序引物作進(jìn)一步測(cè)序（此稱為PrimerWalking法），便可完全測(cè)通。Q-23.測(cè)序完成后，測(cè)序樣品和引物將如何處理（或保存）?返回頂端A-23.客戶需要將測(cè)序樣品或引物（客戶自帶的）返還時(shí)，我們?cè)诎l(fā)送測(cè)序報(bào)告的同時(shí)，按客戶要求寄回樣品或引物（客戶自帶的）。2）對(duì)于沒返回的測(cè)序樣品和引物，公司負(fù)責(zé)保存二個(gè)月（從樣品收到之日算起），超過二個(gè)月還需測(cè)序的樣品，請(qǐng)客戶另行提供。Q-24.怎樣選擇（設(shè)計(jì)）測(cè)序用引物?返回頂端A-24.測(cè)序用引物要求非常嚴(yán)格，不同于PCR用引物。PCR用引物一般只要能和模板結(jié)合，3'端的幾個(gè)堿基能完全配對(duì)，即使引物長(zhǎng)達(dá)80~100多個(gè)堿基，只要調(diào)整PCR反應(yīng)條件，也能成功進(jìn)行PCR反應(yīng)。而測(cè)序用引物便不一樣了，必須嚴(yán)格符合以下要求。本公司的測(cè)序用引物全用引物設(shè)計(jì)軟件Olig。設(shè)計(jì)。在本公司測(cè)序時(shí)，我們可免費(fèi)幫助設(shè)計(jì)測(cè)序用引物。。?長(zhǎng)度在15~25個(gè)堿基左右，一般選擇20個(gè)堿基（根據(jù)GC含量作適當(dāng)調(diào)整），3'端盡量選擇G或C堿基（但不絕對(duì)），以增加與模板的結(jié)合能力。Tm溫度應(yīng)選擇50°C~70°C左右。GC含量應(yīng)選擇在50%左右，盡量避開A、T、G、C的連續(xù)結(jié)構(gòu)。?避開引物自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物二聚體結(jié)構(gòu)等復(fù)雜結(jié)構(gòu)。?保證引物和模板100%匹配，特別是3'端的幾個(gè)堿基一定要100%匹配。同時(shí)必須嚴(yán)格保證引物和模板之間只能有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。Q-25.覺得你給我的結(jié)果完全不是我需要的序列？返回頂端A-25.出現(xiàn)這樣的情況只有兩種可能：我們給您的測(cè)序結(jié)果對(duì)應(yīng)的不是您的樣品您的樣品插入部分與您預(yù)期的不一致。作為提供測(cè)序服務(wù)的一方，我們無法判斷測(cè)得的序列是否與您預(yù)期的結(jié)果一致，我們可以為您做的是，檢查發(fā)送給您的測(cè)序結(jié)果與您提供來的樣品是否一致。出現(xiàn)您這樣的問題，我們常規(guī)的做法是進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的方法是取您的原始菌液重新抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)如在可靠范圍內(nèi)結(jié)果與前次不同則說明我們前次的測(cè)序結(jié)果是有問題的，前次測(cè)序的費(fèi)用免除；如結(jié)果仍然相同，那么說明前次測(cè)序的結(jié)果準(zhǔn)確，則您還需要支付這一次測(cè)序的費(fèi)用。Q-26.我的樣品上有一個(gè)雜合位點(diǎn)，為什么在你們的報(bào)告上看不到雜合的信號(hào)？返回頂端A-26.在檢查報(bào)告時(shí)，設(shè)備和我們的技術(shù)員都傾向于提供給客戶一個(gè)單一的信號(hào)，所以在出現(xiàn)雜合的位置上給出的信號(hào)往往是比較強(qiáng)的一個(gè)信號(hào)。所以如果您的PCR樣品上是存在雜合位點(diǎn)的，請(qǐng)?jiān)跍y(cè)序訂單上注明，我們?cè)谛薷膱?bào)告時(shí)會(huì)加以注意。但如果在您預(yù)期出現(xiàn)雜合信號(hào)的位置上只有單一的信號(hào)，那么我們是不會(huì)人為將其修改為雜合位點(diǎn)的。出現(xiàn)這樣的情況可能是在您的樣品中雜合成份太少的信號(hào)強(qiáng)度不足以被檢查到，也許有其他更加靈敏的檢測(cè)手段可以滿足您的要求。Q-27.超過6Kb的DNA片斷如何進(jìn)行測(cè)序？返回頂端A-27.超過6Kb的DNA片斷用ShotGun進(jìn)行測(cè)序準(zhǔn)確并且節(jié)省時(shí)間，ShotGun方法如下：用物理方法打碎DNA回收1~1.5K的片斷用核酸酶切平端，連接入載體按照一定比例進(jìn)行測(cè)序，保證每一個(gè)區(qū)段有3倍以上的數(shù)據(jù)編輯所有測(cè)序數(shù)據(jù)如果有缺少數(shù)據(jù)的區(qū)域，還需要補(bǔ)充測(cè)序，拼接成完整序列Q-28.全自動(dòng)熒光測(cè)序的準(zhǔn)確性如何？返回頂端A-28.我們有兩種不同型號(hào)的測(cè)序儀：ABI377和ABI3730。ABI3730測(cè)序儀也是采用AB公司配套的BigDYETerminatorcyclesequencingKit其準(zhǔn)確性達(dá)到800堿基只有1個(gè)以下的錯(cuò)誤，并且該測(cè)序儀對(duì)堿基的判讀有一個(gè)自身的評(píng)判值(QualityValue)，根據(jù)QV值的大小，也可以幫助我們來判斷每一個(gè)堿基的準(zhǔn)確程度Q-29.用測(cè)序的方法檢測(cè)點(diǎn)突變可靠嗎？返回頂端A-29.有的客戶想用測(cè)序的方法檢測(cè)點(diǎn)突變體，我認(rèn)為該方法可靠性不高。主要有以下兩個(gè)原因。首先，我們并不清楚突變的序列與正常的序列的比例是多少。測(cè)序反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度直接與模板的量有關(guān)，如果突變的模板所占的比例很少，將直接作為背景噪音了，很難檢測(cè)出來。只有當(dāng)測(cè)序反應(yīng)體系中正常的和突變的模板量比較接近時(shí)，才能較可靠地檢測(cè)到突變體的存在。其次，在同一位置，不同堿基的信號(hào)強(qiáng)度一般是不一樣的。這樣即使突變的模板所占的比較較高時(shí)，也不一定能準(zhǔn)確檢測(cè)到突變的存在。另外，測(cè)序儀是設(shè)計(jì)用來測(cè)序正常的堿基序列的，軟件在對(duì)掃描的結(jié)果進(jìn)行處理時(shí)，會(huì)盡量提高主峰而將背景信號(hào)盡量壓低，以得到盡可能好的結(jié)果。因此，當(dāng)某處出現(xiàn)雙峰時(shí)，測(cè)序儀一般會(huì)認(rèn)為信號(hào)弱的峰為背景信號(hào)，在處理過程中，將弱的峰進(jìn)一步壓低，這樣不利于突變體的檢測(cè)。因此認(rèn)為，用測(cè)序的方法檢測(cè)突變體的存在不是一個(gè)好的方法。Q-30.我要求5'到3'正向測(cè)序，為什么你們給我的序列是反的？返回頂端A-30.您指的可能是插入片段的方向，而我們并不清楚您的樣品是如何構(gòu)建的。我們只能根據(jù)質(zhì)粒上的序列來確定測(cè)序方向，所以在測(cè)序引物一欄中請(qǐng)不要使用3'引物和5'引物這樣