畢四海畢業(yè)答辯

題目:恩施黑豬PTGFR基因SNP檢測及遺傳多態(tài)性分析

學生：畢四海指導老師：楊軍班級：動科31002班核心組成結果與分析小結與討論致謝材料與方法前言前言我們都知道，母豬有發(fā)情周期，其本質(zhì)是受下丘腦—垂體—卵巢軸系調(diào)控而產(chǎn)生的周而復始的生殖生理變化。

發(fā)情前期黃體進一步液化，卵泡開始發(fā)育；發(fā)情期卵泡發(fā)育成熟；發(fā)情后期成熟卵泡破裂、排卵，黃體開始形成；間情期黃體逐漸發(fā)育，并達到最大，孕激素分泌量也隨之逐漸達到最高水平，性中樞受到抑制。若是母豬未成功受孕，其子宮內(nèi)膜產(chǎn)生的前列腺素PGF2α通過逆流途徑促進黃體退化，使之進入下一個發(fā)情周期；反之若母豬妊娠,則轉化為妊娠黃體。這種暫時性的分泌器官分泌的孕酮是維持妊娠的主要激素。由于豬的胎盤不能分泌足夠的孕酮來維持妊娠，在此不再贅述。

主要激素的變化雌激素

妊娠早期,雌激素(Estrogen)主要來源于黃體。隨著妊娠期的增長,在母體產(chǎn)生的雌激素以及胎兒皮質(zhì)醇增加的影響下,胎盤產(chǎn)生的雌激素逐漸增加,分娩時達到最高峰。在分娩前,體內(nèi)雌激素的水平增高而孕酮濃度下降,導致孕酮與雌激素的比值發(fā)生變化,使子宮肌層對催產(chǎn)素的敏感性增高。妊娠期間雌激素可以調(diào)節(jié)孕酮的合成和分泌。分娩時,雌激素可能通過對孕酮的抑制作用、刺激催產(chǎn)素受體的發(fā)育、刺激前列腺素的合成和釋放增強子宮肌層的自發(fā)性收縮。孕酮在妊娠早期維持妊娠所需的孕酮來自于黃體。妊娠的中后期，孕酮主要作用有五個方面：促進子宮內(nèi)膜的基質(zhì)細胞蛻膜化；抑制雌激素和催產(chǎn)素等對子宮肌層的收縮作用,使子宮保持靜止,保證胎兒生活在一個平衡穩(wěn)定的環(huán)境中;抑制前列腺素的合成,保持子宮肌層處于靜止狀態(tài),抑制子宮節(jié)律收縮的起始；能夠抑制一些與免疫排斥相關的免疫反應；能夠抑制T細胞介導的組織感染,賦予著床的胚胎和發(fā)育的胎盤免疫能力。動物實驗證明,孕酮濃度的降低伴隨有PGF2α的分泌增多。孕酮濃度降低使抑制子宮肌層收縮的作用被解除。在家畜中,胎兒成熟時分泌的糖皮質(zhì)激素能夠刺激子宮分泌前列腺素,它可以順著子宮頸進入母體的腹腔溶解黃體。但是臨產(chǎn)前和分娩時孕婦的孕酮濃度反而高于妊娠的其他階段,這有可能是由于孕酮受體不同亞型表達比例發(fā)生變化,導致孕酮不能夠發(fā)揮作用。前列腺素哺乳動物卵泡顆粒細胞產(chǎn)生的前列腺素是排卵所必需的。通過對前列腺素合成的抑制可以阻止實驗動物和非人靈長類的自發(fā)排卵和誘發(fā)排卵。當內(nèi)源性的前列腺素合成受阻時,注射前列腺素能夠引發(fā)排卵。前列腺素是溶解黃體、刺激子宮肌收縮的重要物質(zhì)。子宮內(nèi)膜來源的PGF2α在流經(jīng)子宮靜脈時通過逆流循環(huán)到達卵巢，引起黃體的溶解（Mitchelletal，1995）。高水平的PGF2α引起黃體分泌催產(chǎn)素。另外前列腺素對子宮平滑肌有強烈的刺激作用,通過受體使肌肉收縮。敲除PGF2α受體基因的小鼠可以正常發(fā)育,但不能正常分娩。前列腺素合成酶I(Cycloxygenase-1,COX-1)基因敲除的小鼠不能正常分娩,可能是由于黃體的退化受阻造成的(Gibb,1998)。催產(chǎn)素催產(chǎn)素(Oxytixin,OXT)對分娩的發(fā)動起重要的但非分娩發(fā)動的啟動因子。將已妊娠綿羊或其他實驗動物的垂體切除,它們?nèi)匀豢梢园凑毡旧淼哪Ｊ椒置洹⑿∈蟮拇弋a(chǎn)素基因敲除,它仍然有正常的妊娠和分娩過程。分娩開始時血液中的OXT含量變化不大,當胎頭通過產(chǎn)道時或者多胎動物產(chǎn)出一仔后,引起反射性的緊張活動,其分泌量才相對增加。妊娠早期,子宮對大劑量催產(chǎn)素也不發(fā)生反應,它會受到催產(chǎn)素酶的降解,而到妊娠后期由于降解催產(chǎn)素酶的逐漸消失,僅用少量催產(chǎn)素即可引起子宮強烈收縮。實驗證明,妊娠末期子宮對催產(chǎn)素的敏感性可以增加20倍。臨產(chǎn)前孕酮分泌量下降,雌激素增多,可以激發(fā)催產(chǎn)素的分泌。它還能刺激前列腺素的合成,進一步增強子宮的收縮。

分娩的啟動并非單一因素所致,而是由機械擴張、神經(jīng)及激素等多種因素相互關系!彼此協(xié)調(diào)所促成。

促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素（CorticotropinReleasingHormone，CRH）可能決定分娩的起始，分娩啟動前母體的CRH水平達到最高水平。切除羊胎兒的下丘腦、垂體和腎上腺可以阻止分娩,使妊娠期延長。給切除垂體和

腎上腺的胎兒滴注促腎上腺皮質(zhì)激(AdrenocorticotrophicHormone,ACTH)或者地塞米松能誘發(fā)分娩,而且給妊娠末期的胎羔滴注合成的ACTH或者地塞米松也能誘發(fā)早產(chǎn)。

肺泡表面活性蛋白A(SurfactantProteinA,SP-A)在妊娠完成80%時胎肺開始表達,并在出生前達到最高峰。這有可能是皮質(zhì)醇促進胎肺的成熟,其分泌的SP-A進入羊水作為巨噬細胞活化和遷移的信號,確保發(fā)生炎癥反應導致分娩。有證據(jù)表明分娩前的起始與子宮內(nèi)的炎癥反應密切相關。胎膜未破的情況下發(fā)生的早產(chǎn)大約有30%在妊娠的末期有明顯的炎癥。妊娠期的QTL定位

QTL是在基因組中占據(jù)一定染色體區(qū)域,控制某一數(shù)量性狀的一組微效多基因的集合(或基因簇)。

通過基因組掃描的方法國外學者發(fā)現(xiàn)在1號、9號、15號染色體上可能存在控制妊娠期的QTL。但控制豬妊娠期的候選基因研究尚未見報道。根據(jù)雙直接熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)人的7、11號染色體與豬的9號染色體是部分同源的,而影響豬妊娠期的一段區(qū)域是和人的1號染色體的部分區(qū)域是同源的,我們從人的這部分區(qū)域?qū)ふ胰焉镞^程中有重要作用的基因Renin和IL-10,與豬妊娠期的相關關系進行研究。本研究的目的是檢測影響豬妊娠期長短的候選基因PTGFR（前列腺素F2α受體基因）的核酸多態(tài)性，并對其遺傳多態(tài)信息進行分析，為揭示豬的妊娠期的遺傳機理打下基礎。

材料：

40頭恩施黑豬來自長江大學動物科學學院實驗豬場，耳組織取樣。所采集的組織樣均放入70%的乙醇中，-20℃保存。

設備：Sigma常溫高速離心機、Sigma冷凍高速離心機、水平電泳槽、電泳儀、低溫恒溫水浴槽、超純水儀、梯度PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、海爾超低溫冰箱、海爾冰柜、pH計、紫外風光光度計、高壓滅菌鍋、制冰機、電子天平、電熱恒溫鼓風干燥箱、美的微波爐、超凈工作臺、分子雜交爐、可調(diào)式微量移液器

藥品和試劑：MTris-Cl（pH8.0)、0.5MEDTA（pH8.0）、100mMNaCl、50×TAE、5M乙酸鉀、6M氯化鋰、10%APS、EB染色液、10mg／ml蛋白酶K、TE緩沖液(pH8．O)、溴化乙錠（EB）、三羥甲基氨基甲烷（Tris），西班牙瓊脂糖（分裝）、10mMdNTPMix、PCR引物由上海捷瑞生物合成，用超純水配制成25pM/μl的工作液，-20℃保存、無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇、乙醚等常規(guī)試劑由長江大學動物科學學院動物基礎實驗室提供。

材料與方法方法：1、豬耳組織基因組DNA提取2、基因組DNA樣品濃度和純度檢測和稀釋3、PTGFR基因擴增引物設計與合成4、PTGFR基因擴增

試劑體積（μl）10×PCRBuffer2.5dNTPs1.0PrimerF0.25PrimerR0.25模板DNA1.0TaqⅠ0.5ddH2O17.5Totalvolume23.0PTGFR基因PCR反應體系

5、PCR-RFLP分析統(tǒng)計與分析：

基因型頻率（Genotypicfrequency）和等位基因頻率（Allelicfrequency）

遺傳特性分析試劑劑量倍數(shù)PCRreactionmixture10μl10×BufferBsuR1Nuclease-freewater2μl1μl18μl×52104μl52μl936μl酶切反應體系

1、恩施黑豬耳部組織基因組DNA提取結果：

從恩施黑豬耳部組織所提取的基因組DNA電泳條帶清晰，基本沒有彌散現(xiàn)象，且點樣孔較干凈。說明所提取的基因組DNA完整性好，且?guī)缀鯖]有多糖和蛋白質(zhì)的殘留，完全可以用于后續(xù)的PCR擴增和酶切反應。

結果與分析2、PTGFR基因PCR擴增結果：

所合成的引物對40個個體均擴增出了683bp大小片段，且無雜帶，可進行后續(xù)PCR-RFLP分析。

3、PTGFR基因PCR-RFLP酶切基因型檢測結果：PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和EB染色顯影后，檢測到3種基因型，條帶清晰可辨，兩種純合子分別命名為AA基因型和BB基因型，雜合子為AB基因型。4、恩施黑豬PTGFR基因群體遺傳學分析

4.1恩施黑豬PTGFR基因的基因型頻率和等位基因頻率：A、B兩等位基因頻率完全相等，各占50%。該恩施黑豬群體PTGFR基因位點處于Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)（P>0.05）?；蛐突蛐皖l率等位基因等位基因頻

率卡方值（概率）AA0.3778A0.5000AB0.24442.85（P=0.8750）BB0.3778B0.5000恩施黑豬PTGFR基因頻率和基因型頻率4.2

恩施黑豬PTGFR基因多態(tài)性分析結果：

等位基因數(shù)與有效等位基因數(shù)相等，雜合度0.2444，遺傳變異較低，多態(tài)性（PIC=0.3750）為中度多態(tài)。等位基因數(shù)（Na）有效等位基因數(shù)（Ne）雜合度（He）純合度（Ho）多態(tài)信息含量（PIC）22.00000.24440.75560.3750恩施黑豬PTGFR基因多態(tài)性分析前列腺素對于分娩有著極其重要的作用，PTGFR是前列腺素受體基因，PTGFR核酸序列的變異可能引起前列腺素在動物體內(nèi)的生物功能變化。恩施黑豬群體中AA、BB型個體相當，AB型個體相對較少，A、B等位基因頻