《微生物學》第四章微生物的生長與環(huán)境條件

第一節(jié)純培養(yǎng)微生物的群體生長一、獲得純培養(yǎng)的方法（一）稀釋分離法

1.稀釋平皿分離法

2.平皿劃線分離法

3.單細胞挑取法（二）選擇培養(yǎng)基第二節(jié)細菌群體生長的測量（一）細胞數(shù)量的測量（二）細胞生物量的測定第三節(jié)分批培養(yǎng)中細菌群體的生長第四節(jié)環(huán)境條件對微生物生長和代謝的影響第四章微生物的生長與環(huán)境條件生物個體由小到大的增長，即表現(xiàn)為細胞組分與結(jié)構(gòu)在量方面的增加生長指生物個體數(shù)目的增加繁殖從生長到繁殖，是生物的構(gòu)造和機能從簡單到復(fù)雜、從量變到質(zhì)變的發(fā)展變化過程，這一過程稱為發(fā)育。發(fā)育生長是一個逐步發(fā)生的量變過程，繁殖是一個產(chǎn)生新的生命個體的質(zhì)變過程。個體生長個體繁殖群體生長群體生長=個體生長+個體繁殖由于微生物的個體極小，所以常用群體生長來反映個體生長的狀況。個體生長微生物細胞個體吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進行新陳代謝，原生質(zhì)與細胞組分的增加。群體生長群體中個體數(shù)目的增加?？梢杂弥亓俊Ⅲw積、密度或濃度來衡量。細菌繁殖示意圖一、獲得微生物純培養(yǎng)的方法純培養(yǎng)的概念：微生物學中把從一個細胞或一群相同的細胞經(jīng)過培養(yǎng)繁殖而得到的后代。

第一節(jié)微生物純培養(yǎng)的生長基本步驟

方法稀釋平皿分離法平皿劃線分離法單細胞挑取法利用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)法分離培養(yǎng)傾注平皿分離法涂布平皿分離法連續(xù)劃線分離法分區(qū)劃線分離法1.稀釋平皿分離法1.稀釋平皿分離法90ml10g9ml9ml9ml9ml9ml9ml10/1001/10-210-710-610-510-410-31ml1ml1ml1ml1ml(1)稀釋(一)稀釋分離法1ml目的是得到高度稀釋的效果,使一支試管中分配不到一個微生物。如果經(jīng)過稀釋后的大多數(shù)試管中沒有微生物生長,那么有微生物生長的試管得到的培養(yǎng)物可能就是由一個微生物個體繁殖而來的純培養(yǎng)物。這種方法適合于細胞較大的微生物。(2)傾注平皿分離法(1)涂布平皿分離法操作較麻煩，對好氧菌、熱敏感菌效果不好！使用較多的常規(guī)方法，易造成機械損傷，但有時涂布不均勻！1.稀釋平皿分離法采用培養(yǎng)平板計數(shù)法要求操作熟練、準確，否則難以得到正確的結(jié)果：樣品充分混勻每支移液管及涂布棒只能接觸一個稀釋度的菌液同一稀釋度三個以上重復(fù),取平均值每個平板上的菌落數(shù)目合適，便于準確計數(shù)一個菌落可能是多個細胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成單位（colonyformingunits，CFU）來表示，而不是直接表示為細胞數(shù)。用接種環(huán)沾取少許待分離的材料,在無菌平板表面進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，微生物細胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增多而減少，并逐步分散開來，在平板表面可得到單菌落。2.平皿劃線分離法

(1).分區(qū)劃線分離法(2).連續(xù)劃線分離法特點：快速、方便。

適用于濃度較大的樣品適用于濃度較小的樣品每次把接種環(huán)上的菌燒掉使得新劃出的線的菌就是來自于上一次劃線的一個點，這樣可以達到逐漸稀釋的目的，劃到最后的就會長成單菌落。連續(xù)劃線劃線分離后平板上顯示的菌落照片3.單細胞挑取法接種針解剖鏡………....…操作難度與細胞或個體的大小成反比采用顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)的方法。該方法要在顯微鏡下進行。毛細管法：用毛細管提取微生物個體，適合于較大微生物。顯微操作儀：用顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個細胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。小液滴法：將經(jīng)過適當稀釋后的樣品制成小液滴，在顯微鏡下選取只含一個細胞的液滴來進行純培養(yǎng)物的分離。＊利用選擇培養(yǎng)基進行直接分離＊富集培養(yǎng)(二)選擇性培養(yǎng)基分離法各種微生物對不同的化學試劑、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用這些特性可配制合適某種微生物而限制其它微生物生長的選擇培養(yǎng)基，用它來培養(yǎng)微生物以獲得純培養(yǎng)。抑制大多數(shù)其它微生物的生長；使待分離的微生物生長更快；使待分離的微生物在群落中的數(shù)量上升，方便用稀釋法對其進行純化。使待分離的微生物生長“突出”；直接挑取待分離的微生物的菌落獲得純培養(yǎng)。1.利用選擇平板進行直接分離待分離的微生物生長，其它微生物的生長被抑制高溫下培養(yǎng)：分離嗜熱細菌；培養(yǎng)基中不含N：分離固氮菌；培養(yǎng)基加抗生素：分離抗性菌；1.利用選擇平板進行直接分離待分離的微生物的生長特征明顯不同于其它微生物顏色反應(yīng)：分離特定的菌株；牛奶平板：分離蛋白酶產(chǎn)生菌；2.富集培養(yǎng)從自然界中分離到所需的特定微生物特定的環(huán)境條件僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長待分離微生物在群落中的數(shù)量大大增加微生物純培養(yǎng)分離方法的比較分離方法應(yīng)用范圍平皿劃線法方法簡便，多用于分離細菌稀釋平皿法即可定性，又可定量，用途廣泛單細胞挑取法局限于高度專業(yè)化的科學研究利用選擇培養(yǎng)基法適用于分離某些生理類型較特殊的1.總細胞計數(shù)法比濁法血球計數(shù)板法2.活菌計數(shù)法涂布平板法濾膜法（一）細胞數(shù)量的測量第二節(jié)細菌群體生長的測量利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。缺點：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數(shù)；需要相對高的細菌濃度；

（一）細胞數(shù)量的測量1.細胞總數(shù)量（1）顯微鏡測數(shù)法特點：快速，準確。適用范圍：個體較大細胞或顆粒1mm大方格中小大方格：高0.1mm

已知：1mL體積=10mm×10mm×10mm=1000mm3

所以：1mL

體積應(yīng)含有小方格數(shù)為1000mm3/1/4000mm3=4×106

個小方格，即系數(shù)K=4×106

將1mm2×0.1mm的薄層空間劃分為400小格，從中均勻分布地選取80或100小格，計數(shù)其中的細胞數(shù)目，換算成單位體積中的細胞數(shù)。原理：（1）16×25規(guī)格的計數(shù)板計數(shù)方法：（2）25×16規(guī)格的計數(shù)板細胞數(shù)/1mL＝80個小方格細胞總數(shù)80

×4×106×稀釋倍數(shù)細胞數(shù)/1mL＝100個小方格細胞總數(shù)100

×4×106×稀釋倍數(shù)（一）細胞數(shù)量的測量（2）比濁計數(shù)法原理是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數(shù)越多，光密度越大。因此，借助于分光光度計，在一定波長下（450-650nm）測定菌懸液的光密度，就可反應(yīng)出菌液的濃度。紫外分光光度計特點：快速、簡便；但易受干擾。2.活菌數(shù)測量（1）稀釋平皿計數(shù)法----最常用的活菌計數(shù)法。將適當稀釋的菌液傾注平板或涂布在平板表面，經(jīng)保溫培養(yǎng)后，以平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以稀釋度就可以計算出原菌液的含菌量。

優(yōu)點：傳統(tǒng)計數(shù)方法，對設(shè)備要求不高。10-310-510-410-6使微生物在固體培養(yǎng)基平板上形成單個菌落的基本方法：稀釋！直徑9cm的培養(yǎng)皿平板上出現(xiàn)菌落數(shù)一般以30~300為宜每皿菌落平均數(shù)×1/取樣體積數(shù)×稀釋倍數(shù)每毫升樣品中微生物細胞數(shù)=又叫濃縮法，常用該法測定含菌量較少的空氣和水中的微生物數(shù)目。將定量的樣品通過薄膜（硝化纖維素薄膜、醋酸纖維薄膜）過濾，菌體被阻留在濾膜上，取下濾膜進行培養(yǎng)，然后計算菌落數(shù)，可求出樣品中所含菌數(shù)。2）薄膜過濾計數(shù)法1.濕重法：將微生物培養(yǎng)液離心，收集細胞沉淀物，然后稱重。2.干重法：離心得到的細胞沉淀物置100~105℃的烘箱中干燥過夜至除去水分，然后稱重。3.含氮量測定法：一般微生物細胞的含氮量比較穩(wěn)定，可以用凱氏定氮法等測其總量，再乘以系數(shù)6.25即為粗蛋白含量，蛋白含量越高，說明菌體數(shù)和細胞物質(zhì)量越高。4.DNA含量測定法：微生物細胞的DNA含量比較穩(wěn)定，采用適當?shù)臒晒庵甘緞┡c菌體DNA作用，熒光比色或分光光度計法測DNA含量。5.其它生理指標：如測定碳、磷、RNA、ATP、DAP的含量。（二）細胞生物量測量微生物生長測定方法比較測定細胞數(shù)目方法特點與應(yīng)用總細胞數(shù)血球計數(shù)板法較快速簡便，但較費時活細胞數(shù)平皿菌落計數(shù)法簡易價廉，但花費時間較長，不能立刻知道結(jié)果薄膜過濾法快速簡便，適于含菌數(shù)很低的空氣、水等中的總菌計數(shù)測定物質(zhì)量細胞濕重法較為簡便，但含水量不定，準確度差細胞成分含量法如測定蛋白質(zhì)、核酸、還原糖的含量等細胞干重法較為費時，易受顆粒雜質(zhì)干擾，敏感度低比濁法快速、簡便，但易受干擾一、分批培養(yǎng)的概念采用完全封閉的容器，一次接種，靜置培養(yǎng)，最后一次性收獲的過程。特點：固定的營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)果：細菌在一個容積有限的環(huán)境中不可能無限制地高速生長。分批培養(yǎng)中細菌的生長在短期內(nèi)表現(xiàn)明顯的規(guī)律性--細菌的生長曲線第三節(jié)分批培養(yǎng)中細菌群體的生長將少量單細胞的純培養(yǎng)，接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，每隔一定時間取樣，測菌細胞數(shù)目。以培養(yǎng)時間為橫坐標，以細菌增長數(shù)目的對數(shù)為縱坐標，繪制所得的曲線。生長曲線的制作緩慢期

對數(shù)期

穩(wěn)定期

衰亡期二、細菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律☆生長曲線代表了細菌在新的環(huán)境中從開始生長、分裂直至死亡的整個動態(tài)變化過程?！蠲糠N細菌都有各自的典型生長曲線，但它們的生長過程卻有著共同的規(guī)律性。一般可以將生長曲線劃分為四個時期。1.緩慢期（延遲期、停滯期、調(diào)整期、適應(yīng)期）滯留適應(yīng)期二、細菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律特點：分裂遲緩

代謝活躍產(chǎn)生原因：（2）細胞分裂必需因子的缺乏（1）接種時的機械損傷引將少量菌種接入新鮮培養(yǎng)基后，在開始一段時間內(nèi)菌數(shù)不立即增加，或增加很少，生長速度接近于零?；罹鷶?shù)沒增加，曲線平行于橫軸。◆菌種：繁殖速度較快的菌種的延遲期一般較短；◆接種物菌齡：用對數(shù)生長期的菌種接種時，其延遲期較短，甚至檢查不到延遲期；◆接種量：一般來說，接種量增大可縮短甚至消除延遲期（發(fā)酵工業(yè)上一般采用1/10的接種量）；◆培養(yǎng)基成分：在營養(yǎng)成分豐富的天然培養(yǎng)基上生長的延滯期比在合成培養(yǎng)基上生長時短；發(fā)酵工業(yè)上盡量使發(fā)酵培養(yǎng)基的成分與種子培養(yǎng)基接近?！镉绊懷舆t期長短的因素：認識延遲期的特點及形成原因?qū)嵺`的指導(dǎo)意義：◆在發(fā)酵工業(yè)上需設(shè)法盡量縮短延遲期；采取的措施有：①增加接種量；（群體優(yōu)勢----適應(yīng)性增強）②采用對數(shù)生長期的健壯菌種；③調(diào)整培養(yǎng)基的成分，在種子基中加入發(fā)酵培養(yǎng)基的某些成分。④選用繁殖快的菌種◆在食品工業(yè)上，盡量在此期進行消毒或滅菌2.對數(shù)期（指數(shù)生長期）對數(shù)生長期二、細菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律細菌數(shù)目以幾何級數(shù)增加，在生長曲線上，表現(xiàn)為一條上升的直線。特點：生長速率常數(shù)最大，即代時最短;細胞進行平衡生長，菌體大小、形態(tài)、生理特征等比較一致;代謝最旺盛;細胞對理化因素較敏感。①由于此時期的菌種比較健壯，生產(chǎn)上用作接種的最佳菌齡；②發(fā)酵工業(yè)上盡量延長該期，以達到較高的菌體密度;③食品工業(yè)上盡量使有害微生物不能進入此期;④是生理代謝及遺傳研究或進行染色、形態(tài)觀察等的良好材料。應(yīng)用意義：對數(shù)生長期Nt=2nN0n=3.33(lgNt-lgN0)G=t/n=0.301t/(lgNt-lgN0)

n——繁殖代數(shù)

G——世代時(每繁殖一代所需的時間)N0——對數(shù)生長期開始微生物數(shù)量

Nt——對數(shù)生長期經(jīng)過時間t后微生物數(shù)量例如：在一細菌培養(yǎng)液中第一次測得的細菌數(shù)為104/ml,經(jīng)過培養(yǎng)4h后，又測得菌液中的細菌數(shù)為108/ml，求此菌的世代時間G和在此時間內(nèi)繁殖的代數(shù)n。

根據(jù)公式：G=(t2-t1)/3.3·lg(x2/x1) t2-t1=(4-0)×60min=240min x2=108x1=104 lg(x2/x1)=lg108-lg104=8-4=4

代入上式G=240/(3.3×4)=240/13.2=18min

細菌繁殖代數(shù)n=(t2-t1)/G=240/18=13.3繁代★代時能夠反應(yīng)細菌的生長速率，代時短，生長速率快，代時長，生長速率慢?！锎鷷r在不同種微生物中的變化很大，多數(shù)微生物的代時為1~3h。同一種微生物，在不同的生長條件下其代時的長短也不同。在一定條件下，每一種微生物的代時是恒定的，因此它是微生物菌種的一個重要特征?！镉绊懼笖?shù)期代時長短的因素：◆菌種:不同菌種其代時相差很大；◆培養(yǎng)基成分:在營養(yǎng)成分豐富的天然培養(yǎng)基上生長的代時比在合成培養(yǎng)基上生長時短；◆營養(yǎng)物濃度:影響生長速率和總生長量◆培養(yǎng)溫度:影響極大E.Coli在不同溫度下的代時溫度（℃） 代時（分） 溫度（℃） 代時（分）10

860 35 2215 120 37 1720 90 40 17.525 40 45 2030 29 47.577培養(yǎng)溫度對代時的影響3.穩(wěn)定期（最高生長量期）最高生長量期細菌數(shù)量增加率為0的原因?二、細菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律特點：①新增殖的細胞數(shù)與老細胞的死亡數(shù)幾乎相等，微生物的生長速率處于動態(tài)平衡，培養(yǎng)物中的細胞數(shù)目達到最高值。②細胞分裂速度下降，開始積累內(nèi)含物，產(chǎn)芽孢的細菌開始產(chǎn)芽孢。③此時期的微生物開始合成次生代謝產(chǎn)物，對于發(fā)酵生產(chǎn)來說，一般在穩(wěn)定期的后期產(chǎn)物積累達到高峰，是最佳的收獲時期。由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗，代謝產(chǎn)物積累和pH等環(huán)境變化，逐步不適宜于細菌生長，導(dǎo)致生長速率降低直至零(即細菌分裂增加的數(shù)量等于細菌死亡數(shù)量)，結(jié)束對數(shù)生長期，進入穩(wěn)定生長期。原因：獲得更多的菌體物質(zhì)或代謝產(chǎn)物采取措施：補充營養(yǎng)物質(zhì)或取走代謝產(chǎn)物或改善培養(yǎng)條件，如對好氧菌進行通氣、攪拌或振蕩等。4.衰亡期衰亡期二、細菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律產(chǎn)生原因：

生長條件的進一步惡化，使細胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體的死亡。特點：①細胞死亡數(shù)增加，死亡數(shù)大大超過新增殖的細胞數(shù)，群體中的活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)“負生長”。②細胞內(nèi)顆粒更明顯，細胞出現(xiàn)多形態(tài)、畸形或衰退形，芽孢開始釋放。③因菌體本身產(chǎn)生的酶及代謝產(chǎn)物的作用，使菌體死亡、自溶等，發(fā)生自溶的菌生長曲線表現(xiàn)為向下跌落的趨勢。什么時期菌體代謝產(chǎn)物最多什么時期細菌細胞代謝活性最強什么時候細菌細胞總數(shù)最多什么時期細菌細胞生長速度最快什么時期世代時間短而穩(wěn)定最高生長量最高生長量對數(shù)生長期對數(shù)生長期小結(jié)二、細菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律1.連續(xù)培養(yǎng)

優(yōu)點：一定生理狀態(tài)實驗材料，提高工業(yè)生產(chǎn)效益。第三節(jié)分批培養(yǎng)中細菌群體的生長在一定恒定的容積的流動系統(tǒng)中培養(yǎng)微生物，一方面以一定速率不斷地加入新的培養(yǎng)基，另一方面又以相同的速率流出培養(yǎng)物（菌體和代謝產(chǎn)物），以使培養(yǎng)系統(tǒng)中的細胞數(shù)量和營養(yǎng)狀態(tài)保持恒定。三、連續(xù)培養(yǎng)與微生物的生長2.連續(xù)培養(yǎng)類型連續(xù)培養(yǎng)類型恒濁連續(xù)培養(yǎng)恒化連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)的基本原則：微生物培養(yǎng)過程中不斷的補充營養(yǎng)物質(zhì)和以同樣的速率移出培養(yǎng)物。(一)恒化連續(xù)培養(yǎng)恒定流速，及時補充營養(yǎng),營養(yǎng)物濃度基本恒定,從而保持恒定生長速率。生長速率的控制因子：一般是氨基酸、氨和銨鹽等氮源，或是葡萄糖、麥芽糖等碳源或者是無機鹽，生長因子等物質(zhì)。通常用于實驗室的科研工作，尤其適用于與生長速率相關(guān)的各種理論研究。2023/2/350(二)恒濁連續(xù)培養(yǎng)通過連續(xù)培養(yǎng)裝置中的光電系統(tǒng)控制培養(yǎng)液中菌體濃度恒定、使細菌生長連續(xù)進行的一種培養(yǎng)方式。用于獲得大量菌體以及與菌體生長平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的發(fā)酵工業(yè)中。恒濁器與恒化器的比較裝置控制對象培養(yǎng)基培養(yǎng)基流速生長速率產(chǎn)物應(yīng)用范圍恒濁器菌體密度（內(nèi)控制）無限制生長因子不恒定最高大量菌體或與菌體形成相平行的產(chǎn)物生產(chǎn)為主恒化器培養(yǎng)基流速（外控制）有限制生長因子恒定低于最高不同生長速率的菌體實驗室為主同步培養(yǎng)：是一種培養(yǎng)方法，它能使群體中不同步的細胞轉(zhuǎn)變成能同時進行生長或分裂的群體細胞。同步生長：以同步培養(yǎng)方法使群體細胞能處于同一生長階段，并同時進行分裂的生長方式。同步培養(yǎng)物常被用來研究在單個細胞上難以研究的生理與遺傳特性和作為工業(yè)發(fā)酵的種子，它是一種理想的材料。四、同步培養(yǎng)同步培養(yǎng)方法機械方法環(huán)境條件控制技術(shù)離心方法過濾分離法硝酸纖維素濾膜法控制溫度控制培養(yǎng)基成分光照和黑暗交替培養(yǎng)硝酸纖維素薄膜法步驟：將非同步的細菌液體培養(yǎng)物通過微孔濾膜，讓細胞吸附于其上；然后將濾膜反置，再以新鮮培養(yǎng)液濾過。這時，一些未粘牢的細胞先被沖洗掉，接著脫落到培養(yǎng)液中的都是那些新分裂形成的細胞，于是就獲得了同步生長。

同步培養(yǎng)生長曲線特點:群體生長是一次性跳躍過程表明群體細胞大部分是在基本相同的時間進行分裂一、溫度濕熱滅菌：121OC30min

干熱滅菌：160~170OC1~2h

為什么？

二、水分及其可給性三、氫離子濃度（pH）四、氧氣和氧化還原電位五、輻射六、化學殺菌劑

熱蒸汽的穿透力較熱空氣強，且蛋白質(zhì)含水量越高，越易于凝固第四節(jié)環(huán)境條件對微生物生長和代謝的影響一、溫度二、水和滲透壓三、酸堿度四、氧和氧化還原電位五、輻射六、化學殺菌劑和抑菌劑第四節(jié)環(huán)境條件對微生物生長和代謝的影響一、溫度1.溫度對微生物生長的影響微生物的生長溫度類型低溫型中溫型高溫型溫度對微生物生長的影響高溫：蛋白質(zhì)變性、酶失活、核糖體解體

低溫：酶活性下降、新陳代謝緩慢微生物的生長溫度三基點最低生長溫度最高生長溫度最適生長溫度2.高溫滅菌——是最常用的物理消毒方法★干熱滅菌法（dryheatsterilization）干燥熱空氣滅菌法：將物品放入烘箱內(nèi)，然后升溫至150℃～170℃，維持1～2小時。適用于玻璃、陶瓷和金屬物品的滅菌，不適合液體樣品，及棉花、紙張、纖維和橡膠類物質(zhì)的滅菌。由于空氣傳熱穿透力差，菌體在脫水狀態(tài)下不易殺死，所以溫度高、時間長。灼燒法（incineration）：將被滅菌物品在火焰中灼燒，使所有的生物質(zhì)碳化。適用于不怕燒的實驗器具，如接種環(huán)、鑷子、試管或三角瓶口的滅菌等?！餄駸岱?moistheatsterilization)

：特點：溫度低、時間短、滅菌效果高原因：

1)菌體內(nèi)含水量越高，則凝固溫度越低；

2)蒸汽冷凝會放出潛熱；

3)飽和水蒸汽穿透力強；

4)易破壞細胞內(nèi)蛋白質(zhì)大分子的穩(wěn)定性，如氫鍵結(jié)構(gòu)。濕熱滅菌濕熱比干熱滅菌更好：濕熱對一般營養(yǎng)體和孢子的殺滅條件：多數(shù)細菌和真菌的營養(yǎng)細胞：在60℃左右處理5-10min；酵母菌和真菌的孢子：用80℃以上溫度處理；細菌的芽孢：121℃處理15min以上；1)有水，蛋白質(zhì)易凝固2)熱蒸汽的穿透力強3)蒸汽有潛熱存在高壓蒸汽滅菌法：利用水的沸點隨水蒸氣壓力的增加而上升，以達到100℃以上高溫滅菌的方法。方法：121℃（1kg/cm2或15磅/英寸2）維持15~20min。

112℃（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）20~30min。

115℃（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）20~30min。應(yīng)根據(jù)滅菌物品的性質(zhì)或成分選擇滅菌溫度例如：生理鹽水、營養(yǎng)瓊脂等培養(yǎng)基用121℃。

含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培養(yǎng)基用112℃。適用：耐高溫物品，玻璃儀器、含水或不含水的物品。高壓蒸汽滅菌鍋注意事項：排凈冷空氣；滅菌終了，緩慢降壓；滅菌結(jié)束，趁熱取出物品。煮沸消毒法將水加熱至100℃，煮沸15min~30min，可殺死所有營養(yǎng)細胞和部分芽孢，達到消毒物的目的。巴斯德消毒法（Pasteurization）：

用較低的溫度來殺死其中的病源微生物，這樣既保持食品的營養(yǎng)風味，又進行了消毒。該法一般是將待消毒的液體食品置于62℃處理30min，然后迅速冷卻。即可達到消毒目的。低溫長時法：62.9℃30min處理牛奶；高溫瞬時法：71.6℃15s處理牛奶；超高溫巴斯德滅菌法：讓液體食品停留在140℃左右3-4s，急劇冷卻至75℃，經(jīng)勻質(zhì)化后冷卻至20℃。間歇滅菌法：

將待滅菌物品在80-100℃蒸煮15～60min，冷卻后擱置室溫（28～37℃）下過夜，并重復(fù)以上過程三遍以上。其蒸煮過程可殺死微生物的營養(yǎng)體，但不能殺死芽胞，室溫過夜促使殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體，再經(jīng)蒸煮過程可殺死新的營養(yǎng)體；循環(huán)三次以上可保證徹底滅菌的目的。

適用于不耐高溫的物品滅菌，如不適于高壓滅菌的特殊培養(yǎng)基、藥品的滅菌。缺點是麻煩、費時。高溫對培養(yǎng)基的影響及其防止措施高溫對培養(yǎng)基的不利影響：形成沉淀物（有機沉淀物如多肽類，無機沉淀物如磷酸鹽）；破壞營養(yǎng)；提高色澤（褐變?nèi)绠a(chǎn)生氨基糖等）；改變培養(yǎng)基的pH值；降低培養(yǎng)基的濃度消除有害影響的措施

采用特殊的加熱滅菌法過濾除菌法加入螯合劑

3.低溫保藏當環(huán)境溫度低于微生物的最適生長溫度時，微生物的生長繁殖停止，當微生物的原生質(zhì)結(jié)構(gòu)并未破壞時，不會很快造成死亡并能在較長時間內(nèi)保持活力，當溫度提高時，可以恢復(fù)正常的生命活動。低溫保藏菌種就是利用這個原理。一些細菌、酵母菌和霉菌的瓊脂斜面菌種通常可以長時間地保藏在4℃的冰箱中。

凍結(jié)速度對冰晶形成有很大影響，緩慢凍結(jié)，形成的冰晶大，對細胞損傷大；快速凍結(jié)，形成的冰晶小、分布均勻，對細胞的損傷小，因此，利用快速凍結(jié)可以對一些菌種進行凍結(jié)保藏，一般情況下在菌懸液中再加一些甘油、糖、牛奶、保護劑等可對菌種進行長期保藏。冷凍法也可用作菌種保藏，但所需溫度更低，如-80℃低溫冰箱、或-78℃干冰、或-80℃液氮中冷凍保存。二、水分及其可給性1.水活度(αw)是指在相同溫度下，溶液或物質(zhì)表面空氣的蒸汽壓與純水的蒸汽壓之比。是一種反映環(huán)境中水對微生物生長可給性高低的指標。αw=Ps/Pw微生物不同，生長所需最適aw不同；若aw過低或過高，會影響培養(yǎng)基的滲透壓，從而影響微生物的生長速率。2、水分對微生物生長的影響：細菌最適水的活度值：0.93-0.99

酵母菌最適水的活度值：0.88-0.91

霉菌最適水的活度值：0.80應(yīng)用：干燥法保存物品食品的冷凍干燥水的活度小于0.60-0.70時，休眠、部分出現(xiàn)細胞脫水、蛋白質(zhì)變性(多數(shù)微生物)三、酸堿度（pH值）大多數(shù)細菌：pH6.5~7.5放線菌：微堿性真菌：偏酸微生物生長過程中機體內(nèi)發(fā)生的絕大多數(shù)的反應(yīng)都是酶促反應(yīng)，而酶促反應(yīng)都有一個最適pH范圍，在此范圍內(nèi)只要條件適合，酶促反應(yīng)速率最高，微生物生長速率最大，因此微生物生長也有一個最適生長的pH范圍。微生物最適pH:注意：同種微生物在不同生長階段和不同生理生化過程，都有不同最適pH值pH值不僅對微生物細胞生長有直接影響外，還可影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物的離子化程度，從而影響對營養(yǎng)物的吸收、影響環(huán)境有害物對微生物的毒害以及代謝中各種酶的活力。三、酸堿度發(fā)酵生產(chǎn)中應(yīng)盡量控制和調(diào)整pH在最適范圍，調(diào)節(jié)方法包括治標和治本兩方面：微生物與氧氣的關(guān)系好氧菌厭氧菌專性好氧菌：需氧，通過呼吸產(chǎn)能兼性厭氧菌微好氧菌：需在微量氧下生活耐氧菌：不需氧，只以發(fā)酵產(chǎn)能，氧無毒害（專性）厭氧菌：氧有害或致死，以發(fā)酵或無氧呼吸產(chǎn)能以呼吸為主，兼營發(fā)酵產(chǎn)能以呼吸為主，兼營厭氧呼吸產(chǎn)能四、氧氣和氧化還原電位(一)氧與微生物的生長四、氧和氧化還原電位(一)氧與微生物的生長大多數(shù)細菌、幾乎所有放線菌、藍細菌、絲狀真菌等許多細菌、酵母菌、病原微生物一些乳酸菌(如嗜鹽片球菌)梭狀芽孢桿菌雙歧桿菌屬的某些種專性好氧菌微好氧菌兼性厭氧菌耐氧菌厭氧菌超氧化物歧化酶過氧化氫酶嚴格厭氧微生物并不是被氣態(tài)的氧所殺死，而是由于不能解除某些氧代謝產(chǎn)物的毒性而死亡。在氧還原為水的過程中，可形成某些有毒的中間產(chǎn)物，例如，過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O2-）等。超氧陰離子為活性氧，兼有分子和離子的性質(zhì)，反應(yīng)力極強，極不穩(wěn)定，可破壞膜和重要生物大分子，對微生物造成毒害或致死。好氧微生物具有降解這些產(chǎn)物的酶，如過氧化氫酶、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）等。而嚴格厭氧菌缺乏SOD，故易被生物體內(nèi)極易產(chǎn)生的超氧陰離子自由基毒害致死。厭氧菌的氧毒害機制——SOD學說厭氧菌的氧毒害機制：超氧化物歧化酶(SOD)學說O2+e-超氧陰離子自由基O2.-的去除2O2.-+2H+有奇數(shù)電子，帶負電荷；在細胞內(nèi)破壞生物大分子和膜的結(jié)構(gòu)。好氧菌和耐氧菌超氧陰離子自由基O2.-的形成O2.-O2+H2O2SOD1/2O2+H2OCatalase耐氧菌POD2H2O好氧生物大寶SOD蜜，內(nèi)含豐富的SOD活性物質(zhì)，能祛除色素、黑斑、消除皺紋、延緩衰老。全家適用，四季皆宜。SOD（超氧化物歧化酶）是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。對人體不斷地補充SOD，具有抗衰老的特殊效果。“要想皮膚好，早晚用大寶”四、氧和氧化還原電位(Eh)(二)氧化還原電位(Eh)與微生物的生長Eh值與“O2含量及是否存在氧化還原物質(zhì)有關(guān)”通常環(huán)境中的Eh值在+800mV與-450mV之間。在培養(yǎng)基中加入還原劑來降低Eh值，滿足厭氧微生物的生長。五、輻射

輻射：能量通過空間傳遞的一種物理現(xiàn)象。1、可見光：（400nm-800nm）

對微生物的作用：光氧化作用：有氧條件下，光線被細胞內(nèi)色素吸收，使酶或其它敏感成分失活引起的微生物死亡。（3）光氧化作用（1）能源（2）刺激擔子菌子實體形成2、紫外線(UV):使DNA分子中相鄰的嘧啶形成嘧啶二聚體，抑制DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄等功能，殺死微生物。殺菌波長范圍：240-300nm殺菌力最強范圍：255-265nm五、輻射紫外線殺菌特點：穿透力弱，用作表面消毒或空氣滅菌3、電離輻射五、輻射電離輻射對微生物的作用：

糧食、果蔬、畜禽產(chǎn)品、飲料以及衛(wèi)生材料殺菌處理低劑量(500倫琴)：促進生長、誘發(fā)變異高劑量（10萬倫琴）：殺菌作用實際應(yīng)用：（X射線、γ射線等）使其他物質(zhì)氧化或產(chǎn)生自由基破壞和改變生物大分子的結(jié)構(gòu)，以抑制或殺死微生物。六、化學殺菌劑和抑菌劑1、重金屬鹽類

殺菌機理：殺菌機理：與帶陰電荷的菌體蛋白質(zhì)結(jié)合使其變性，從而達到殺菌的目的。（Hg、Ag鹽，與細菌酶蛋白的巰基結(jié)合）2、有機化合物（酚、醇、醛）蛋白質(zhì)變性損傷細胞壁和膜抑制酶系統(tǒng)(脫氫酶、氧化酶等)；六、化學藥物殺菌機理：使蛋白質(zhì)巰基氧化(成二硫基)產(chǎn)生殺菌效果2R—SH+2X

R—S—S—R+2XH

殺菌機理：

漂白粉[Ca(OCl)2]及氯氣：產(chǎn)生次氯酸和原子氧，有強烈氧化作用，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，殺死微生物。3、氧化劑（高錳酸鉀、過氧化氫、過氧乙酸）4、鹵素（Cl、I常見）

具有降低表面張力效應(yīng)的物質(zhì)。六、化學藥物直接干擾病原微生物的生長繁殖并用于治療感染性疾病的化學藥物。（選擇性的殺菌或抑菌）5、表面活性劑（新潔爾滅、消毒寧等）殺菌機理：影響細胞生長、分裂6、化學治療劑

抑制葉酸合成如：磺胺類藥物等。殺菌機理：抑制蛋白質(zhì)合成如：鏈霉素，紅霉素、四環(huán)素、氯霉素等抑制肽聚糖合成如：青霉素，萬古霉素等。重點：1、微生物生長的特點2、微生物群體生長的測量(數(shù)量和生物量的測量)3、細菌群體的生長曲線及意義4、環(huán)境因子對微生物生長的影響本章小結(jié)：小結(jié)1.比較和和解釋下列各組名詞：同步培養(yǎng)和非同步培養(yǎng)，分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)，個體生長和群體生長，滅菌，消毒和防腐，抗生素，生物藥物素。2.什么是純培養(yǎng)？什么是混菌培養(yǎng)？純培養(yǎng)如何獲得？3.測定細菌數(shù)量及生物量的方法有哪些？原理是什么？使用范圍及優(yōu)缺點是什么？4.什么是細菌群體的典型生長曲線？分為哪幾個期？各個期的特點是什么？認識這四個期有何實踐意義