第三章動(dòng)物細(xì)胞工程制藥

動(dòng)物細(xì)胞工程制藥第三章生物技術(shù)制藥第一節(jié)概述細(xì)胞學(xué)說的建立組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程學(xué)第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)

和生理特點(diǎn)

一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)適應(yīng)功能,形態(tài)各異。離體培養(yǎng)細(xì)胞分兩類：貼壁細(xì)胞懸浮細(xì)胞⒈貼壁細(xì)胞

生長須有貼附的支持物表面，自身分泌或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長。兩種形態(tài)：成纖維細(xì)胞型上皮細(xì)胞型⒉懸浮細(xì)胞生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長。如淋巴細(xì)胞。⒊兼性貼壁細(xì)胞生長不嚴(yán)格依賴支持物。如中國地鼠卵巢細(xì)胞，小鼠L929細(xì)胞。二、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)⒈細(xì)胞的分裂周期長細(xì)胞分裂時(shí)間為12～48h，細(xì)胞的分裂周期=間期+分裂期間期（G1+S+G2）分裂期（M）G1期：4～6h合成DNA聚合酶

RNA合成S期：6～8hDNA合成G2期：2～5hDNA量加倍,RNA合成M期：0.5～1h染色體分裂細(xì)胞代數(shù)為細(xì)胞分裂次數(shù)傳代數(shù)表示細(xì)胞培養(yǎng)分種傳代次數(shù)細(xì)胞代數(shù)=傳代數(shù)×分種數(shù)/2X=(logN-logNo)÷log2X代數(shù)

N培養(yǎng)最終細(xì)胞數(shù)

No培養(yǎng)起始細(xì)胞數(shù)倍增時(shí)間=培養(yǎng)經(jīng)過時(shí)間÷代數(shù)⒉細(xì)胞生長需貼附于基質(zhì),并有接觸抑制現(xiàn)象。⒊正常二倍體細(xì)胞的生長壽命是有限的。原代培養(yǎng)有限細(xì)胞系無限細(xì)胞系⒋動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境十分敏感;

對(duì)理化因素敏感，如：滲透壓、pH、離子濃度、剪切力、微量元素等。⒌動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基要求高必需氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、微量元素、葡萄糖、細(xì)胞生長因子、貼壁因子等。

⒍動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同。動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成部位：游離核糖體粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體

游離核糖體合成蛋白質(zhì)用于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)。

粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體合成蛋白質(zhì)是分泌的和膜中的整合蛋白多為糖蛋白。動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)藥物缺點(diǎn):培養(yǎng)條件高、成本貴、產(chǎn)量低。優(yōu)點(diǎn):分泌胞外、純化方便、翻譯后修飾糖基化，與天然產(chǎn)品一致。第三節(jié)生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的

要求和獲得一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求原代細(xì)胞二倍體細(xì)胞系轉(zhuǎn)化細(xì)胞系二、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲得⒈原代細(xì)胞是直接取自動(dòng)物組織器官,經(jīng)過粉碎消化而獲得的細(xì)胞懸液（109/g）。需要大量動(dòng)物，費(fèi)錢費(fèi)勞力。雞胚細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞、鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞。⒉二倍體細(xì)胞系原代細(xì)胞經(jīng)過傳代篩選克隆，從多種細(xì)胞成分的組織中，挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。二倍體細(xì)胞有正常細(xì)胞的特點(diǎn)：①染色體組型是2n核型；②貼壁依賴接觸抑制；③可傳代培養(yǎng)50代；④無致瘤性。二倍體細(xì)胞⒊轉(zhuǎn)化細(xì)胞系通過某個(gè)轉(zhuǎn)化過程形成的，常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細(xì)胞特點(diǎn)，而獲得無限增殖能力。轉(zhuǎn)化過程可以是自發(fā)的，和人工的，從腫瘤組織中。三、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞

的特性

W1-38：正常胚肺組織人二倍體細(xì)胞系。核型為2n=46。成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生膠原，培養(yǎng)基用BME（Eagle’Basalmedium）。10%小牛血清，pH7.2,同工酶為G6PDB型。倍增時(shí)間為24h，有限壽命50代。安全，用于制備疫苗。

MRC-5：從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細(xì)胞系。核型為2n=46。屬成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)基用加小牛血清。同工酶G6PD(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶

)B型。有限壽命42～46代。增殖速度較W1-38快，對(duì)不良環(huán)境敏感性較W1-38低。對(duì)人的病毒敏感。用于生產(chǎn)疫苗。

CHO-K1：從中國地鼠卵巢中分離的上皮樣細(xì)胞。核型：2n=20～22。培養(yǎng)基：DEME培養(yǎng)基

0.1mmol/L次黃嘌呤，0.1mmol/L胸苷，

10%小牛血清，加入脯氨酸。

BHK-21:從5只無性別的生長1天的地鼠幼鼠腎臟中分離的;成纖維樣細(xì)胞,核型為2n=44;培養(yǎng)基為DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現(xiàn)已用于工程細(xì)胞構(gòu)建。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現(xiàn)已用于工程細(xì)胞構(gòu)建。

Vero：從正常成年非洲綠猴腎臟分離的。為貼壁依賴的成纖維細(xì)胞，核型2n=60；培養(yǎng)基為199培養(yǎng)基，加5%胎牛血清；用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒。

Namalwa：從肯尼亞患有淋巴瘤病人獲取，建成的人的類淋巴母細(xì)胞。2.8%的高倍體率，12～14條標(biāo)記染色體。單條X，無Y。培養(yǎng)基為RPMI1640，添加7%胎牛血清。用于生產(chǎn)

α干擾素。

SP2/0-Ag14：通過融合的方法，從有羊抗紅細(xì)胞活性的BALB/c

小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系P3X63Ag8融合雜交瘤SP2/NL-Ag

亞克隆中分離獲得，

能耐受8氮鳥嘌呤20μg/ml但在含HAT選擇培養(yǎng)基中不能存活。通常用培養(yǎng)基為DMEM，添加10%胎牛血清。用于生產(chǎn)單抗雜交瘤細(xì)胞和抗體。

Sf-91983年從親代IPLB—SF21AE

中克隆形成。親代細(xì)胞從秋粘蟲的蛹卵組織中分離獲得。它對(duì)苜宿尺蠖核型多角體病毒和其它桿狀病毒高度敏感。通常用的培養(yǎng)基為Grace培養(yǎng)基，添加3.3g/L水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液,10%胎牛血清。用于高效表達(dá)外來蛋白制品。四、基因工程細(xì)胞構(gòu)建和

篩選在生產(chǎn)中采用更多的更有前景的是融合細(xì)胞及采用基因工程構(gòu)建的各種工程細(xì)胞。被用構(gòu)建工程細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞有：

CHO-dhfr

、BHK-21、Namalwa、Vero、SP2/0、Sf-9等細(xì)胞。⒈真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建使用的載體有兩類：㈠病毒載體牛痘病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒㈡質(zhì)粒載體

牛痘病毒：用構(gòu)建多價(jià)疫苗腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒：用于基因治療。桿狀病毒：用于外源基因表達(dá)。

其作為載體的優(yōu)點(diǎn)：

①雙鏈DNA，易重組

②插入7～8kbDNA不影響正常病毒粒子的形成。③多角體蛋白和病毒粒子的形成無直接關(guān)系，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；

④多角體蛋白基因有非常強(qiáng)的啟動(dòng)子，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可占全部蛋白質(zhì)的20%～30%；⑤用光學(xué)顯微鏡可看到多角體，可以此作為標(biāo)記物，選陽性克隆。⑥如用家蠶桿狀病毒，還可在蠶體表達(dá)外源基因。

質(zhì)粒載體在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)都能擴(kuò)增。都含有如下基本成分：①允許載體在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增的質(zhì)粒序列。②含有使基因表達(dá)的調(diào)控元件。

③能用以篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記。

④有時(shí)還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)。⒉基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選基因載體導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞常用方法是：磷酸鈣沉淀法電穿孔法

HATHAT次黃嘌呤（H）核苷酸前體，使cell通過替代途徑合成DNA氨基蝶呤（A）葉酸拮抗物，阻斷cell合成DNA的主要途徑胸腺嘧啶核苷（T）使cell通過替代途徑合成DNA

cell合成DNA有兩種途徑：a)主要途徑：糖、aa、合成核苷酸,合成DNA,需葉酸參與氨基蝶呤（A）可阻斷b)替代途徑：次黃嘌呤（H）、胸腺嘧啶核苷（T）HGPRT(次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶);TK催化

磷酸鈣沉淀法：溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2形成磷酸鈣沉淀，DNA被包在磷酸鈣沉淀中，形成DNA—磷酸鈣共沉淀物，當(dāng)和細(xì)胞表面接觸時(shí)，則通過細(xì)胞吞噬作用而將DNA導(dǎo)入。

電穿孔法：

借助電穿孔儀的高壓脈沖電場，使細(xì)胞膜出現(xiàn)瞬時(shí)可逆性小孔，外源DNA沿小孔進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)化率較高，拷貝數(shù)低。五、細(xì)胞庫的建立生產(chǎn)用的工程細(xì)胞必須建立兩個(gè)細(xì)胞庫：

⒈原始細(xì)胞庫

⒉生產(chǎn)用細(xì)胞庫⒈原始細(xì)胞庫貯存時(shí)須有該細(xì)胞的詳細(xì)擋案，包括：

①該細(xì)胞系的歷史②該細(xì)胞系的特性③對(duì)各種有害因子的檢查結(jié)果⒉生產(chǎn)用細(xì)胞庫從原始細(xì)胞庫來的，或從單一安瓶來，或從多個(gè)安瓶來即刻混合，經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增再分裝儲(chǔ)存形成細(xì)胞庫。需建擋案，進(jìn)行無菌性無細(xì)胞交叉污染的檢查。需確定最高使用的傳代數(shù)。第四節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)

條件和培養(yǎng)基細(xì)胞體外培養(yǎng)基本條件:①無菌②營養(yǎng)充足,防止有害物質(zhì)③氧氣④隨時(shí)清除代謝有害物質(zhì)⑤良好的生存外環(huán)境⑥及時(shí)分種一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件⒈器材的清洗和消毒⑴器材的清洗浸泡、刷洗、泡酸、沖洗⑵器材的消毒滅菌物理消毒化學(xué)消毒⒉水質(zhì):電阻值大于18MΩ,

去熱原。⒊pH:7.2～7.4⒋滲透壓:290～300mOsm/kg⒌溫度:37±0.5C⒍空氣:氧的飽和質(zhì)60%,氧分壓

4～0.7kPa二、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)

基的種類和組成分3類:⒈天然培養(yǎng)基⒉合成培養(yǎng)基⒊無血清培養(yǎng)基⒈天然培養(yǎng)基

血清、羊水、腹水等,成分復(fù)雜、成分不穩(wěn)定⒉合成培養(yǎng)基

DME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640⑴氨基酸⑵維生素⑶糖類⑷無機(jī)鹽⑸其它成分添加小牛血清：添加小牛血清的作用⑴提供生長因子和激素⑵提供貼附因子和伸展因子⑶提供結(jié)合蛋白⑷提供必需脂肪酸和微量元素⒊無血清培養(yǎng)基①提高重復(fù)性②減少微生物污染③供應(yīng)充足穩(wěn)定④產(chǎn)品易純化⑤避免血清因素對(duì)細(xì)胞的毒性⑥減少血清中蛋白對(duì)生物測定的干擾無血清培養(yǎng)基加入添加劑⑴生長因子和激素⑵結(jié)合蛋白⑶貼附因子和伸展因子⑷有利細(xì)胞生長的因子和元素第五節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方

法和操作方式一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法依細(xì)胞種類:

原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)依培養(yǎng)基:

液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)依培養(yǎng)器和方式:

靜止培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、中空纖維培養(yǎng)、固定床或流化床培養(yǎng)

從生產(chǎn)實(shí)際分為:

懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)⒈懸浮培養(yǎng)讓細(xì)胞自由的懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長繁殖。⒉貼壁培養(yǎng)讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上生長繁殖的培養(yǎng)方法。⒊貼壁-懸浮培養(yǎng)⒊貼壁-懸浮培養(yǎng)⑴微載體培養(yǎng)⑵包埋和微囊培養(yǎng)⑶結(jié)團(tuán)培養(yǎng)二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作

方式⒈分批式操作⒉半連續(xù)式操作⒊灌流式操作第六節(jié)動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)

器及其檢測控制系統(tǒng)一、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型及其基本結(jié)構(gòu)⒈攪拌式生物反應(yīng)器⒉氣升式生物反應(yīng)器⒊中空纖維式生物反應(yīng)器⒋透析袋或膜式生物反應(yīng)器⒌固定床或流化床式生物反應(yīng)器⒈攪拌式生物反應(yīng)器⒉氣升式生物反應(yīng)器⒊中空纖維式生物反應(yīng)器平床式中空纖維式生物反應(yīng)器⒋透析袋或膜式生物反應(yīng)器⒌固定床或流化床式生物反應(yīng)器CellGenplus生物反應(yīng)器二、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的

檢測控制系統(tǒng)⒈培養(yǎng)過程需檢測的物化參數(shù)直接在線檢出取樣離線檢測檢測后計(jì)算

⒉主要參數(shù)的檢測和控制方法⒉主要參數(shù)的檢測和控制方法⑴溫度⑵pH①在培養(yǎng)初期，控制進(jìn)氧量②當(dāng)細(xì)胞密度提高后控制

NaHCO3的量⑶溶氧⑷攪拌⑸進(jìn)出液流量⑹其它第七節(jié)動(dòng)物細(xì)胞制藥的前

景與展望一、提高產(chǎn)量降低成本和改進(jìn)質(zhì)量方面的研究二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究三、組織工程的研究一、提高產(chǎn)量、降低成本和改

進(jìn)質(zhì)量方面的研究

為了提高產(chǎn)量,要提高細(xì)胞表達(dá)水平。為降低成本，須改進(jìn)培養(yǎng)基配方。為改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量，關(guān)鍵是糖基化質(zhì)量。改進(jìn)工藝，生產(chǎn)設(shè)備等二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究自1982年P(guān)alimiter提出用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來生產(chǎn)藥用蛋白以來，發(fā)展迅速。優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)量高成本低質(zhì)量與天然一樣?，F(xiàn)還有不成熟之處。對(duì)動(dòng)物和人的健康的影響。三、組織工程的研究組織工程：通過對(duì)大量細(xì)胞的培養(yǎng)，并用細(xì)胞直接作為一種治療手段用于臨床，或用培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)一步加工構(gòu)成一種組織，如人造皮膚、人造肝臟、人造胰腺、人造血管、人造骨等并用于臨床治療。三、重組蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)

1．選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)2．兩個(gè)主要的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)1．哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系的種類和數(shù)目已經(jīng)發(fā)展很快。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系有很多其他體系不能與之相比的優(yōu)勢。它具有復(fù)雜的翻譯后加工系統(tǒng)，糖基化以及二硫鍵在合成和分泌過程中自然而然的正確形成。哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有產(chǎn)生正確折疊和完全生物活性的蛋白質(zhì)。實(shí)例：組織血纖維蛋白溶酶原激活因子(tPA)、紅細(xì)胞生成素(EPO)、人DNA酶。在大腸桿菌中表達(dá)tPA時(shí)，產(chǎn)生錯(cuò)折疊和非糖基化，而在酵母中表達(dá)tPA產(chǎn)生過糖基化，二者的產(chǎn)物都沒有生物活性。分泌型哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以通過設(shè)計(jì)，使外源重組蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中。這個(gè)重組表達(dá)單位包括N末端的信號(hào)肽，其作用是起始新生肽鏈插入到內(nèi)織網(wǎng)中，此信號(hào)肽在分泌過程中被切除，從而產(chǎn)生具正確N端的重組蛋白質(zhì)。從內(nèi)織網(wǎng)到高爾基體再到細(xì)胞外空間的分泌過程產(chǎn)生糖基化和防止蛋白被胞內(nèi)蛋白酶水解。分泌過程也使蛋白質(zhì)二硫鍵正確配對(duì)和正確折疊。哺乳類動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系的另一個(gè)用處是在天然環(huán)境條件下，研究工程化基因產(chǎn)物的性質(zhì)。如將胰島素受體基因經(jīng)突變后，再導(dǎo)入到特定細(xì)胞中表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在受體蛋白質(zhì)上單一氨基酸的突變可導(dǎo)致其對(duì)胰島素結(jié)合活性的喪失，并導(dǎo)致激活自磷酸化和酪氨酸激酶。

2．兩個(gè)主要的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有兩個(gè)基因表達(dá)系統(tǒng)可供選擇，一是瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，一是穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)。瞬時(shí)基因表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)簡單、有效的外源蛋白表達(dá)手段，其表達(dá)水平最高可以達(dá)到穩(wěn)定細(xì)胞表達(dá)水平。蛋白質(zhì)是由未整合的、不復(fù)制的質(zhì)粒DNA產(chǎn)生的，這樣使得蛋白質(zhì)表達(dá)的時(shí)間相對(duì)短，只有48h到7天。穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)需要得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株，需要1～2個(gè)月的時(shí)間，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，DNA被整合到染色體中，這使得重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物可以一代接一代地產(chǎn)生。四、噬菌體顯示(Phagedisplay)對(duì)EPO分子片段的篩選關(guān)于噬菌體顯示的表達(dá)載體噬菌體顯示技術(shù)的操作EPO-EPOREMP-EBP

GeorgeP.SmithValeryA.PetrenkoGeorgeP.Smithb.in1941.Bsc.degreeinbiologyin1963,aPh.D.inbacteriologyandimmunologyfromHarvardUniversityin1970.AfterapostdoctoralfellowshipwithOliverSmithiesattheUniversityofWisconsin,hejoinedthefacultyoftheDivisionofBiologicalSciencesattheUniversityofMissouriinColumbiain1975asAssistantProfessorandsincehasbeenpromotedtoAssociateandFullProfessor.Hehaspublished35papersinareasincludingantibodystructureandevolution,theevolutionofrepeatedDNAsequences,genomics,andthebiologyofthefilamentousphage.Itisfromhisinterestinthefilamentousphagethattheideaofphagedisplayevolved.ValeryA.Petrenkob.In1949,haspublishedover70papersandhas13inventionsandpatents.OverviewThepast10yearshasseenremarkableprogressinourunderstandingofthereplicationcycleoftheM13phageThelifecycleisverysophisticatedInitialinfectiontransfersgeneticmaterialintohostwithlittlemembranedisruption.LateinfectionstagesperturbhostmembraneforreleaseofvirionsM13isnon-lyticM13StructureDimensions:6.5nmindiameterLengthdependantongenomebutwildtypeapproximately930nmMass16.3MDofwhich87%comprisedofproteinGenome:SinglestrandedcircularDNAmolecule,covalentlyclosedHousedinaflexibleproteincylinderM13StructureGenomeorientation78NucleotidehairpinregioncalledthepackagingsignallocatedatpVII/pIXterminusM13StructureProteinsLengthofphagecylindercomprises2700copiesofthe50-amino-acidmajorcoatproteinpVIIIAtoneterminus:5copiesof33AAresiduepVII5copiesof32AAresiduepIXAtoneterminus:5copiesof406AAresiduepIII5copiesof112AAresiduepVIM13GeneFunctionsGeneFunctionAminoAcidsMolWtIIDNAReplication41046137XDNAReplication11112672VBindingssDNA879682VIIIMajorcapsidprotein505235IIIMinorcapsidprotein40642522VIMinorcapsidprotein11212342VIIMinorcapsidprotein333599IXMinorcapsidprotein323650IAssembly34839502IVAssembly40543476XIAssembly10812424PhageLifeCycleInfectionprocessMultistepRequiresbacterialFconjugativepilusandbacterialTolQ,R&Acytoplasmicmembraneproteins.InitiatedbybindingofFpilustophagepIIIN2domain.Pilusretracts(triggeredbyphage???)bringingpIIIterminustotheperiplasm.N2bindingreleasesN1forinteractionwithbacterialTolAPhageFPilusOMCMTolQTolATolRPeriplasmN1N2PhageLifeCycleInfectionprocesscontSubsequentstepsunclearpVIII,pVII&pIXdisassembleintocytoplasmicmembraneasphageDNAistranslocatedintocytoplasm?OnceinthemembranepVIIIjoinspoolofnewlysynthesisedpVIIIfornewparticleformation.PhageLifeCycleReplicationComplementary(-)DNAstrandtoviral(+)DNAsynthesisedbybacterialenzymesGyrase,atopoisomerase,catalysesformationofdsDNA

supercoilscalledthereplicativeform(RF)The(-)strandoftheRFistranscribedandtranslatedintothephageproteinsThepIIproteinnicksthe(+)strandRFintheintergenicregiontoproduceaprimerforsynthesisofanewviralstrandpIIcircularisesthedisplaced(+)strandandconvertsittoasupercoiled

dsDNA;apoolofprogenydsDNAisthusformedAtacriticalconcentrationofpV,dimersofpVbindtothedsDNApreventingfurtherdsDNAproductionbutallowingsynthesisof(+)DNAPhageLifeCycleReplicationpV

dimersbindtothe(+)strandandwrapsitupA78nucleotidehairpinregionoftheDNAremainspVfreeandactsasapackagingsignalinitiatingthephageassemblyreactionpXisalsocytoplasmicallylocatedandisrequiredforreplicationbutitsroleisunclearAlloftheotherphageproteinsaresynthesisedandinsertedintothebacterialmembranePhageLifeCycleAssemblyOccursatbacterialadhesionzonelikesitespV

dimersareremovedandthecapsidproteinsareassembledaroundtheDNAasitisextruded.TheprocessisinitiatedbyinteractionofpVII,pIXandpVIIIwiththeDNApackagingsignalUnknownhowpVIandpIIIareaddedatendofvirionPhageReplicationSchematicDNAReplicationProteinsCapsid&Assembly

Proteins(+)+++/-pVPhageAssemblySiteFPilusPhageDNAPhageDisplayLibrariesPhagedisplayisapowerfultoolthatextendstherangeofmoderncombinatorialscreeningtechniques,allowingthediscoveryandcharacterisationofproteinsthatinteractwithadesiredtarget.Phagedisplayisasysteminwhichaproteinisdisplayedonthesurfaceofaphageasafusionwithoneofthecoatproteinsofthevirus.TheDNAthatencodesthisproteinishousedwithinthevirion.BycloninglargenumbersofDNAsequencesintothephage,displaylibrariesareproducedwitharepertoireofmanybillionsofuniquedisplayedproteins.PhageDisplayLibrariesUsingaprocessofbiopanning,onecanrescuephagethatdisplayaproteinthatspecificallybindstoatargetofinterest.Briefly,asimplemethodforbiopanninginvolvescoatingaplatewiththetargetandincubatingthelibraryontheplatetoallowphagedisplayingacomplementaryproteintothetargettobind.Non-bindingphagearethenwashedawayandthosethatareboundareeluted.Infectionofbacteriawiththebindingphageresultsinphageamplification.Successiveroundsofbiopanningenrichthepoolofphage,withclonesthatspecificallybindthetarget.PeptidePhageDisplaypVIIIPeptideDisplayDisplayoneverycopyofpVIIIlimitedto6-8aminoacidsbutarepotentiallyimmunogenicandsusceptibletoproteasesHybridvirionsinwhich80%ofpVIIIarewild-typeallowlargepeptidesandproteinstobedisplayedpIIIPeptideDisplayOnlyfivemoleculescanbedisplayedperphageLargeinsertspackagewellbutreduceinfectivityOvercomebydisplayingpeptideononlyonepIIImolecule=phagemidsystem;pIIIwildtypeencodedbyhelperphage,displayedpeptideencodedbyphagemidPhagedisplaymethod(1)M13(afilamentousphagecontainingss-DNAencasedinaproteincoat):containsfivecoatproteins,twoofwhicharegVIIIp(geneVIIIprotein)andgIIIp(geneIIIprotein).Phagedisplaymethod(2)Phagedisplaymethod(2):(contd.)Phagedisplaymethod(2):(contd.)PhagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedagonsitsoferythropoietinreceptorAgonists:whichmimicthefunctionofahormonebybindingtoitsreceptorandcausingthenormalresponse.Antagonists:whichbindtothereceptorbutdonotactivatehormone-inducedeffectsPhagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedagonsitsoferythropoietinreceptor(contd.)Toidentifypeptidesorsmallmoleculeswhicheitherinhibitorstimulatehormonefunction.Thehot-spotprinciple:asmallnumberofresiduesatabindinginterfacecontributemostofthebindingenergy.Erythropoietin(EPO):acytokinehormonewhichstimulatesformationofredbloodcells.EPOR:erythropoietinreceptorEBP:extra-cellulardomainofEPORPhagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedagonsitsoferythropoietinreceptor(contd.)