第六章 微生物的生長與控制

第六章

微生物的生長及其控制微生物生長的研究方法環(huán)境因素對微生物生長的影響微生物生長的控制本章學(xué)習(xí)要點(diǎn)生長——微生物細(xì)胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行新陳代謝，當(dāng)同化作用大于異化作用時(shí)，生命個(gè)體的重量和體積不斷增大的過程。繁殖——生命個(gè)體生長到一定階段，通過特定方式產(chǎn)生新的生命個(gè)體，即引起生命個(gè)體數(shù)量增加的生物學(xué)過程。群體生長——群體中各個(gè)個(gè)體進(jìn)一步生長、繁殖?？梢杂弥亓俊Ⅲw積、密度或濃度來衡量。生長與繁殖的概念群體生長=個(gè)體生長+個(gè)體繁殖研究生長規(guī)律需要解決三個(gè)前提：

微生物的純培養(yǎng)；微生物生長的測量方法；微生物的同步生長。

第一節(jié)微生物純培養(yǎng)分離及生長測定方法一、獲得純培養(yǎng)的方法二、微生物純培養(yǎng)生長的測定方法一、獲得純培養(yǎng)的方法純培養(yǎng)(pureculture)——微生物學(xué)中把從一個(gè)細(xì)胞或一群相同的細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)繁殖而得到的后代,稱純培養(yǎng).純培養(yǎng)基本步驟：稀釋平板法平板劃線分離法單細(xì)胞挑取法選擇性培養(yǎng)基分離法純培養(yǎng)方法(2)培養(yǎng)(1)分離①稀釋平板法即可定性，又可定量，用途廣泛。又分為：傾注平板法和涂布平板法?；具^程：（1）梯度稀釋過程；（2）分離培養(yǎng)過程涂布傾注梯度稀釋過程10-110-210-310-410-510-6②平板劃線分離法特點(diǎn)：快速、方便。

用接種環(huán)沾少許待分離的材料，在培養(yǎng)基表面進(jìn)行多次平行劃線，使微生物細(xì)胞分開生長以獲得微生物純培養(yǎng)的過程連續(xù)劃線劃線分離后平板上顯示的菌落照片③單細(xì)胞（單孢子）分離法采用顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)的方法。該方法要在顯微鏡下進(jìn)行。④選擇性培養(yǎng)基分離法

各種微生物對不同的化學(xué)試劑、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用這些特性可配制適合某種微生物而限制其它微生物生長的選擇培養(yǎng)基，用它來培養(yǎng)微生物以獲得純培養(yǎng)。微生物純培養(yǎng)分離方法的比較分離方法應(yīng)用范圍平皿劃線法方法簡便，多用于分離細(xì)菌稀釋倒平皿法即可定性，又可定量，用途廣泛單細(xì)胞挑取法局限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究利用選擇培養(yǎng)基法適用于分離某些生理類型較特殊的微生物二、微生物純培養(yǎng)生長的測定方法描述不同種類、不同生長狀態(tài)的微生物生長情況，需選用不同的測定指標(biāo)。（一）微生物生長量的測定法1、直接法

測干重法

測體積法2、間接法

比濁法

生理指標(biāo)測定法1、直接法

血球計(jì)數(shù)板

涂片染色法2、間接法（平板菌數(shù)計(jì)數(shù)法）

澆注平板法

涂布平板法（二）微生物細(xì)胞數(shù)目的檢測法血球計(jì)數(shù)板法適用范圍：個(gè)體較大細(xì)胞或顆粒，如血球、酵母菌等。特點(diǎn)：快速，準(zhǔn)確。染色法活菌發(fā)出橙色熒光死菌發(fā)出綠色螢光方法：用特殊的染料對活菌染色后再觀察或用紫外光顯微鏡觀察。丫啶橙染色美蘭染色活細(xì)胞無色死細(xì)胞藍(lán)色澆注平板法（PourPlate）平板涂布分離法（SpreadPlate）簡單易行，但易造成機(jī)械損傷干重法將一定量的菌液中的菌體通過離心或過濾分離出來,然后烘干(干燥溫度可采用105℃、100℃或80℃)、稱重。一般干重為濕重的10%—20%，而一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞一般重約10-12—10-13g。該法適合菌液濃度較高的樣品。比濁法原理是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數(shù)越多，光密度越大。因此，借助于分光光度計(jì)，在一定波長下測定菌懸液的光密度，就可反應(yīng)出菌液的濃度。特點(diǎn)：快速、簡便；但易受干擾。生理指標(biāo)法測含氮量蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要物質(zhì)，含量穩(wěn)定，而氮是蛋白質(zhì)的主要成分，通過測含氮量就可推知微生物的濃度。一般細(xì)菌含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%，根據(jù)一定體積培養(yǎng)液中的含氮量再乘以6.25，就可測得粗蛋白的含量。其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、產(chǎn)二氧化碳、產(chǎn)酸、產(chǎn)熱、粘度等，都可用于生長量的測定。第二節(jié)微生物的生長規(guī)律由于微生物細(xì)胞極其微小，研究其個(gè)體生長存在著技術(shù)上的困難。1、同步培養(yǎng)：設(shè)法使群體中的所有細(xì)胞盡量都處于同樣的細(xì)胞生長和分裂周期中，然后通過分析此群體在各個(gè)階段的生物化學(xué)特征來間接了解單個(gè)細(xì)胞的相應(yīng)變化規(guī)律。2、同步生長：通過同步培養(yǎng)的手段而使細(xì)胞群體中各個(gè)體處于分裂步調(diào)一致的生長狀態(tài)，稱為同步生長一、微生物的個(gè)體生長和同步生長3、獲得同步生長的方法：獲得同步生長的方法主要有兩類：環(huán)境條件誘導(dǎo)法：抗生素、變換溫度、光線、培養(yǎng)基等。造成與正常細(xì)胞周期不同的周期變化。機(jī)械篩選法：選擇性過濾、密度梯度離心或膜洗脫法。硝酸纖維素濾膜法離心法單細(xì)胞微生物的群體生長曲線生長曲線：定量描述液體培養(yǎng)基中微生物群體生長規(guī)律的實(shí)驗(yàn)型曲線。生長曲線代表了細(xì)菌在新的環(huán)境中從開始生長、分裂直至死亡的整個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程。二、微生物的群體生長典型生長曲線：將少量單細(xì)胞的純培養(yǎng)，接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取樣，測細(xì)菌細(xì)胞數(shù)目。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌數(shù)目的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制所得的曲線。生長曲線的制作典型的生長曲線延滯期對數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期典型的生長曲線按照生長速率常數(shù)（growthraceconstant）不同分為延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期生長速率常數(shù)(R)=分裂次數(shù)(代)/單位時(shí)間其它名稱：停滯期、調(diào)整期、適應(yīng)期1）現(xiàn)象：活菌數(shù)沒增加，曲線平行于橫軸。2）特點(diǎn)：生長速率常數(shù)=0，細(xì)胞數(shù)目不增加細(xì)胞形態(tài)變大或增長細(xì)胞內(nèi)RNA特別是rRNA含量增高，原生質(zhì)嗜堿性增強(qiáng)合成代謝活躍（核糖體、酶類、ATP合成加快），易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶對外界不良條件敏感，（如氯化鈉濃度、溫度、抗生素等化學(xué)藥物）3）原因：適應(yīng)新的環(huán)境條件，合成新的酶，積累必要的中間產(chǎn)物1.延滯期（lagphase）菌種：

繁殖速度較快的菌種的延滯期一般較短；◆接種物菌齡：用對數(shù)生長期的菌種接種時(shí)，其延滯期較短，甚至檢查不到延滯期；◆接種量：一般來說，接種量增大可縮短甚至消除延滯期；◆培養(yǎng)基成分：

在營養(yǎng)成分豐富的天然培養(yǎng)基上生長的延滯期比在合成培養(yǎng)基上生長時(shí)短；接種后培養(yǎng)基成分有較大變化時(shí)，會(huì)使延滯期加長，所以發(fā)酵工業(yè)上盡量使發(fā)酵培養(yǎng)基的成分與種子培養(yǎng)基接近。種子的損傷度4）影響延滯期長短的因素：5）認(rèn)識延滯期的特點(diǎn)及形成原因?qū)?shí)踐的指導(dǎo)意義：◆在發(fā)酵工業(yè)上需設(shè)法盡量縮短延滯期；采取措施有：①選用繁殖快的菌種②采用對數(shù)生長期的健壯菌種③增加接種量④調(diào)整培養(yǎng)基的成分，在種子培養(yǎng)基中加入發(fā)酵培養(yǎng)基的某些成分◆在食品工業(yè)上，盡量在此期進(jìn)行消毒或滅菌2、對數(shù)期（logarithmicphase）其他名稱：指數(shù)期指細(xì)胞以幾何級數(shù)速度分裂的一段時(shí)期

1）特點(diǎn)：生長速率常數(shù)最大，即代時(shí)最短細(xì)胞進(jìn)行平衡生長，菌體大小、形態(tài)、生理特征等比較一致代謝最旺盛2）影響因素：菌種營養(yǎng)成分

營養(yǎng)物濃度﹡培養(yǎng)溫度大腸桿菌10℃代時(shí)860分，15℃代時(shí)120分，40℃代時(shí)17.5分E.coli17分，結(jié)核桿菌792—932分3）對數(shù)期中的的三個(gè)重要參數(shù)：

繁殖代數(shù)、生長速率常數(shù)、代時(shí)設(shè)接種時(shí)細(xì)胞數(shù)為x1,時(shí)間為t1,到時(shí)間t2后，繁殖n代，細(xì)胞數(shù)為x2

繁殖代數(shù)n=3.322(lgx2-lgx1)t2-t13.322(lgx2-lgx1)代時(shí)G=t2-t13.322(lgx2-lgx1)生長速率常數(shù)R=4）應(yīng)用意義：①由于此時(shí)期的菌種比較健壯，生產(chǎn)上用作接種的最佳菌齡；②發(fā)酵工業(yè)上盡量延長該期，以達(dá)到較高的菌體密度③是生理代謝及遺傳研究或進(jìn)行染色、形態(tài)觀察等的良好材料。④食品工業(yè)上盡量使有害微生物不能進(jìn)入此期3、穩(wěn)定期（stationaryphase）又稱：恒定期或最高生長期1）特點(diǎn)：①生長速率常數(shù)R=0，即新繁殖的細(xì)胞數(shù)與衰亡相等；②菌體產(chǎn)量達(dá)到了最高點(diǎn)。③細(xì)胞開始積累儲藏物質(zhì)，合成次生代謝產(chǎn)物④芽孢菌開始形成芽孢。2）產(chǎn)生原因：

營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡營養(yǎng)物的比例失調(diào)，如碳氮比不合適;有害代謝廢物的積累（酸、醇、毒素等）理化條件（pH、氧化還原勢等）不合適;①發(fā)酵生產(chǎn)形成的重要時(shí)期（抗生素、氨基酸等），生產(chǎn)上應(yīng)盡量延長此期，提高產(chǎn)量，措施如下：

補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)（補(bǔ)料）調(diào)pH調(diào)整溫度②穩(wěn)定期細(xì)胞數(shù)目及產(chǎn)物積累達(dá)到最高。3）應(yīng)用意義：4、衰亡期（declinephase）1）特點(diǎn)：

①群體呈“負(fù)生長”；②細(xì)胞常出現(xiàn)多形態(tài)；③菌體死亡、并發(fā)生自溶；④有的會(huì)進(jìn)一步合成或釋放對人類有益的抗生素等次生代謝物⑤釋放芽孢。衰亡期比其他各時(shí)期時(shí)間長，它的長短也與菌種和環(huán)境條件有關(guān)。2）產(chǎn)生原因：生長條件的進(jìn)一步惡化，使細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體的死亡什么時(shí)期菌體代謝產(chǎn)物最多什么時(shí)期細(xì)菌細(xì)胞代謝活性最強(qiáng)什么時(shí)候細(xì)菌細(xì)胞總數(shù)最多什么時(shí)期細(xì)菌細(xì)胞生長速度最快什么時(shí)期世代時(shí)間短而穩(wěn)定對數(shù)生長期穩(wěn)定期穩(wěn)定期對數(shù)生長期對數(shù)生長期小結(jié)三、微生物的連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）分批培養(yǎng)（batchculture）：將微生物置于一定容積的定量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基一次性加入。不再補(bǔ)充和更換，最后一次性收獲。連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）：在微生物培養(yǎng)的過程中，不斷地供給新鮮的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)排除含菌體及代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，讓培養(yǎng)的微生物長時(shí)間地處于對數(shù)生長期，以利于微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩(wěn)定狀態(tài)。原理：當(dāng)微生物在單批培養(yǎng)方式下生長達(dá)到對數(shù)期后期時(shí)，一方面以一定的速度流進(jìn)新鮮培養(yǎng)基并攪拌，另一方面以溢流方式流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，其中的微生物就能長期保持對數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率。單批培養(yǎng)恒濁法恒化法單批培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng) 時(shí)間連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液lg細(xì)胞數(shù)（個(gè)/ml）連續(xù)培養(yǎng)（一）連續(xù)培養(yǎng)原理連續(xù)培養(yǎng)器按控制方式分按培養(yǎng)器的級數(shù)分按細(xì)胞狀態(tài)分按用途分內(nèi)控制（控制菌體密度）：恒濁器外控制（控制培養(yǎng)液流速、以控制生長速率）：恒化器單級連續(xù)培養(yǎng)器多級連續(xù)培養(yǎng)器一般連續(xù)培養(yǎng)器固定化細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)器實(shí)驗(yàn)室科研用：連續(xù)培養(yǎng)器發(fā)酵生產(chǎn)用：連續(xù)發(fā)酵罐（二）連續(xù)培養(yǎng)器菌體生成器產(chǎn)物合成器（三）連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒化連續(xù)培養(yǎng)概念：以恒定流速使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)濃度恒定而保持細(xì)菌生長速率恒定的方法。原理：通過控制某一種營養(yǎng)物濃度（如碳、氮源、生長因子等），使其始終成為生長限制因子，而達(dá)到控制培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率條件下進(jìn)行生長繁殖。特點(diǎn)：維持營養(yǎng)成分的亞適量，控制微生物生長速率。菌體生長速率恒定，菌體均一、密度穩(wěn)定，產(chǎn)量低于最高菌體產(chǎn)量。應(yīng)用范圍：實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究應(yīng)用范圍：實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究，與生長速率相關(guān)的各種理論研究概念：通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基流速，使培養(yǎng)液濁度保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法。原理：以光電控制系統(tǒng)測定培養(yǎng)器內(nèi)微生物的生長密度，從而調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入的速度來維持菌濃度不變,即濁度不變。當(dāng)濁度高時(shí)，使新鮮培養(yǎng)基的流速加快，濁度降低，則減慢培養(yǎng)基的流速。特點(diǎn)：基質(zhì)過量，微生物始終以最高速率進(jìn)行生長，并可在允許范圍內(nèi)控制不同的菌體密度；但工藝復(fù)雜，煩瑣。（四）連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒濁培養(yǎng)（四）連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒濁培養(yǎng)使用范圍：用于生產(chǎn)大量菌體、生產(chǎn)與菌體生長相平行的某些代謝產(chǎn)物，如乳酸、乙醇等。裝置控制對象培養(yǎng)基培養(yǎng)基流速生長速率產(chǎn)物應(yīng)用范圍恒濁器菌體密度（內(nèi)控制）無限制生長因子不恒定最高大量菌體或與菌體形成相平行的產(chǎn)物生產(chǎn)為主恒化器培養(yǎng)基流速（外控制）有限制生長因子恒定低于最高不同生長速率的菌體實(shí)驗(yàn)室為主恒濁器與恒化器的比較（五）連續(xù)培養(yǎng)優(yōu)缺點(diǎn)1、優(yōu)點(diǎn)：

高效：簡化了操作自控：便于各種儀表進(jìn)行自動(dòng)控制產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定節(jié)約大量動(dòng)力、人力、水和蒸汽2、缺點(diǎn)：

菌種易于退化；易于遭到雜菌污染；營養(yǎng)物利用率低于單批培養(yǎng)。連續(xù)發(fā)酵，一般只能維持?jǐn)?shù)月~2年。

第三節(jié)影響微生物生長的環(huán)境條件一、溫度對微生物生長的影響二、氧氣對微生物生長的影響三、pH值對微生物生長的影響一、溫度對微生物生長的影響影響酶活性影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性影響物質(zhì)的溶解度(一)溫度對微生物的影響具體表現(xiàn)在：從微生物整體來看:生長的溫度范圍一般在-10℃~100℃極端下限為-30℃，極端上限為105~150℃但對于特定的某一種微生物：只能在一定溫度范圍內(nèi)生長，在這個(gè)范圍內(nèi)，每種微生物都有自己的生長溫度三基點(diǎn):即最低、最適、最高生長溫度（二）微生物生長的三個(gè)溫度基點(diǎn)低溫型微生物：嗜冷菌

(<20oC)中溫型微生物：嗜溫菌(20-45oC)高溫型微生物：嗜熱菌(50-60oC)嗜高熱微生物：超嗜熱菌

(65-100oC)

根據(jù)微生物的最適生長溫度的不同，可將微生物劃為以下幾個(gè)類型：（三）微生物生長溫度類型1、高溫對微生物的影響高溫下蛋白質(zhì)不可逆變性，膜受熱出現(xiàn)小孔，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（溶菌）。當(dāng)溫度過低，造成微生物細(xì)胞凍結(jié)時(shí)，有的微生物會(huì)死亡，有些則并不死亡。（四）高溫與低溫對微生物的影響2、低溫對微生物的影響當(dāng)環(huán)境溫度低于微生物的最適生長溫度時(shí)，微生物的生長繁殖停止，當(dāng)微生物的原生質(zhì)結(jié)構(gòu)并未破壞時(shí)，不會(huì)很快造成死亡并能在較長時(shí)間內(nèi)保持活力，當(dāng)溫度提高時(shí)，可以恢復(fù)正常的生命活動(dòng)。微生物對氧的需要和耐受力在不同的類群中變化很大，根據(jù)微生物與氧的關(guān)系,可把它們分為幾種類群:

專性好氧菌

好氧菌兼性厭氧菌

微好氧菌

耐氧厭氧菌

厭氧菌(嚴(yán)格)厭氧菌二、氧氣對微生物生長的影響專性好氧菌（strictaerobe）必須在有較高濃度分子氧的條件下才能生長的微生物。特點(diǎn)：有完整的呼吸鏈，以分子氧作為最終氫受體，細(xì)胞含有超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶。微好氧菌（microaerophilicbacteria）只能在較低的氧分壓下才能正常生長的微生物。特點(diǎn)：通過呼吸鏈并以氧為最終氫受體而產(chǎn)能。耐氧菌（aerotolerantanaerobe）可在分子氧存在下進(jìn)行厭氧生活的微生物。特點(diǎn)：1）生活不需要氧，分子氧也對它無毒害。2）不具有呼吸鏈，依靠專性發(fā)酵獲得能量。3）細(xì)胞內(nèi)存在SOD和過氧化物酶，但缺乏過氧化氫酶。在有氧或無氧條件下均能生長，但有氧情況下生長得更好的微生物。特點(diǎn)：在有氧時(shí)靠呼吸產(chǎn)能，無氧時(shí)借發(fā)酵或無氧呼吸產(chǎn)能；細(xì)胞含有SOD和過氧化氫酶。兼性厭氧菌（facultativeaerobe）厭氧菌（anaerobe）分子氧對它有毒害，短期接觸空氣，也會(huì)抑制其生長甚至致死；在空氣或含有10%CO2的空氣中，在固體培養(yǎng)基表面上不能生長，只有在其深層的無氧或低氧化還原電勢的環(huán)境下才能生長；生命活動(dòng)所需能量通過發(fā)酵、無氧呼吸、循環(huán)光合磷酸化或甲烷發(fā)酵提供；細(xì)胞內(nèi)缺乏SOD和細(xì)胞色素氧化酶，大多數(shù)還缺乏過氧化氫酶。特點(diǎn)： H2O+O22O2·+2H+ O2+H2O2 2H2OO2+e O2·(·O2)（自由基）12SOD好氧生物和耐氧細(xì)菌過氧化氫酶好氧生物過氧化物酶NADH2 NAD耐氧菌厭氧菌氧毒害的機(jī)制（超氧化物歧化酶SOD學(xué)說）破壞各種重要的生物大分子和膜；形成其它活性氧化物穿過細(xì)胞膜于鐵離子催化下生成氧化性更強(qiáng)的羥基自由基影響膜表面電荷的性質(zhì)及膜的通透性，進(jìn)而影響對物質(zhì)的吸收能力。改變酶活性、酶促反應(yīng)的速率及代謝途徑環(huán)境pH值還影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)吸收三、pH值與微生物生長的相互影響（一）環(huán)境pH值對微生物生長的影響黑曲霉菌pH2-2.5產(chǎn)生檸檬酸pH2.5-6.5以菌體為主pH7合成草酸水楊酸在酸性條件下，易電離，易吸收，毒性強(qiáng)在堿性或中性條件下不易電離、不易吸收微生物的生長pH值范圍極廣，從pH<2~>10都有微生物能生長。但是絕大多數(shù)種類都生活在pH5.0~9.0之間。微生物生長的pH值三基點(diǎn)：各種微生物都有其生長的最低、最適和最高pH值。低于最低、或超過最高生長pH值時(shí)，微生物生長受抑制或?qū)е滤劳?。不同的微生物最適生長的pH值不同，根據(jù)微生物生長的最適pH值，將微生物分為：

（二)不同微生物對pH要求不同嗜堿微生物嗜中性微生物嗜酸微生物微生物種類最低pH最適pH最高pH大腸桿菌枯草芽孢桿菌金黃色葡萄球菌黑曲霉一般放線菌一般酵母菌4.34.54.21.55.03.06.0—8.06.0—7.57.0—7.55.0—6.07.0—8.05.0—6.09.58.59.39.0108.0

一些微生物生長的pH值范圍（三）微生物的生命活動(dòng)對環(huán)境pH值的影響★培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)pH值的措施：過酸時(shí)：加入堿或適量氮源，提高通氣量。過堿時(shí)：加入酸或適量碳源，降低通氣量。微生物在生長過程中也會(huì)使外界環(huán)境的pH值發(fā)生改變。培養(yǎng)基內(nèi)中性成分有機(jī)物糖類脂肪蛋白質(zhì)發(fā)酵、氧化有機(jī)酸水解脫羧胺類無機(jī)鹽（NH4）2SO4NH4+離子選擇吸收H2SO4NaNO3NO3-離子選擇吸收NaOH變酸變堿第四節(jié)微生物生長繁殖的控制控制有害菌的措施殺菌抑菌除菌消毒（部分殺滅）滅菌（徹底殺滅）防腐（抑制霉腐微生物）化療（抑制宿主體內(nèi)病原菌）殺菌溶菌幾個(gè)基本概念滅菌（sterilization）采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長繁殖能力的措施，稱為滅菌。殺菌：菌體雖死，形體尚存溶菌：菌體殺死后，細(xì)胞團(tuán)自發(fā)溶解、裂解而消失的現(xiàn)象消毒（disinfection）采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部的一部分對人體有害的病原菌，而對被處理物體基本無害的措施，稱為消毒。防腐（antisepsis）利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，從而達(dá)到防止物品發(fā)生霉腐的措施，稱為防腐。化療（chemotheraphy）即化學(xué)治療。利用具有高度選擇毒力的化學(xué)物質(zhì)抑制宿主體內(nèi)病原微生物的生長繁殖，以達(dá)到治療該傳染病的一種措施。比較項(xiàng)目滅菌消毒防腐化療處理因素強(qiáng)理、化因素理、化因素理、化因素化學(xué)治療劑處理對象任何物體內(nèi)外的一切微生物物體表面的病原菌物體內(nèi)外的一切微生物宿主體內(nèi)的病原菌作用效果徹底殺滅殺死或抑制抑制或殺死抑制或殺死實(shí)例加壓蒸汽滅菌，輻射滅菌，殺菌劑70%酒精消毒，巴氏消毒法冷藏、干燥、糖漬、鹽腌、缺氧、防腐劑抗生素、磺胺藥、生物藥物素滅菌、消毒、防腐和化療的比較是最常用的物理方法。高溫可引起蛋白質(zhì)、核酸等活性大分子氧化或變性失活而導(dǎo)致微生物死亡。

一、常用的滅菌、消毒、抑菌及除菌的物理方法（一）溫度1、高溫滅菌（消毒）法1）干熱滅菌法（dryheatsterilization）焚燒法（incineration）：是將被滅菌物品在火焰中燃燒，使所有的物質(zhì)碳化。特點(diǎn)：簡單、徹底，但對被滅菌物品的破壞極大。適用范圍：無經(jīng)濟(jì)價(jià)值的物品滅菌，及不怕燒的實(shí)驗(yàn)器具，如接種環(huán)、鑷子、試管或三角瓶口的滅菌等。干燥熱空氣滅菌法(hot-airoven)：將物品放入烘箱內(nèi)，然后升溫至150℃—170℃，維持1—2小時(shí)。特點(diǎn)：由于空氣傳熱穿透力差，菌體在脫水狀態(tài)下不易殺死，所以溫度高、時(shí)間長。適用范圍：玻璃、陶瓷和金屬物品的滅菌不適合液體樣品、棉花、紙張、纖維和橡膠類物質(zhì)的滅菌2）濕熱法(moistheatsterilization)：特點(diǎn)：溫度低、時(shí)間短、滅菌效果好在相同的溫度下，濕熱的效力比干熱滅菌好：熱蒸汽對細(xì)胞成分的破壞作用強(qiáng)熱蒸汽比熱空氣穿透力強(qiáng)，能更有效的殺滅微生物。蒸汽存在潛熱，故可迅速提高滅菌物體的溫度。利用水的沸點(diǎn)隨水蒸氣壓力的增加而上升，以達(dá)到100℃以上高溫滅菌的方法。方法：121℃（1kg/cm2或15磅/英寸2）維持15-20min。

115℃（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）35min。應(yīng)根據(jù)滅菌物品的性質(zhì)或成分選擇滅菌溫度例如：生理鹽水、營養(yǎng)瓊脂等培養(yǎng)基用121℃。含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培養(yǎng)基用115℃。適用：耐高溫物品，玻璃儀器、含水或不含水的物品。

高壓蒸汽滅菌法高壓蒸汽滅菌鍋?zhàn)⒁馐马?xiàng)：排凈冷空氣；滅菌終了，緩慢降壓；滅菌結(jié)束，趁熱取出物品。將水加熱至100℃，煮沸15min—30min，可殺死所有營養(yǎng)細(xì)胞和部分芽孢，達(dá)到消毒物的目的。適用范圍：水、注射器、針頭、家庭餐具

將待滅菌物品在80-100℃蒸煮15-60min，冷卻后擱置室溫（28-37℃）下過夜，并重復(fù)以上過程三遍以上。適用范圍：不耐高溫的物品滅菌，如不適于高壓滅菌的特殊培養(yǎng)基、藥品的滅菌。缺點(diǎn)：麻煩、費(fèi)時(shí)。煮沸消毒法

間歇滅菌法用較低的溫度來殺死其中的病源微生物，這樣既保持食品的營養(yǎng)風(fēng)味，又進(jìn)行了消毒.低溫維持法：63℃30min高溫瞬時(shí)法:72℃15s處理牛奶超高溫巴斯德滅菌法

讓液體食品停留在140℃左右2-4s，急劇冷卻至75℃，經(jīng)勻質(zhì)化后冷卻至20℃。巴斯德消毒法（Pasteurization）：

高溫瞬間巴斯德消毒法的操作流程圖

低溫——是通過降低酶反應(yīng)速度使微生物生長受到抑制。冷藏法：5℃，微生物斜面菌種放置冷藏箱中可保存數(shù)周至數(shù)月而不衰竭死亡；食品保鮮冷凍法：食品工業(yè)中采用-10℃左右的冷凍溫度較長時(shí)間地保藏食品；冷凍法也可用作菌種保藏，但所需溫度更低，如-80℃低溫冰箱、或-78℃干冰、或-196℃液氮中冷凍保存。2、低溫抑菌采用濾孔比細(xì)菌還小的篩子或?yàn)V膜作成各種過濾器，當(dāng)空氣或液體流經(jīng)篩子或?yàn)V膜時(shí)，微生物不能通過濾孔而被阻留在一側(cè)，從而達(dá)到滅菌的目的。濾器孔徑：常用0.22μm

、0.45μm

。應(yīng)用：對于含酶、血清、維生素和氨基酸等熱敏物質(zhì)除菌。（二）過濾除菌法但不能除去病毒、支原體和衣原體用于濾過除菌的各式濾器紫外線滅菌使用260—280nm紫外線殺菌效果最好，若以面積計(jì)算，一般30W的紫外燈可用于15M2的房間消毒紫外燈可用于房間消毒，照射時(shí)間為20—30分鐘，有效照射距離為1米左右。γ射線滅菌Co60放射性元素可放出γ射線。其優(yōu)點(diǎn)：每次可滅菌較多的物品，尤其是密封的物品，不耐熱的物品。醫(yī)用的一次性塑料用品就是用CO60照射滅菌的。（三）輻射二、常用的控菌方法消毒劑:可以抑制或殺滅微生物，但對人體也可能產(chǎn)生有害作用的化學(xué)試劑.—主要用于抑制或殺滅物體表面、器械、排泄物和環(huán)境中的微生物。（一）消毒劑和防腐劑HgCl2、CuSO4、碘液、氯氣、乙烯氧化物、甲醛劑、臭氧

防腐劑:可以抑制或阻止微生物生長，但對人體或動(dòng)物體的毒性較低的化學(xué)藥劑.——用于肌體表面，如皮膚、粘膜、傷口等處防止感染，也有的用于食品、飲料藥品的防腐作用。有機(jī)汞、0.1%~1％硝酸銀、碘液、70%乙醇、3％過氧化氫低溫：利用4℃以下的各種低溫以保藏食物、藥品、菌種等。缺氧：在密閉容器中加入除氧劑，如鐵粉。真空保藏也是比較常用的方法。

干燥：采用曬干或紅外線干燥保藏糧食、食品等，或在密封條件下用吸濕劑也可達(dá)到防霉作用。

高滲：通過鹽漬或糖漬達(dá)到高滲。

高酸度：如泡菜、酸菜等。

防腐劑：苯甲酸、山梨酸、脫氫醋酸等（二）防腐的措施（三）常用的消毒防腐劑及其應(yīng)用1、醇類使用濃度：70%—75%作用原理：乙醇脫水、脫脂、蛋白質(zhì)變性應(yīng)用范圍：皮膚、器皿2、醛類使用濃度：0.5%—10%甲醛、40%甲醛（福爾馬林)作用原理：蛋白質(zhì)變性應(yīng)用范圍：房間、物品消毒、防腐劑不能用無水乙醇3、酚類使用濃度：0.5%石炭酸、3%—5%石炭酸、3%—5%來蘇兒作用原理：破壞細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)變性應(yīng)用范圍：皮膚、地面、器具4、氧化劑使用濃度：0.1%高錳酸鉀、3%過氧化氫、0.2%-0.5%過氧乙酸作用原理：氧化蛋白質(zhì)活性基團(tuán)，酶失活應(yīng)用范圍：

0.1%高錳酸鉀：皮膚、水果、蔬菜

3%過氧化氫：皮膚、物品表面

0.2%—0.5%過氧乙酸：水果、蔬菜、塑料等甲酚和肥皂的混合液5、重金屬鹽類使用濃度：0.05%-0.1%升汞（HgCl2）

、2%紅汞、0.1%-1%硝酸銀、0.1%-0.5%硫酸銅作用原理：沉淀蛋白、蛋白質(zhì)變性、酶失活應(yīng)用范圍：0.05%—0.1%升汞：非金屬器皿2%紅汞：皮膚、粘膜、傷口0.1%—1%硝酸銀：皮膚、新生兒眼睛0.1%—0.5%硫酸銅：防治植物病害不能與碘酒同時(shí)使用6、表面活性劑使用濃度：0.05%-0.1%新潔爾滅、肥皂作用原理：破壞細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)變性應(yīng)用范圍：0.05%-0.1%新潔爾滅：皮膚、粘膜、器械肥皂：皮膚、金屬、棉織品、塑料7、鹵素及其化合物使用濃度：0.2-0.5mg/L氯氣、10%-20%漂白粉0.5%-1%漂白粉、2.5%碘酒作用原理：破壞細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)應(yīng)用范圍：0.2-0.5mg/L氯氣：飲水、游泳池水10%—20%漂白粉：地面0.5%-1%漂白粉：水、空氣等2.5%碘酒：皮膚

8、染料使用濃度：2%—4%龍膽紫作用原理：與蛋白質(zhì)的羧基或磷酸基結(jié)合，形成弱電離的化合物，妨礙菌體的正常代謝。應(yīng)用范圍：皮膚、傷口9、酸堿類名稱：生石灰、醋酸作用原理：蛋白質(zhì)變性，破壞細(xì)胞膜應(yīng)用范圍：生石灰：排泄物、地面

醋酸：房間化學(xué)消毒劑的應(yīng)用病人排泄物與分泌物：20%漂白粉、5%石炭酸、2%來蘇兒皮膚：2.5%碘酒、70%乙醇、2%紅汞黏膜：眼結(jié)膜：1%硝酸銀、2%蛋白銀口腔：3%過氧化氫生殖泌尿道：0.01%—0.1%洗必泰（雙氯苯雙胍己烷）

、0.1%高錳酸鉀飲水：氯氣、漂白粉廁所：生石灰空氣：甲醛熏蒸法、過氧乙酸熏蒸法手：0.2%—0.4%過氧乙酸浸泡、70%乙醇擦洗概念：是指那些能夠特異性地作用于某些微生物并具有選擇毒性的化學(xué)藥劑，對人體幾乎沒有什么毒性或毒性很小，可用作治療微生物引起的疾病。既適用于涂抹肌體表面，也始于通過口服或注射吸收到體內(nèi)。

種類：

１．

抗代謝藥物——人工合成的

２．

抗生素——微生物所產(chǎn)生的（四）、化學(xué)治療劑1、抗代謝類藥物（生長因子類似物）:概念：是指一類在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與細(xì)胞內(nèi)必要代謝物的結(jié)構(gòu)相似，并可干擾正常代謝活動(dòng)的化學(xué)物質(zhì)。如：磺胺類藥物。機(jī)理：作為細(xì)菌細(xì)胞基本生長因子的競爭性抑制劑（與相應(yīng)酶競爭性結(jié)合）而阻止微生物對生長因子的利用，因而可以抑制微生物的生長。種類：磺胺藥——對氨基本甲酸(PABA)

；

6-巰基嘌呤——嘌呤；

5-甲基色氨酸——氨基酸；異煙肼——吡哆醇只有當(dāng)正常代謝產(chǎn)物的量少或不存在時(shí)，抗代謝物才有用

對氨基苯甲酸（PABA）(正常代謝物）磺胺(代謝物拮抗物）磺胺類藥物的殺菌機(jī)制—PABA代謝類似物二氫葉酸二氫葉酸合成酶二氫葉酸還原酶四氫葉酸輔酶F核酸合成細(xì)菌體內(nèi)合成葉酸二氫蝶啶二氫蝶酸二氫蝶酸合成酶PABAGlu二氫葉酸二氫葉酸合成酶二氫葉酸還原酶四氫葉酸輔酶F核酸合成磺胺藥TMPTMP(三甲基芐二氨嘧啶)——磺胺增效劑細(xì)菌體內(nèi)葉酸合成受阻二氫蝶啶二氫蝶酸二氫蝶酸合成酶PABA假二氫葉酸2、抗生素：概念：抗生素：微生物在其生命過程中所產(chǎn)生的一類低分子量代謝產(chǎn)物，在很低濃度下就能抑制或殺死其它微生物的生長?？咕V：抗生素的作用對象有一定范圍，這種作用范圍稱該抗生素的抗菌譜。廣譜～：對多種微生物有作用（如：氯霉素、四環(huán)素）；窄譜～：僅對某一類微生物有作用（如：青霉素）作用機(jī)制：1）抑制細(xì)胞壁的合成；（如：青霉素、萬古霉素等）

2）破壞細(xì)胞膜功能；（如：多粘菌素可作用于膜磷脂使膜溶解）

3）抑制蛋白質(zhì)合成；（如：氯霉素，四環(huán)素、鏈霉素等）4）干擾核酸代謝；（如：利福霉素、新生霉素）1.抑制細(xì)胞壁合成青霉素萬古霉素桿菌肽頭孢菌素環(huán)絲氨酸TMP磺胺藥PAPB細(xì)胞膜多粘菌素短桿菌肽鏈霉素卡那霉素四環(huán)素3.抑制蛋白質(zhì)合成紅霉素氯霉素2.抑制RNA合成2.抑制DNA解旋酶諾氟沙星新生霉素主要抗生素和化學(xué)治療劑的作用模型利福霉素利福平3.抑制蛋白質(zhì)合成4.干擾細(xì)胞膜合成5.抑制細(xì)胞代謝菌體產(chǎn)生一種能使藥物失去活性的酶改變膜的透性而導(dǎo)致藥物不能透過細(xì)胞被藥物作用的部位加以修飾和改變形成救護(hù)途徑通過主動(dòng)外排系統(tǒng)把進(jìn)入細(xì)胞的藥物泵出細(xì)胞外3、微生物抗藥性對藥物的適應(yīng)性即是抗藥性。抗藥性主要表現(xiàn)（產(chǎn)生機(jī)制）抗青霉素菌株產(chǎn)生一種β內(nèi)酰胺酶，使青霉素的核心結(jié)構(gòu)中的β內(nèi)酰胺環(huán)開裂，而失去抑菌作用委內(nèi)瑞拉鏈霉菌可通過改變膜的透性，阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞大腸桿菌的突變株的30S核糖體亞基發(fā)生改變，不再與鏈霉素結(jié)合，從而使其失活即通過被藥物阻斷的代謝途徑發(fā)生變異，而能合成原來的產(chǎn)物的新途徑如抗藥菌株可產(chǎn)生某些代謝途徑，將藥物變成衍生物，該藥物衍生物的外滲速度比該藥物滲入速度更快關(guān)于表面消毒劑、化學(xué)殺菌劑或化學(xué)治療劑

的藥效和毒性的3個(gè)指標(biāo)

①最低抑制濃度(MIC)：評定某化學(xué)藥物藥效強(qiáng)弱的指標(biāo)。指在一定的條件下，某化學(xué)藥劑抑制特定微生物的最低濃度。②半數(shù)致死量(LD50)：評定某藥物毒性強(qiáng)弱的指標(biāo)。指在一定條件下，某化學(xué)藥劑能殺死50%實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)的劑量。③最低致死量(MLD)：評定某藥物毒性強(qiáng)弱指標(biāo)。

指在一定條件下，某化學(xué)藥劑能引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群體100%死亡率的最低劑量。生長及其控制純培養(yǎng)分離的方法生長的測定方法生長量的測定法細(xì)胞數(shù)目的檢測法生長規(guī)律同步培養(yǎng)的定義及方法群體生長----典型的生長曲線：定義及各個(gè)時(shí)期的特點(diǎn)生長連續(xù)培養(yǎng)影響生長環(huán)境條件溫度：嗜冷、嗜溫、嗜熱、超嗜熱菌氧氣：專性好氧菌、微好氧菌、兼性厭氧菌、耐氧菌、厭氧菌pH值：嗜堿、嗜中性、嗜酸微生物知識結(jié)構(gòu)溫度高溫滅菌（消毒）法控制干熱滅菌法焚燒法干燥熱空氣滅菌法濕熱法高壓蒸汽滅菌法煮沸消毒法間歇滅菌法巴斯德消毒法低溫抑菌冷藏法冷凍法過濾輻射：紫外線滅菌、γ射線滅菌防腐：低溫、缺氧、干燥、高滲、高酸度、防腐劑消毒防腐劑：醇類、醛類、酚類、氧化劑、重金屬鹽類、表面活性劑、鹵素及其化合物、染料、酸堿類化學(xué)治療劑抗代謝藥物抗生素作用機(jī)制抗藥性產(chǎn)生機(jī)制1、高溫對微生物的致死是因?yàn)椋海ǎ〢.高溫使菌體蛋白變性B.高溫使核酸變性C.高溫破壞細(xì)胞膜的透性D.A–C2、紫外線殺菌最強(qiáng)的波長范圍是：（）A.0.06-13.6nmB.250-280nmC.300-400nmD.450-600nm3、消毒效果最好的乙醇濃度為：（）A.50%。B.70%。C.90%D.100%4、巴氏滅菌的工藝條件是：（）A.62-63℃30minB.71-72℃30minC.60-70℃30minD.160-17℃120min5、殺