生物：1.2《基因工程的基本操作程序》課件1(新人教版選修3)

1.2基因工程的基本操作程序

原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子啟動(dòng)子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動(dòng)，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。RNA聚合酶:能夠識(shí)別啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì).(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落)①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA

聚合酶結(jié)合位點(diǎn)等。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼餐前小菜味道如何？思考：?jiǎn)?dòng)子與起始密碼子，終止子與終止密碼子是否相同，如不同有何區(qū)別？啟動(dòng)子、終止子：在

上，分別表示

的開始與結(jié)束起始密碼子、終止密碼子：在

上，分別表示

的開始與結(jié)束轉(zhuǎn)錄翻譯DNARNA1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定基因工程基本操作的四個(gè)步驟有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)。一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。2、獲取目的基因的常用方法（1）從基因文庫中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成一、目的基因的獲?。ㄒ唬幕蛭膸熘兄苯荧@取1.基因文庫：概念見P92.基因文庫的分類:按外源DNA片段的來源分類種類基因組DNA文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫3.基因文庫的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。4.獲取目的基因的根據(jù)：見課本P9(1)從基因文庫中獲取目的基因1、什么是基因文庫？2、什么是基因組文庫？3、什么是部分基因文庫？4、怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？5、目的基因的有關(guān)信息與什么相聯(lián)系？閱讀課本第9頁的相關(guān)內(nèi)容，回答以下問題自主學(xué)習(xí)(1)從基因文庫中獲取目的基因4、怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？5、目的基因的有關(guān)信息與什么相聯(lián)系？閱讀課本9頁的相關(guān)內(nèi)容，回答一下問題自主學(xué)習(xí)

基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(genelibrary)基因組文庫：基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫部分基因組文庫：基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.（如cDNA文庫）基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系2.基因文庫的構(gòu)建方法（1）鳥槍法（2）反轉(zhuǎn)錄法（3）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法人工合成法（真核生物）多用于原核生物直接分離法某種生物的單鏈mRNA單鏈互補(bǔ)DNA雙鏈cDNA片段導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存與載體連接cDNA文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄法：cDNA的合成流程圖解5.基因文庫的構(gòu)建方法之提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫5.基因文庫的構(gòu)建方法之一（1）直接分離法(鳥槍法)基因組文庫和cDNA文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動(dòng)子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以（3）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？?jī)?yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)鳥槍法反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡(jiǎn)便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來的有時(shí)并非一個(gè)基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)操作過程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高專一性最強(qiáng)僅限于合成核苷酸對(duì)較少的簡(jiǎn)單基因思考：如何從基因文庫中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列；基因的功能；基因在染色體上的位置；基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA；

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。注意：基因文庫中不是直接保管相應(yīng)基因，而是保存受體菌，菌中含基因。

概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段原理：DNA復(fù)制2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③前提：_______________________②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA雙鏈復(fù)制指數(shù)2n要有一段已知目的基因的核苷酸序列自主學(xué)習(xí)閱讀課本P10-P11頁的相關(guān)內(nèi)容，回答一下問題（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因四種脫氧核苷酸(dNTP)

一對(duì)引物：熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(需含有目的基因

)

Mg2+(激活劑)條件：緩沖溶液一對(duì)寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補(bǔ)一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物前提：1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束

過程高溫變性（解旋為單鏈）低溫退火（引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合）適溫延伸（在Taq酶的作用下合成與模板互補(bǔ)的DNA雙鏈）重復(fù)循環(huán)預(yù)變性（增加DNA變性的概率）2、具體過程PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) ⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原理原料條件不同點(diǎn)解旋方式場(chǎng)所酶結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心問題1．為何要構(gòu)建基因表達(dá)載體？

問題2．作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？問題3．基因表達(dá)載體的構(gòu)建需要哪些工具酶，如何將目的基因與運(yùn)載體連接起來形成重組DNA分子（以質(zhì)粒為運(yùn)載體）？問題4．將目的基因與載體混合并用DNA連接酶處理后，會(huì)出現(xiàn)幾種結(jié)果，怎樣從中篩選處所需要重組質(zhì)粒？

小組討論：二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建

——基因工程的核心1、目的：所需物質(zhì)：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。它們各自的作用是什么?2、基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因它們各自的作用是什么?啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少④目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。注意三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化：（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞－轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)感受態(tài)法受體細(xì)胞植物cell動(dòng)物cell原核cell植物腫瘤③過程：④優(yōu)點(diǎn):比較經(jīng)濟(jì)和有效適用于雙子葉植物裸子植物種子植物裸子植物被子植物雙子葉植物單子葉植物:松、柏、杉…:花生、大豆、棉花…:水稻、小麥、玉米…雙子葉植物－網(wǎng)狀脈單子葉植物－平行脈適用于單子葉植物基因槍法（2）基因槍法（3）花粉管通道法適用于被子植物2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞①方法：顯微注射法②程序：目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動(dòng)物顯微注射技術(shù)3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少②方法：

用Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子四、目的基因的檢測(cè)與鑒定——檢查是否成功（一）、檢測(cè)1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因(關(guān)鍵步驟)①.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針③.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中（1）方法:DNA分子雜交（2）過程:歸納步驟DNA分子雜交示意圖

采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。P15思考與探究（二）、鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）2、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等①方法:分子雜交方法:抗原抗體雜交②過程:

用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的

處，DNA連接酶作用于

處。（填“a”或“b”）aa練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和

法。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用

技術(shù)，該技術(shù)的核心是

和

。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的

作探針進(jìn)行分子雜交檢測(cè)，又要用

方法從個(gè)體水平鑒定水稻植株的耐鹽性?；驑尫ǎɑǚ酃芡ǖ婪ǎ┲参锝M織培養(yǎng)脫分化和再分化耐鹽基因一定濃度鹽水澆灌1）以下說法正確