乙肝表面抗原ELISA法定量分析方法學(xué)驗證

乙肝表面抗原的ELISA法定量解析方法學(xué)考據(jù)大綱目的：對福州宏圖生物工程有限公司生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量解析試劑盒進(jìn)行方法學(xué)考據(jù)，以判斷可否能用于臨床樣本解析。方法：ELISA法定量解析，應(yīng)用試劑盒HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品從濃度為8ng/ml做2倍稀釋的6個濃度梯度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以6，3，個濃度梯度5復(fù)孔做正確度，精美度和檢測限等方法學(xué)考據(jù)。結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線，正確度97.07%的RSD為16.78%，不滿足ng/ml級水平的RSD一般應(yīng)<15%的要求，檢測限LOD為，低濃度樣品（）的檢測在正確性和精美度方面都低于高濃度樣品，不適合低濃度樣品的檢測。結(jié)論：該HBsAg的ELISA法定量解析試劑盒不能夠用于臨床標(biāo)本的解析。要點詞：乙肝表面抗原ELISA定量解析方法學(xué)考據(jù)、八 、■前言乙肝病毒感染是我國最常有的感染性疾病之一，而乙型肝炎血清標(biāo)志物是檢測乙肝病毒感染最主要的病原標(biāo)志。隨著免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，抗原抗體檢測矯捷度明顯提高，使低水平乙肝病毒得以檢出，對臨床診斷及流行病學(xué)有重要意義 [1]。ELISA法擁有較高靈敏度、特異性強、重復(fù)性好、可進(jìn)行定量和半定量測定等優(yōu)點，能夠在酶免疫解析儀上做批量檢測。目前臨床上多傾向于做定量解析，若想知道檢驗結(jié)果可否可靠，實驗室則必定對所用試劑盒進(jìn)行方法學(xué)考據(jù)，本實驗對福州宏圖生物工程有限公司生產(chǎn)的 HBsAg的ELISA法定量解析試劑盒進(jìn)行正確度，精美度和檢測限等方法學(xué)考據(jù)，現(xiàn)報告以下。1.資料與方法試劑盒乙肝表面抗原ELISA法定量解析試劑盒，福州宏圖生物工程有限公司出品。儀器酶標(biāo)儀：Bio-Rad680；洗板機：Bio-Rad1575；超純水系統(tǒng)：MilliporeElix；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052)上海精宏實驗設(shè)備有限公司；振蕩器(蘇州管械， KJ-201A)；移液器；Tip頭；EP管。方法1.3.1．溶液配置1XPBS緩沖液的配置： 稱取8gNaCl、0.2gKC1、Na2HPO4和0.24gKH2PO4，溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)治溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L即可。標(biāo)準(zhǔn)品的配置：原始標(biāo)準(zhǔn)品濃度為8ng/ml。。取6個2mlEP管，分別標(biāo)志為S1-S6。50ul/well,共1孔需50ul，每孔配置60ul備用，依據(jù)下表稀釋方案進(jìn)行稀釋。表1標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋方案質(zhì)控品的配置：50ul/well,共5復(fù)孔需250ul，配置300ul備用，取3個2mlEP管，分別標(biāo)志為C1,C2,C3，依據(jù)下表稀釋方案進(jìn)行稀釋。表2質(zhì)控品的稀釋方案1.3.2．鋪板方案取出試劑盒中已包被酶標(biāo)板，取出板條，依據(jù)下表鋪板方案進(jìn)行鋪板在相應(yīng)孔中依次加入系列標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品及空白比較，每孔50ul。空白比較加入1XPBS緩沖液。表3鋪板方案1.3.3．加樣步驟加入酶標(biāo)抗體，50ul/well ，震蕩。37°C電熱恒溫培養(yǎng)箱溫育60min，取出后洗板4次，加入A、B液,50ul/well，37C電熱恒溫培養(yǎng)箱溫育15min。加入停止液，50ul/well。酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀，蓋上蓋子，在電腦上打開 軟件，選擇450nm波長(參照波長630nm)，設(shè)置LAYOUT和報告模式，測定各孔吸取值。2.結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍標(biāo)準(zhǔn)品理論濃度對應(yīng)的實測OD值表4實測OD值以HBsAg理論濃度為橫坐標(biāo)，所測OD值為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線觀察線性關(guān)系，結(jié)果顯示，顯示擁有優(yōu)異的相關(guān)性Absorbance(OD)Conc(ng/ml)圖1線性關(guān)系圖正確度(回收率)的考據(jù)質(zhì)控品理論稀釋濃度對應(yīng)實測濃度值表5實測濃度值質(zhì)控品做了3個濃度梯度，每個濃度做了5個復(fù)孔，下表是對每個濃度梯度進(jìn)行正確度(回收率)的考據(jù)。表6正確度的考據(jù)結(jié)果顯示HBsAg6ng/ml和3ng/ml的平均回收率為97.58%，113.07%，滿足限度要求在85%-115%的范圍內(nèi)，而的平均回收率為80.56%，滿足方法定量限在80%-120%的范圍內(nèi)3個濃度梯度的平均回收率為97.7%，顯示正確性好。2.3精美度的考據(jù)板內(nèi)精美度的考據(jù)上表中RSD(%)這一參數(shù)表示相對標(biāo)準(zhǔn)誤差，也就是變異系數(shù) CV值，HBsAg6ng/ml的5個復(fù)孔的變異系數(shù)CV值為12.73%，顯示孔間差異較大，精美度不高，但是也吻合ng/ml級RSD水平的一般應(yīng)<15%的要求，其中有一孔濃度為4.55，與其他孔比較差異較大，可能是由于操作引起比方加樣嚴(yán)禁。而3ng/ml,和的變異系數(shù)CV為3.5%，3.7%，吻合顯示孔間重復(fù)性好，吻合ng/ml級RSD水平的一般應(yīng)<15%的要求，精美度高。板間精美度的考據(jù)從同一實驗室中獲得2組同樣的數(shù)據(jù)，做板間精美度的考據(jù)。第一對同一實驗條件下不同樣實驗人員所獲得的數(shù)據(jù)可否可用于板間解析做考據(jù)。表8板間精美度的考據(jù)以HBsAg理論濃度為橫坐標(biāo)，所測OD值為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線觀察線性關(guān)系。Absorbance(OD)Conc(ng/ml)圖2線性關(guān)系曲線以上標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示第二組數(shù)據(jù)的R2=0.967，第三組數(shù)據(jù)R2=0.991。第二組數(shù)據(jù)由于有一些孔與標(biāo)準(zhǔn)曲線偏離較大，但考慮到隨機抽樣與均數(shù)存在必然誤差，還是能夠用于統(tǒng)計學(xué)解析。下表對3組數(shù)據(jù)做板間解析。從表中3個組的數(shù)據(jù)比較可知，HBsAg6ng/ml和3ng/ml的RSD分別為9.10%，12.06%滿足對ng/ml級水平的RSD一般應(yīng)<15%的要求，精美度高。而的RSD為16.78%，不滿足ng/ml級水平的RSD一般應(yīng)<15%的要求，顯示低濃度的孔間重復(fù)性差，精美度不是很高，故以下對HBsAg理論濃度為的三組數(shù)據(jù)做解析。對HBsAg理論濃度為的正確性，精美度解析表9精美度解析從上表可知第一組數(shù)據(jù)和第三組數(shù)據(jù)正確性差，精美度高。而第二組數(shù)據(jù)正確性高，而精美度有對于第一組和第三組數(shù)據(jù)要好。綜上對于HBsAg理論濃度為的這一低濃度梯度的板內(nèi)正確性和板間精美度有對于高濃度的線性要差一些。檢測限（LOD）計算LOD為取空白孔的OD值的均數(shù)加2倍標(biāo)準(zhǔn)差。表10空白孔的OD值由上表可知，LOD為0.172。檢測限（LOD）表示解析方法檢測低濃度樣品的能力，也稱為方法的矯捷度，LOD平時為標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點，要求標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點應(yīng)>LOD，此標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低濃度點為0.25，大于LOD（0.172），故此標(biāo)準(zhǔn)曲線線性好。3.談?wù)撘腋伪砻婵乖拷馕龅囊饬x乙肝表面抗原是乙肝兩對半的其中一項，乙肝兩對半定性檢測對乙肝疾病的診斷，病情監(jiān)測，療效觀察起到了必然的作用。但隨著臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展，乙肝兩對半定性檢測已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能夠滿足臨床及患者的要求，特別是在療效觀察以及乙肝疫苗注射后抗體產(chǎn)生情況的觀察上有明顯的不足。隨著檢驗醫(yī)學(xué)的發(fā)展，乙肝兩對半定量測定成為可行，大大填充了乙肝兩對半定性檢測的不足。而且乙肝兩對半定量檢測可與HBVDNA熒光測定相互補充，綜合談?wù)摶颊卟∏榕c藥物療效，為低含量的慢性乙肝、病毒攜帶者供應(yīng)了正確判斷病情的依據(jù)。這在目前的臨床治療中應(yīng)用十分寬泛。常用定量解析方法此次實驗可是對一種試劑盒的可用性進(jìn)行方法學(xué)考據(jù)，而目前常用的定量方法已有很多，如TRFIA，TRFIA法又稱解離增強鑭系熒光免疫解析，是近十年發(fā)展起來的一種微量解析方法。此技術(shù)集酶標(biāo)志、同位素標(biāo)志技術(shù)的優(yōu)點于一身，擁有矯捷度高、特異性強、穩(wěn)定性好，且測定范圍更寬，試劑盒貨架壽命長，操作簡略和非放射性等特點，成為最有潛力的一種標(biāo)志免疫解析方法【3】。全自動酶免解析儀目前也寬泛應(yīng)有，自動化、標(biāo)準(zhǔn)化的操作手段使實驗達(dá)到了全過程控制和全過程標(biāo)準(zhǔn)化解析，大大提高了實驗的精美度【4】，使檢測結(jié)果更趨牢固，從而保證了實驗結(jié)果的可靠性。方法歸納目前寬泛使用的HBsAg試劑盡管在制備時采用了高親和力的單克隆抗體，而且使包被

抗體、酶標(biāo)抗體的結(jié)合位點盡可能的遠(yuǎn)。以防備競爭控制，最大程度地解決鉤狀效應(yīng)（HOOK）的問題【5】。本次實驗是對實驗室的一種試劑盒，即福州宏圖生物工程有限公司生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量解析試劑盒進(jìn)行方法學(xué)考據(jù)，以判斷可否能用于臨床樣本解析。試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗。往起初包被 HBsAg捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本，標(biāo)準(zhǔn)品，HRP標(biāo)志的檢測抗體，經(jīng)過溫育并完整沖洗。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物的催化下轉(zhuǎn)變成藍(lán)色，并在酸的作用下最后轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。顏色的深淺和樣品中得HBsaAg呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度OD值，計算樣品濃度。應(yīng)用試劑盒HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品從濃度為8，4，2，1,0.5，個濃度梯度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以6，3，個濃度梯度5復(fù)孔做質(zhì)控，進(jìn)行正確度，精美度和檢測限等方法學(xué)考據(jù)。選擇最低濃度為的原因是由于，絕大多數(shù)HBV感染者外周血中可出現(xiàn)HBsAg，含量在5ng/ml?600ug/ml之間，高者可達(dá)2000ug／ml以上【6】，滿足了現(xiàn)階段文件報道的最低濃度值。方法學(xué)考據(jù)內(nèi)容方法學(xué)考據(jù)內(nèi)容一般包括標(biāo)準(zhǔn)曲線，正確度，精美度和檢測限。標(biāo)準(zhǔn)曲線亦稱校正曲線，系指生物樣品中所測定的樣品濃度與響應(yīng)的相關(guān)性，平時用回歸解析方法所得的回歸方程來評件，此實驗所用了6個濃度點建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法正確度指待測濃度與真實濃度的湊近值了，一般用相對回收率表示，限度要求在85%—115%的范圍內(nèi)。精美度則表示解析方法的可重復(fù)性，是對同同樣品每次測定結(jié)果的一致性，用標(biāo)準(zhǔn)誤差和相對標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，可做板內(nèi)和板間的考據(jù)，對于ug/ml級水平的相對標(biāo)準(zhǔn)誤差一般應(yīng)<10%,ng/ml級水平的相對標(biāo)準(zhǔn)誤差一般應(yīng)<15%。檢測限則表示解析低濃度樣品的能力，平時又稱為矯捷度。結(jié)果解析及應(yīng)用談?wù)摰谝唤M數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示擁有優(yōu)異的相關(guān)性，HBsAg濃度為6ng/ml和3ng/ml的回收率分別為為97.58%，吻合113.07%，吻合限度要求在85%—115%的范圍內(nèi)。但是HBsAg濃度為.5ng/ml的回收率為80.56%，顯示此試劑盒對于低濃度樣品的檢測正確度差。在精美度方面，6，3，變異系數(shù)CV分別為12.73%，3.69%，3.50%，而HBsAg6ng/ml的5個復(fù)孔的變異系數(shù)CV值為12.73%，顯示孔間差異較大，精美度不高，但是也吻合ng/ml級RSD水平的一般應(yīng)<15%的要求，其中有一孔濃度為4.55，與其他孔比較差異較大，可能是由于操作引起比方加樣嚴(yán)禁不屬于試劑盒的問題，故能夠認(rèn)為此試劑盒對于批內(nèi)高、低濃度樣品的檢測精美度還是能夠的。在做3個組數(shù)據(jù)的批間的精美度解析時，發(fā)現(xiàn)6，3，變異系數(shù)CV分別9.10%，12.06%，16.78%，分布方式從低到高，前2個濃度滿足對ng/ml級水平的RSD一般應(yīng)<15%的要求。的RSD為16.78%，不滿足ng/ml級水平的RSD一般應(yīng)<15%的要求，顯示低濃度的孔間重復(fù)性差，精美度不是很高。綜上解析，該試劑盒對于高濃度樣品的檢測擁有優(yōu)異的正確性和較高的精美度，而對于低濃度樣品()的檢測在正確性和精美度方面都低于高濃度樣品，不適合低濃度樣品的檢測。目前絕大多數(shù)HBV感染者外周血HBsAg濃度很低，該試劑盒不能夠全面檢測出此類人群，故該試劑盒不能夠用于臨床標(biāo)本的檢測。參照文件參照文件【1】魏來，陶其敏．努力規(guī)范肝臟疾病的免疫學(xué)診斷．中華檢驗雜志， 2003，26：69—71【2】劉曉梅，張世蘭．HBsAg陰性結(jié)果的慢性乙型肝炎患者病毒血癥水平與臨床的關(guān)系[J】．臨床檢驗雜志，2004，22(5)：381-382．

【3】李輝霞，王德志，楊朋，乙肝兩對半定量檢測及臨床意義，醫(yī)學(xué)信息雜志23(9)?！?】WeberB,DenglerT,BergerA.Evaluationoftw