第十三章-分光光度法

第十三章分光光度法第一節(jié)概述分光光度法是利用被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)對(duì)光的選擇性吸收特性而建立的一種分析方法，屬于光譜分析法。分類：根據(jù)測定的光的波長分紫外分光光度法可見分光光度法紅外分光光度法特點(diǎn)：靈敏度高，適用于微量或痕量組分的分析操作簡單、準(zhǔn)確度較高、重現(xiàn)性好、應(yīng)用范圍廣一、光的性質(zhì)與波長范圍光是一種電磁波，具有波粒二象性，即波動(dòng)性和粒子性。光在傳播時(shí)表現(xiàn)了光的波動(dòng)性一定的光波具有一定的波長、頻率、光速c等參數(shù)來描述：

c=

光的性質(zhì)續(xù)前：波長：相鄰兩波峰或波谷之間的距離，波長的單位可用納米（nm），微米（um）表示：1nm=10-3um=10-6mm=10-7cm=10-9m頻率（

）：是每秒內(nèi)光波的振動(dòng)次數(shù)，單位是赫茲（Hz）續(xù)前光又具有粒子性，是由一顆一顆不連續(xù)的光子構(gòu)成的粒子流，這種粒子叫光子，是量子化的。光子的能量（E）取決于頻率，其關(guān)系為：

E=h=hc/

（h為普朗克常數(shù)：h=6.626×10-34J·S)可見：光的波長越短（頻率越高），其能量越大。光的分類單色光：僅含某一種波長的光復(fù)合光：不同波長的光組合而成。如白光。物質(zhì)對(duì)光的吸收具有選擇性，若溶液選擇性地吸收了某種顏色的光，則溶液呈吸收光的互補(bǔ)光。波長范圍：可見光區(qū)：400-760nm復(fù)合光紫外光區(qū)：近紫外區(qū)200-400nm

遠(yuǎn)紫外區(qū)100-200nm

紅外光區(qū)：0.76~500um

近紅外區(qū)：0.76~2.5um

中紅外區(qū)：2.5~50um

遠(yuǎn)紅外區(qū)：50~500um二、分子吸收光譜的產(chǎn)生分子運(yùn)動(dòng)包括：分子外層的價(jià)電子運(yùn)動(dòng)——電子能級(jí)分子內(nèi)原子在平衡位置附近的振動(dòng)——振動(dòng)能級(jí)分子繞重心軸的轉(zhuǎn)動(dòng)——轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)分子能量：電子能量、振動(dòng)能量、轉(zhuǎn)動(dòng)能量之和

E電>E振>E轉(zhuǎn)

高能級(jí)的運(yùn)動(dòng)中包括低能級(jí)的運(yùn)動(dòng)續(xù)前當(dāng)用一定波長的光線照射試樣時(shí)，其分子選擇吸收了某些具有特定波長（或頻率）的光子后，由較低能級(jí)（基態(tài)）躍遷到較高能級(jí)（激發(fā)態(tài)）時(shí)，所吸收光子的能量正好等于躍遷前后的能級(jí)差。把分子吸收能量隨波長變化的情況記錄下來所得的圖譜為吸收光譜。利用物質(zhì)的吸收光譜進(jìn)行定性、定量及結(jié)構(gòu)分析的方法稱為吸收光譜法，簡稱光譜法。三、光的吸收定律（一）百分透光率（T）和吸收度（A）入射光I0→吸收Ia→透射ItI0=Ia+It

透光率（描述入射光透過溶液的程度）

T=It/I0或T%=It/I0×100%

透光率的負(fù)對(duì)數(shù)稱為吸光度，用符號(hào)A表示。吸光度A=-lgT=lg

I0/ItA愈大，溶液對(duì)光的吸收愈多。（二）朗伯-比爾定律當(dāng)一束平行的單色光通過均勻、無散射現(xiàn)象的溶液時(shí)，在單色光強(qiáng)度、溶液的溫度等條件不變的情況下，溶液對(duì)光的吸收度與溶液的濃度及液層厚度的乘積成正比。A=－lgT=ECL

朗伯-比爾定律適用于無色溶液、有色溶液及氣體和固體的非散射均勻體系。（三）吸收系數(shù)吸光物質(zhì)在單位濃度、單位液層厚度時(shí)的吸收度。當(dāng)溶液的濃度C的單位不同時(shí)，吸收系數(shù)的意義和表示方法也不同，常用的表示方法有兩種：1、摩爾吸收系數(shù)：是指在一定波長下，溶液濃度為1mol/L，液層厚度為1cm時(shí)的吸收度，用ε表示。2、百分吸收系數(shù)：是指在一定波長下，溶液濃度為1%（g/ml），液層厚度為1cm時(shí)的吸收度，表示。續(xù)前百分吸收系數(shù)與摩爾吸收系數(shù)之間的關(guān)系是：吸收系數(shù)是物質(zhì)的特性常數(shù)，表明物質(zhì)對(duì)某一特定波長光的吸收能力。不同物質(zhì)對(duì)同一波長的單色光有不同的吸收系數(shù)，吸收系數(shù)越大，表明吸光能力越強(qiáng)，靈敏度越高，所以吸收系數(shù)是物質(zhì)定性和定量分析的依據(jù)。四、吸收光譜吸收光譜又稱吸收曲線，是在濃度一定的條件下，以波長（λ）或波數(shù)（δ）為橫坐標(biāo)，以吸收度（A）為縱坐標(biāo)所描繪的曲線。吸收峰最大吸收波長λmax

吸收谷最小吸收波長λmin

肩峰λsh

末端吸收續(xù)前λmax、λmin、λsh及整個(gè)吸收光譜的形狀取決于物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，可作為定性分析的依據(jù)。同一物質(zhì)的吸收光譜應(yīng)有相同的λmax、λmin、λsh；而且在相同濃度時(shí)，同一物質(zhì)的吸收曲線應(yīng)相互重合。第二節(jié)紫外-可見分光光度法一、基本原理物質(zhì)分子受到紫外-可見光的照射，選擇吸收某些適宜能量的光子后，其原子的外層電子（成鍵電子、未成鍵電子）由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，在相應(yīng)波長的位置出現(xiàn)吸收所形成的光譜，稱為紫外-可見吸收光譜。適用范圍：分子中含有芳環(huán)或共軛雙鍵的有機(jī)藥物，在紫外光區(qū)有特征吸收外觀有顏色的藥物在可見光區(qū)有特征吸收都可用紫外-可見分光光度法進(jìn)行分析。儀器可見分光光度計(jì)721型分光光度計(jì)儀器紫外-可見分光光度計(jì)一、基本組成光源單色器樣品室檢測器顯示器1.光源

在整個(gè)紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。

可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在350～1000nm。

紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射200～360nm的連續(xù)光譜。

2.單色器

將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任波長單色光的光學(xué)系統(tǒng)。①入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器；②準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。3.樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。4.檢測器

利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號(hào)變成可測的電信號(hào)，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。5.結(jié)果顯示記錄系統(tǒng)

檢流計(jì)、數(shù)字顯示、微機(jī)進(jìn)行儀器自動(dòng)控制和結(jié)果處理二、分光光度計(jì)的類型1.單光束

簡單，價(jià)廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。2.雙光束

自動(dòng)記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價(jià)格較高。3.雙波長

將不同波長的兩束單色光(λ1、λ2)快速交替通過同一吸收池而后到達(dá)檢測器。產(chǎn)生交流信號(hào)。無需參比池?！?1～2nm。兩波長同時(shí)掃描即可獲得導(dǎo)數(shù)光譜。三種分光光度計(jì)的比較721型分光光度計(jì)的使用第三節(jié)藥物分析中含量測定和微量雜質(zhì)的檢查紫外可見分光光度法是藥物分析中的一種重要的方法，常用語藥物鑒別、檢查和含量測定（一）定性鑒別根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜特征，如吸收光譜的形狀、最大吸收波長、吸收峰數(shù)目、各吸收峰的位置，強(qiáng)度和相應(yīng)的吸收系數(shù)等進(jìn)行分析。1、比較光譜的一致性兩個(gè)化合物相同，在相同的條件下測出的吸收光譜應(yīng)完全相同。具體做法：（1）樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在完全相同的情況下，分別測出吸收光譜，比較二者光譜是否一致（2）沒有標(biāo)準(zhǔn)品，用標(biāo)準(zhǔn)光譜圖對(duì)歸照比較，二者吸收光譜一致，可初步斷定是同一化合物。注意：結(jié)構(gòu)完全相同的物質(zhì)，其吸收光譜完全一致，但吸收光譜完全相同的物質(zhì)卻不一定是同一物質(zhì)。

2、比較吸收光譜特征數(shù)據(jù)的一致性常用最大吸收波長和吸收系數(shù)不同的化合物，可有相同的最大吸收波長，但因分子量不同，其百分吸收系數(shù)有明顯的差異。3、比較吸收度或吸收系數(shù)比值的一致性適用于吸收峰較多的藥物，各吸收峰對(duì)應(yīng)的吸收度或吸收系數(shù)的比值是一定的，可作為鑒別的標(biāo)準(zhǔn)。用分光光度法進(jìn)行鑒別時(shí)的要求:

儀器必須按要求嚴(yán)格校正合格后方可使用樣品的純度必須達(dá)到要求才能測定一、含量測定1、吸收系數(shù)法：（1）利用待測物質(zhì)的吸收系數(shù)與測得的一定濃度時(shí)的吸收度比較計(jì)算含量的方法，又稱絕對(duì)法。根據(jù)朗伯-比爾定律A=ECL，得：例1已知維生素B12在361nm處的E值是207，現(xiàn)測得維生素B12水溶液的吸收度為0.414，吸收池厚度為1cm，求該溶液的濃度。解：即該溶液的濃度為0.002%（g/ml），即100ml維生素B12水溶液中含維生素B120.002g。1、吸收系數(shù)法：（2）按各品種項(xiàng)下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長處測定其吸光度，再以該品種在規(guī)定條件下的標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收系數(shù)計(jì)算含量。例2精密稱取維生素B12供試品25.0mg，加水溶解并稀釋制成1000ml，于1cm厚的吸收池中，在361nm處測得吸收度為0.507，按C68H88CoN14O14P的為207計(jì)算，求維生素B12的含量百分比。

解：2、標(biāo)準(zhǔn)曲線法是分光光度法中最經(jīng)典的方法。特點(diǎn)：對(duì)儀器要求不高，是分光光度法中簡便易行的方法。步驟：（1）標(biāo)準(zhǔn)系列：先用于待測物質(zhì)組分相同的標(biāo)準(zhǔn)品，配成一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同條件下，分別測定其吸收度。（2）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以濃度C為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸收度A為縱坐標(biāo)，繪制A-C曲線，稱為工作曲線。（3）查找：在相同條件下，測出供試品溶液的吸收度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上便可查出與此吸收度值相應(yīng)的供試品溶液的濃度。注意事項(xiàng)：1、標(biāo)準(zhǔn)系列的數(shù)目應(yīng)在四個(gè)伊桑2、注明時(shí)間、測定項(xiàng)目和條件3、條件發(fā)生改變時(shí)，應(yīng)重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線3、對(duì)照品比較法在相同條件下，配制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品和供試品溶液，在選定的波長處分別測定吸收度A標(biāo)和A供。根據(jù)：A標(biāo)=EC標(biāo)LA供=EC供L

標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品與供試品是同一種物質(zhì)，在同一儀器、同一波長下測定，因此L和E相等。例3精密稱取奧沙西泮供試品與對(duì)照品各15mg，加乙醇溶解并稀釋至200ml，再精密量取5ml，置100ml量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，在229nm波長處測定吸收度分別為：A供=0.462，A標(biāo)=0.470，求奧沙西泮的含量。解：供試品與標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下配制與測定，C標(biāo)=C原續(xù)前優(yōu)點(diǎn)：對(duì)照法采用對(duì)照品與供試品平行操作的方式，具有消除儀器與方法誤差的優(yōu)點(diǎn)，是中國藥典中采用較多的方法。二、微量雜質(zhì)的檢查方法雜質(zhì)：任何影響藥品純度的物質(zhì)均稱雜質(zhì)，可在生產(chǎn)中或運(yùn)輸中產(chǎn)生雜質(zhì)檢查也叫純度檢查藥物中微量雜質(zhì)的檢查方法較多用比色法和分光光度法

（一）、比色法常用來檢查無機(jī)雜質(zhì)離子。應(yīng)用：利用雜質(zhì)離子與其他物質(zhì)生成有色物質(zhì)或生成難溶物使得溶液渾濁，再與標(biāo)準(zhǔn)品比較。目視比色法是用眼睛辨別、比較供試品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的顏色深