遺傳多樣性的分子檢測詳解演示文稿

遺傳多樣性的分子檢測詳解演示文稿第一頁，共三十三頁。優(yōu)選遺傳多樣性的分子檢測第二頁，共三十三頁。

遺傳多樣性的表現(xiàn)形式是多層次的，可以從形態(tài)特征、細胞學特征、生理特征、基因位點及DNA序列等不同的方面來體現(xiàn)，其中DNA多樣性是遺傳多樣性的本質(zhì)。遺傳多樣性的表現(xiàn)層次第三頁，共三十三頁。

對遺傳多樣性的系統(tǒng)研究始于十九世紀，達爾文在《物種起源》中用大量資料和證據(jù)揭示出生物中普遍存在的變異現(xiàn)象，并發(fā)現(xiàn)大部分變異有遺傳現(xiàn)象，他把這種可遺傳的變異稱為多樣性。隨著孟德爾遺傳定律的重新發(fā)現(xiàn)，摩爾根染色體遺傳學及后來發(fā)展的細胞遺傳學的誕生為群體遺傳理論的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎并提供了科學的實驗依據(jù)，充分證實了自然界中確實存在大量的遺傳變異。遺傳多樣性的研究第四頁，共三十三頁。

隨著生物學理論和技術(shù)的不斷進步，以及實驗條件和方法的不斷改進，檢測遺傳多樣性的方法日益成熟和多樣化，可以從不同的角度和層次來揭示物種的變異。遺傳標記（geneticmarkers）的發(fā)展經(jīng)歷了形態(tài)學標記（morphologicalmarkers）、細胞學標記（cytologicalmarkers）、生物化學標記（biochemicalmarkers）和分子標記（molecularmarkers）4各階段。第五頁，共三十三頁。廣義的分子標記是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。狹義的分子標記是指以DNA多態(tài)性為基礎的遺傳標記。

形態(tài)學標記、細胞學標記和同工酶標記都是基因表達的結(jié)果，是對基因的間接反映，標記數(shù)目有限、多態(tài)性差。DNA分子標記是以個體間核苷酸序列差異為基礎的遺傳標記，是DNA水平上遺傳變異的直接反映，能更準確的揭示種、變種、品種、品系乃至無性系間的差異。DNA分子標記第六頁，共三十三頁。DNA標記的優(yōu)越性較高的可靠性，直接以DAN的形式表現(xiàn)，不受環(huán)境因素、取樣部位和發(fā)育階段的影響，不存在基因表達與否的問題；數(shù)量多，遍及整個基因組；多態(tài)性高，自然存在著許多變異；表現(xiàn)為“中性”，不影響目的基因的表達，與不良性狀無必然的連鎖；有許多分子標記表現(xiàn)為共顯性，能夠鑒別純合基因型與雜合基因型。第七頁，共三十三頁。根據(jù)依賴的技術(shù)手段的不同，DNA分子標記可分為3大類：第一類是以雜交技術(shù)為基礎的分子標記，如限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）標記、數(shù)目可變串聯(lián)重復多態(tài)性（VNTR）標記；第二類是基于PCR技術(shù)為基礎的分子標記，如隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）標記、任意RCP（AP-PCR）標記、DNA指紋（DAF）標記、序列特征化擴增區(qū)域（SCAR）標記、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）標記、簡單重復序列（SSR）標記、內(nèi)部簡單重復序列（ISSR）標記等；第三類是基于測序和DAN芯片技術(shù)為基礎的分子標記，如表達序列標簽（EST）標記和單核苷酸多態(tài)性（SNP）標記等。第八頁，共三十三頁。理想的DNA分子標記應具備的特點遺傳多樣性高共顯性遺傳在基因組中大量存在且分布均勻表現(xiàn)為“中性”，對目標性狀表達無不良影響，與不良性狀無必然連鎖穩(wěn)定性、重現(xiàn)性高信息量大，分析效率高檢測手段簡單快捷，易于實現(xiàn)自動化開發(fā)成本和使用成本低第九頁，共三十三頁。

RFLP是最早發(fā)展的分子標記，用已知的限制性內(nèi)切酶消化從生物體中提取的DNA，經(jīng)過電泳、印跡、探針雜交，最后用放射自顯影顯色或發(fā)光分析顯示與探針互補的DNA片段，因為每種限制酶只識別專一的堿基序列，DNA序列的變化就會導致酶切位點的減少或增加，限制性片段的長度發(fā)生變化從而顯示多樣性。

限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）標記第十頁，共三十三頁。第十一頁，共三十三頁。RFLP標記特點：呈孟德爾遺傳，不受環(huán)境影響；RFLP標記等位基因之間呈共顯性；非等位的RFLP標記之間不存在上位效應及其它形式的基因互作；結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復性好。RFLP標記的缺點：分析程序復雜，技術(shù)難度大，費時，成本高，需要適合的探針和放射性同位素，而且每次反應需要的DNA量較大，多態(tài)性位點數(shù)目有限，所以應用受一定的限制。第十二頁，共三十三頁。

RAPD技術(shù)是由Williams和Welsh領導的兩個小組同時提出的，Williams稱之為RAPD，Welsh稱之為AP-PCR。它是利用一個隨機序列的寡核苷酸引物，通常為10個核苷酸，以基因組DNA作為模板進行PCR擴增反應，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA序列的多態(tài)性。

隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）標記第十三頁，共三十三頁。RAPD優(yōu)點：1)不需要了解研究對象基因組的任何序列，只需很少純度不高的模板，就可以檢測出大量的信息。2)無需專門設計反應引物，隨機設計長度為8-10個堿基的核苷酸序列就可應用。3)操作簡便，不涉及分子雜交、放射自顯影等技術(shù)。4)需要很少的DNA樣本。5)不受環(huán)境、發(fā)育、數(shù)量性狀遺傳等的影響，能夠客觀地提示供試材料之間DNA的差異。第十四頁，共三十三頁。RAPD局限性：它呈顯性遺傳標記（極少數(shù)共顯性），不能有效區(qū)分雜合子和純合子。易受反應條件的影響，某些情況下，重復性較差，可靠性較低，對反應的微小變化十分敏感。如聚合酶的來源，DNA不同提取方法，Mg2+離子濃度等都需要嚴格控制。第十五頁，共三十三頁。AFLP是1993年荷蘭科學家Zbaeau和Vos發(fā)展起來的一種檢測DNA多態(tài)性的新方法。AFLP是RFLP與PCR相結(jié)合的產(chǎn)物，其基本原理是先利用限制性內(nèi)切酶水解基因組DNA產(chǎn)生不同大小的DNA片段，再使雙鏈人工接頭的酶切片段相邊接，作為擴增反應的模板DNA，然后以人工接頭的互補鏈為引物進行預擴增，最后在接頭互補鏈的基礎上添加1-3個選擇性核苷酸作引物對模板DNA基因再進行選擇性擴增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測獲得的DNA擴增片段，根據(jù)擴增片段長度的不同檢測出多態(tài)性。

擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）標記第十六頁，共三十三頁。第十七頁，共三十三頁。AFLP分子標記的特點DNA需要量少，檢測效率高，理論上可產(chǎn)生無限多的AFLP標記。一個0.5mg的DNA樣品可做4000個反應。由于AFLP分析可采用多種不同類型的限制性內(nèi)切酶及不同數(shù)目的選擇性堿基，因此理論上AFLP可產(chǎn)生無限多的標記數(shù)并可覆蓋整個基因組。多態(tài)性高。AFLP分析可以通過改變限制性內(nèi)切酶和選擇性堿基的種類與數(shù)目，來調(diào)節(jié)擴增的條帶數(shù)，具有較強的多態(tài)分辨能力。第十八頁，共三十三頁。AFLP分子標記的特點可靠性好，重復性高。AFLP分析采用特定引物擴增，退火溫度高，使假陽性降低，可靠性增高。AFLP標記在后代中的遺傳和分離中遵守孟德爾定律；種群中的AFLP標記位點遵循Hardy-Weinberg平衡。對DNA模板質(zhì)量要求高，對其濃度變化不敏感。AFLP反應對模板濃度要求不高，在濃度相差1000倍的范圍內(nèi)仍可得到基本一致的結(jié)果。但該反應對模板DNA的質(zhì)量要求較為嚴格，DNA的質(zhì)量影響酶切、連接擴增反應的順利進行。第十九頁，共三十三頁。AFLP技術(shù)的應用：AFLP具有可靠性好，重復性強，可信度高等優(yōu)點，近年來廣泛應用于遺傳育種研究，在動物遺傳育種、動物基因組研究中有著廣泛的應用前景，如：構(gòu)建遺傳連鎖圖譜；利用AFLP快速鑒別與目的基因緊密連鎖的分子標記；AFLP輔助的輪回選擇育種；利用AFLP技術(shù)研究基因表達與調(diào)控；分類和進化研究；甲基化研究，等。第二十頁，共三十三頁。微衛(wèi)星標記（microsatellite），又稱為短串聯(lián)重復序列(simpletandemrepeats,STRs)或簡單重復序列（simplesequencerepeats），是均勻分布于真核生物基因組中的簡單重復序列，由2～6個核苷酸的串聯(lián)重復片段構(gòu)成，由于重復單位的重復次數(shù)在個體間呈高度變異性并且數(shù)量豐富，因此微衛(wèi)星標記的應用非常廣泛。

微衛(wèi)星標記第二十一頁，共三十三頁。根據(jù)重復單元的構(gòu)成與分布，微衛(wèi)星被分為3類：單純（pure）SSR：指由單一的重復單元所組成的序列，如(AT)n；復合（compound）SSR：是由2個或多個重復單元組成的序列，如(GT)n(AT)m；間隔（interrupted）SSR：在重復序列中有其它核苷酸夾雜其中，如(GT)nGG(GT)m。第二十二頁，共三十三頁。微衛(wèi)星標記的基本原理：根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端互補序列設計引物，通過PCR反應擴增微衛(wèi)星片段，由于核心序列串聯(lián)重復數(shù)目不同，因而能夠用PCR的方法擴增出不同長度的PCR產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，根據(jù)分離片段的大小決定基因型并計算等位基因頻率。第二十三頁，共三十三頁。第二十四頁，共三十三頁。SSR標記優(yōu)點：一般檢測到的是一個單一的多等位基因位點；微衛(wèi)星呈共顯性遺傳，故可鑒別雜合子和純合子；所需DNA量少。缺點：微衛(wèi)星引物的通用性還不夠高，一個物種的特異微衛(wèi)星引物在別的物種中使用時要進行篩選，且多在較近緣的物種間利用，否則可信度會受影響；微衛(wèi)星引物較貴，成本較高。第二十五頁，共三十三頁。

EST是從一個隨機選擇的cDNA克隆進行5’端和3’端單一次測序獲得的短的cDNA部分序列，代表一個完整基因的一小部分，在數(shù)據(jù)庫中其長度一般從20到7000bp不等，平均長度為360±120bp。EST來源于一定環(huán)境下一個組織總mRNA所構(gòu)建的cDNA文庫，因此EST也能說明該組織中各基因的表達水平。

表達序列標簽（EST）標記第二十六頁，共三十三頁。第二十七頁，共三十三頁。EST構(gòu)建的技術(shù)路線：提取樣品的總RNA或帶有polyA的mRNA構(gòu)建cDNA文庫，隨機挑取大量克隆進行EST測序?qū)y得的EST進行組裝、拼接對網(wǎng)上已有的EST數(shù)據(jù)庫進行同源性比較確定EST代表的是已知基因還是未知基因?qū)蜻M行定位、結(jié)構(gòu)、功能檢測分析第二十八頁，共三十三頁。EST的應用：EST作為表達基因所在區(qū)域的分子標簽因編碼DNA序列高度保守而具有自身的特殊性質(zhì)，與來自非表達序列的標記(如AFLP、RAPD、SSR等)相比更可能穿越家系與種的限制，因此EST標記在親緣關系較遠的物種間比較基因組連鎖圖和比較質(zhì)量性狀信息是特別有用。同樣，對于一個DNA序列缺乏的目標物種，來源于其他物種的EST也能用于該物種有益基因的遺傳作圖，加速物種間相關信息的迅速轉(zhuǎn)化。第二十九頁，共三十三頁。EST作用具體表現(xiàn)在：用于構(gòu)建基因組的遺傳圖譜與物理圖譜；作為探針用于放射性雜交；用于定位克??；借以尋找新的基因；作為分子標記；用于研究生物群體多態(tài)性；用于研究基因的功能；有助于藥物的開發(fā)、品種的改良；促進基因芯片的發(fā)展等方面。第三十頁，共三十三頁。SNP全稱SingleNucleotidePolymorphisms，是指在基因組上單個核苷酸的變異形成的遺傳標記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富。從理論上來看每一個SNP位點都可以有4種不同的變異形式,但實際上發(fā)生的只有兩種,即轉(zhuǎn)換和顛換,二者之比為1:2。SNP在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁,而且多是C轉(zhuǎn)換為T,原因是CG中的C常為甲基化的,自發(fā)地脫氨后即成為胸腺嘧啶。一般而言,SNP是指變異頻率大于1%的單核苷酸變異。

單核苷酸多態(tài)性（SNP）標記第三十一頁，共三十三頁。在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩碚f，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP(codingSNP，cSNP)比較少，因為在外顯子內(nèi)，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾