第二章微生物發(fā)酵產(chǎn)酶

Chapter2

TheproductionofEnzymebyFermentationofMicroorganism微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶可使清潔燃料的夢想變?yōu)楝F(xiàn)實成功的飼料用酶，如植酸酶可減少向環(huán)境中排放磷

紡織精煉用酶

洗滌劑酶

使用酶生產(chǎn)沒有反式脂肪酸的食用油和奶油

提高啤酒質(zhì)量

酶替代面包中的乳化劑、改善面包質(zhì)量、延長保鮮期改善面條的咬勁，增白、增亮、護色，提高面條的耐煮性并降低黏度等烘焙工業(yè)用酶用酶處理皮革可減少化學品的使用

酶與人類的生活造紙用酶，減少漂白劑用量，減少環(huán)境污染果汁澄清，加快果汁過濾速度，保持風味酶的生產(chǎn)方法提取分離法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化學合成(chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea……organ/tissue/cellAmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillus……PlantcellcultureAnimalcellcultureFewexampleContentsofchapter21、酶生物合成過程2、常見產(chǎn)酶微生物3、酶的發(fā)酵工藝條件及控制4、酶生產(chǎn)過程的動力學GoGoGoGo5、固定化微生物細胞發(fā)酵產(chǎn)酶6、固定化微生物原生質(zhì)體發(fā)酵產(chǎn)酶2.1

酶生物合成過程

ThebiosynthesisprocessofEnzyme1、中心法則-CentralDogma2、RNA的生物合成-Transcription3、蛋白質(zhì)的生物合成-Translation4、酶生物合成的調(diào)節(jié)-RegulationGoGoGoGo下一節(jié)本章目錄Reversetranscription1、中心法則-CentralDogmaReplication復制：親代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或RNA的過程。Transcription轉(zhuǎn)錄：以DNA為模板，按照堿基配對原則將其所含的遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補的RNA的過程。Translation翻譯：亦叫轉(zhuǎn)譯，以mRNA為模板，將mRNA的密碼解讀成蛋白質(zhì)的AA順序的過程。Reversetranslation逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，生成DNA的過程。本節(jié)目錄2、RNA的生物合成(轉(zhuǎn)錄)-Transcription細胞內(nèi)RNA的生物功能(1)在某些RNA病毒中，其所含的雙鏈RNA作為遺傳信息的載體。(2)在蛋白質(zhì)的生物合成過程中，各種RNA起著重要的作用。其中，tRNA作為氨基酸載體，并由其上的反密碼子識別mRNA分子上的密碼子；mRNA作為蛋白質(zhì)合成的模板，由其分子上的三聯(lián)體密碼控制蛋白質(zhì)分子中氨基酸的排列順序；rRNA與蛋白質(zhì)一起組成核糖核蛋白體（核糖體），作為蛋白質(zhì)生物合成的場所。(3)某些RNA具有生物催化活性，屬于核酸類酶，在一定條件下，可以催化有關(guān)的生化反應。(4)各種小分子RNA在分子修飾和代謝調(diào)節(jié)等方面有重要作用。轉(zhuǎn)錄過程的特點1、轉(zhuǎn)錄的不對稱性：在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板，稱為轉(zhuǎn)錄的不對稱性。反義鏈antisensestrand（無意義鏈，負鏈）：在RNA的轉(zhuǎn)錄中，用作模板的DNA鏈稱為反義鏈。有義鏈codingstrand（編碼鏈，正鏈）：在RNA的轉(zhuǎn)錄中，不作為模板的DNA鏈稱為有義鏈。2、轉(zhuǎn)錄所需酶：依賴DNA的RNA聚合酶又稱為轉(zhuǎn)錄酶，是以DNA為模板的一類RNA聚合酶。在原核生物和真核生物中，轉(zhuǎn)錄酶有所不同。原核生物的轉(zhuǎn)錄酶比較簡單，由1種RNA聚合酶催化所有RNA的生物合成。而在真核生物中RNA聚合酶有3種，分別為RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ，它們都屬于寡聚酶，酶的亞基數(shù)目為4～10個，亞基種類有4～6種。轉(zhuǎn)錄過程起始位點的識別recognition轉(zhuǎn)錄起始initiation鏈的延伸elongation轉(zhuǎn)錄終止termination轉(zhuǎn)錄后加工modificationTheE.coliRNApolymeraseholoenzymeconsistsofsixsubunits:a2bb’s.PossiblecatalyticsubunitsPromoterspecificityEnzymeassembly,promoterrecognition,activatorbindingRoleunknown(notneededinvitro)36.5kDa15115511kDa(32-90kDa)本節(jié)目錄3、蛋白質(zhì)的合成(翻譯)-Translation翻譯:以RNA中mRNA為模板,按照其核苷酸順序所組成的密碼指導蛋白質(zhì)的合成的過程.mRNA蛋白質(zhì)翻譯

各種信息各種蛋白質(zhì)（核苷酸排列順序）（氨基酸排列順序）蛋白質(zhì)合成的幾個要素1、mRNA(模板，template)2、遺傳密碼，nucleotidetripletcodon3、轉(zhuǎn)運RNA(transporter)4、核糖體，ribosome5、其他因子和酶蛋白質(zhì)合成的幾個要素（1）

-mRNA(模板，template)mRNA是帶有DNA遺傳信息指導蛋白質(zhì)合成的直接模板。以mRNA為模板,合成一定結(jié)構(gòu)的多肽鏈的過程(翻譯)，就是將mRNA分子中的核苷酸排列順序轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)分子中的氨基酸排列順序。蛋白質(zhì)合成的幾個要素（2）

-遺傳密碼，nucleotidetripletcodonmRNA分子中,每三個相鄰的核苷酸組成的三聯(lián)體代表某種氨基酸或其它信息，稱為密碼子或三聯(lián)密碼。四種核苷酸編成三聯(lián)體可形成43個即64個密碼子。其中：一個起始密碼:AUG三個終止密碼:UAAUGAUAG多數(shù)氨基酸擁有2-4個密碼蛋白質(zhì)合成的幾個要素（3）

-轉(zhuǎn)運RNA(transporter)tRNA是氨基酸的轉(zhuǎn)運工具，攜帶活化的氨基酸到核蛋白體。tRNA有特異性，至少有20種以上。每種tRNA的反密碼環(huán)頂端均有由三個核苷酸組成的反密碼，能與mRNA上相應的密碼互補結(jié)合。酪5’5’3’AUGGUUUACACA酪氨酰-tRNA反密碼mRNA密碼(codon)與反密碼(anticodon)的堿基配對蛋白質(zhì)合成的幾個要素（4）

-核糖體，ribosome核糖體（或稱核糖核蛋白體）由蛋白質(zhì)和rRNA組成。是存在于細胞質(zhì)內(nèi)的微小顆粒。Theribosomecompositionofprokaryoticandeukaryoticcell蛋白質(zhì)合成的幾個要素（5）

-其他因子和酶其他輔助因子工具酶蛋白質(zhì)的合成過程肽鏈合成的起始initiation肽鏈合成的延伸elongation肽鏈合成的終止與釋放terminationandrelease合成多肽的輸送和加工transportandmodification蛋白質(zhì)分子的折疊folding氨基酸活化生成氨酰-tRNA原核生物肽鏈合成的起始階段是在GTP和起始因子（InitiationFactor）的參與下，核糖體30S亞基，fMet-tRNAF，mRNA和50S亞基結(jié)合，組成起始復合物的過程。主要包括5個步驟：（1）30S亞基與起始因子IF3結(jié)合；（2）30S亞基與mRNA結(jié)合，形成30S-IF3-mRNA復合物；（3）fMet-tRNAF與起始因子IF2以及GTP結(jié)合，生成fMet-tRNAF-IF2-GTP；（4）在起始因子IF1的參與下，fMet-tRNAF-IF2-GTP與30S-IF3-mRNA結(jié)合生成30S起始復合物。在此30S起始復合物中，fMet-tRNAF上的反密碼子正好與mRNA上的起始密碼子AUG結(jié)合；（5）50S亞基與上述30S起始復合物結(jié)合，形成完整的70S核糖體。同時放出IF1，IF2，IF3，并使GTP水解生成GDP和Pi。在此70S核糖體形成時，fMet-tRNAF位于70S核糖體的“P”位（肽?；唬?，而它的“A”位（氨酰基位）是空位。蛋白質(zhì)合成起始進位轉(zhuǎn)位成肽合成終止高效率的蛋白質(zhì)合成體系蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)如何形成？功能與結(jié)構(gòu)如何統(tǒng)一？體外、體內(nèi)的結(jié)構(gòu)如何變化？蛋白質(zhì)分子設計及蛋白質(zhì)工程的需要越來越多的基因工程產(chǎn)物需要復性復活,要求蛋白質(zhì)折疊的理論及技術(shù)的指導?；蚬こ讨亟M蛋白類產(chǎn)物必須要形成正確的折疊才能表現(xiàn)出功能和活性。蛋白質(zhì)的折疊本節(jié)目錄4、酶生物合成的調(diào)節(jié)

(regulation)基因水平的表達控制酶含量的調(diào)節(jié)操縱子（operon）：是一組功能上相關(guān)，受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的一個遺傳單位。ABEX底物水平的調(diào)節(jié)酶水平的調(diào)節(jié)

酶活性的調(diào)節(jié)酶含量的調(diào)節(jié)酶的定位調(diào)節(jié)輔助因子調(diào)節(jié)生長發(fā)育的不同時期外界環(huán)境變化酶合成與分解速度的變化（基因表達調(diào)控）產(chǎn)物調(diào)節(jié)細胞內(nèi)酶的調(diào)控模式酶在細胞內(nèi)的含量取決于酶的合成速度和分解速度。細胞根據(jù)自身活動需要，嚴格控制細胞內(nèi)各種酶的合理含量，從而對各種生物化學過程進行調(diào)控。酶濃度調(diào)節(jié)的化學本質(zhì)是基因表達的調(diào)節(jié)。在細胞內(nèi)，所合成的酶的種類及數(shù)量是由特殊的基因信息決定的。DNA所攜帶的酶蛋白遺傳信息，需要通過轉(zhuǎn)錄和翻譯而合成酶蛋白。在細胞內(nèi)進行的轉(zhuǎn)錄或翻譯過程都有特定的調(diào)節(jié)控制機制，其中轉(zhuǎn)錄的調(diào)控占主導地位。因此，基因表達的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上進行。酶合成誘導的現(xiàn)象—JacobandMonod的工作：已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶；-半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶。實驗：

1.大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時，細胞內(nèi)無上述三種酶合成；

2.大腸桿菌生長在唯一碳源乳糖培養(yǎng)基上時，細胞內(nèi)有上述三種酶合成；當換成葡萄糖培養(yǎng)基時，三種酶基本消失；

3.表明菌體生物合成的經(jīng)濟原則：需要時才合成。

本世紀三十年代，H.Karstrom在對糖代謝過程中的某些酶的合成進行研究時提出：誘導酶與組成酶某些代謝物可以誘導某些酶的合成，是通過促進為該酶編碼的基因的表達而進行的，這種現(xiàn)象叫做酶合成的誘導。能誘導酶合成的物質(zhì)叫誘導物。被誘導合成的酶叫誘導酶。酶合成阻遏的現(xiàn)象—JacobandMonod的工作：實驗：

1.大腸桿菌生長在無機鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時，檢測到細胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在；

2.在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌生長的經(jīng)濟原則：不需要就不合成。某些代謝物可以阻止某些酶的合成，是通過阻止為該酶編碼的基因的表達而進行的，這種現(xiàn)象叫做酶合成的阻遏。能阻遏酶合成的物質(zhì)叫輔阻遏物。被輔阻遏物作用而停止合成的酶叫阻遏酶。乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)誘導機制調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因表達調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物trp代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合，使之構(gòu)象發(fā)生變化與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因不能表達色氨酸操縱子（酶的阻遏）

----------阻遏物和操縱基因的調(diào)節(jié)細菌乳糖操縱子的作用機制(降解物阻遏)調(diào)節(jié)基因啟動子操縱基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMP復合物mRNA當葡萄糖作唯一碳源時，葡萄糖的降解物對腺苷酸環(huán)化酶有抑制作用，則cAMP的濃度降低，CAP-cAMP復合物減少，不能與啟動子結(jié)合，故轉(zhuǎn)錄不得進行。+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透過酶-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶酶過去稱葡萄糖效應本節(jié)目錄2.2常見產(chǎn)酶微生物

CommonmicroorganisminEnzymeProduction基本要求：不是致病菌發(fā)酵周期短,產(chǎn)酶量高不易變異退化最好是產(chǎn)生胞外酶的菌種,利于分離。對醫(yī)藥和食品用酶,還應考慮安全性：凡從可食部分或食品加工中傳統(tǒng)使用的微生物生產(chǎn)的酶,安全!由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性實驗。非常見微生物制取的酶,需做廣泛的毒性實驗,包括慢性中毒實驗。下一節(jié)本章目錄常用的產(chǎn)酶微生物1、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)2、大腸桿菌(Escherichiacoli)3、黑曲霉(Aspergillusniger)4、米曲霉(Aspergillusoryzae)5、青霉(Penicillium)6、木霉(Trichoderma)7、根霉(Rhizopus)8、毛霉(Mucor)9、鏈霉菌(Streptomyces)10、啤酒酵母(SaccharomycesCerevisiae)11、假絲酵母(Candida)(1)大腸埃希氏桿菌，簡稱為大腸桿菌，是最為著名的原核生物。形態(tài)：短桿或長桿狀，0.5～1.0×1.0～3.0um，革蘭氏陰性，運動(周毛)或不運動，無芽孢，一般無莢膜。菌落呈白色至黃白色，擴展，光滑，閃光。Escherich屬菌株和大多數(shù)大腸桿菌是無害，但也有些大腸桿菌是致病的，會引起腹瀉和尿路感染。大腸桿菌的名聲主要因它易于在實驗室操作、生長迅速，而且營養(yǎng)要求低。應用： 大腸桿菌能作為宿主供大量的細菌病毒生長繁殖 大腸桿菌也是最早用作基因工程的宿主菌 工業(yè)上生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天冬酰胺酶和制備天冬氨酸、蘇氨酸及纈氨酸等(2)醋酸桿菌（Acetobacter）

菌體從橢圓至桿狀，單個、成對或成鏈，革蘭氏陰性，運動（周毛）或不運動，不生芽孢。好氣。含糖、乙醇和酵母膏的培養(yǎng)基上生長良好。應用：有機酸(食醋等）葡萄糖異構(gòu)酶(高果糖漿)山梨糖(維C中間體）(3)枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）

直狀、近直狀的桿菌，周生或側(cè)生鞭毛，革蘭氏陽性，無莢膜，芽孢0.5×1.51.8m，中生或近中生?？莶菅挎邨U菌是工業(yè)發(fā)酵的重要菌種之一。生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。(4)根霉(Rhizopus)分類學上屬于藻狀菌綱，毛霉目，根霉屬。根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培養(yǎng)基上固著，并吸收營養(yǎng)）。分布于土壤、空氣中，常見于淀粉食品上，可引起霉腐變質(zhì)和水果、蔬菜的腐爛。代表種：米根霉（R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。應用：根霉能產(chǎn)生一些酶類，如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等，是生產(chǎn)這些酶類的菌種。在釀酒工業(yè)上常用做糖化菌。有些根霉還能產(chǎn)生乳酸、延胡索酸等有機酸。(6)曲霉(Aspergillus)分類：多數(shù)屬于子囊菌亞門，少數(shù)屬于半知菌亞門。分布：廣泛分布于土壤、空氣和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐變質(zhì)，有的可產(chǎn)生致癌性的黃曲霉毒素。代表種：黑曲霉Asp.Niger、黃曲霉Asp.flavus應用：是制醬、釀酒、制醋的主要菌種。是生產(chǎn)酶制劑（蛋白酶、淀粉酶、果膠酶）的菌種。生產(chǎn)有機酸（如檸檬酸、葡萄糖酸等）。農(nóng)業(yè)上用作生產(chǎn)糖化飼料的菌種?；乇竟?jié)國外菌種保藏機構(gòu)ATCC(AmericanTypeCultureCollection） 美國典型菌種保藏中心NRRL(AgriculturalResearchServiceCultureCollection) 美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH) 德國微生物菌種保藏中心NBRC(NITEBiologicalResourceCenter) 日本技術(shù)評價研究所生物資源中心ATCCATCC(AmericanTypeCultureCollection）美國典型菌種保藏中心

ATCC主要從事農(nóng)業(yè)、遺傳學、應用微生物、免疫學、細胞生物學、工業(yè)微生物學、菌種保藏方法、醫(yī)學微生物學、分子生物學、植物病理學、普通微生物學、分類學、食品科學等的研究。

該中心保藏有藻類111株，細菌和放線菌16865株，細胞和雜合細胞4300株，絲狀真菌和酵母46000株，植物組織79株，種子600株，原生動物1800株，動物病毒、衣原體和病原體2189株，植物病毒1563種。

NRRLAgriculturalResearchService(ARS)CultureCollection

原為NorthernRegionalResearchLaboratory NRRL是由美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究中心支持的政府性質(zhì)的菌種保藏中心。主要從事農(nóng)業(yè)、應用微生物、基因工程、工業(yè)微生物、菌種保藏方法、環(huán)境保護、分子生物學、食品安全、普通微生物、分類學的研究。

該中心保藏有細菌10500株，真菌45000株，酵母14500株，放線菌9500株。

DSMZDSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)德國微生物菌種保藏中心

DSMZ成立于1969年，是德國的國家菌種保藏中心。該中心一直致力于細菌、真菌、質(zhì)粒、抗菌素、人體和動物細胞、植物病毒等的分類、鑒定和保藏工作。

該中心是歐洲規(guī)模最大的生物資源中心，保藏有細菌9400株，真菌2400株，酵母500株，質(zhì)粒300株，動物細胞500株，植物細胞500株，植物病毒600株，細菌病毒90株等。NBRCNBRC(NITEBiologicalResourceCenter)日本技術(shù)評價研究所生物資源中心

NBRC是由日本經(jīng)濟部、商業(yè)部、工業(yè)部支持的半政府性質(zhì)菌種保藏中心。原為IFO(

InstituteforFermentation,Osaka,大阪發(fā)酵研究所)。主要從事農(nóng)業(yè)、應用微生物、菌種保藏方法、環(huán)境保護、工業(yè)微生物、普通微生物、分子生物學等的研究。

該中心保藏有細菌1446株，真菌568株，酵母164株。這些菌種主要來自本國的其它菌種保藏中心。

國內(nèi)菌種保藏機構(gòu)ACCC 中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心CGMCC 普通微生物菌種保藏管理中心AS 中國科學院微生物研究所CICC 工業(yè)微生物菌種保藏管理中心IFFI 輕工業(yè)部食品發(fā)酵工業(yè)科學研究所2.3酶的發(fā)酵工藝條件與控制Thefermentationprinciplesanditscontrolofenzymeproduction1、培養(yǎng)基2、發(fā)酵條件及控制-Transcription3、提高產(chǎn)酶的措施-TranslationGoGoGo下一節(jié)本章目錄酶的生物合成酶的生物合成受基因和代謝物的雙重控制基因決定形成酶分子的化學結(jié)構(gòu)代謝物（酶反應的底物、產(chǎn)物或類似物）控制和調(diào)節(jié)酶的合成誘變或基因工程來培育優(yōu)良品種工藝調(diào)控1、培養(yǎng)基各種生物對營養(yǎng)的需求1、選擇適宜的營養(yǎng)物質(zhì)2、營養(yǎng)物的濃度及配比合適3、物理、化學條件適宜4、經(jīng)濟節(jié)約5、精心設計、試驗比較培養(yǎng)不同的微生物必須采用不同的培養(yǎng)條件；培養(yǎng)目的不同，原料的選擇和配比不同；不同階段，培養(yǎng)條件也有所差異。培養(yǎng)基的設計原則五大要素：碳源、氮源、無機鹽、生長因子、水培養(yǎng)基幾乎是一切對微生物進行研究和利用工作的基礎培養(yǎng)基（medium）是人工配制的，適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。任何培養(yǎng)基都應該具備微生物生長所需要五大營養(yǎng)要素構(gòu)成細胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中碳架碳源可作能源，為生命活動提供能量常用碳源：糖類、醇類、脂類、有機酸、烴類、蛋白質(zhì)及其降解物異養(yǎng)微生物：糖類是最好碳源（葡萄糖最為通用）水是微生物最基本的組成分（７０％—９０％）水是微生物體內(nèi)和體外的溶劑（吸收營養(yǎng)成分和代謝廢物）水是細胞質(zhì)組分，直接參與各種代謝活動調(diào)節(jié)細胞溫度和保持環(huán)境溫度的穩(wěn)定（比熱高，傳熱快）水碳源選擇合適碳源，以適應目的酶的合成調(diào)節(jié)機制構(gòu)成細胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物中氮素（不能用作能源）氮源有機氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏無機氮源銨鹽、硝酸鹽參與酶的組成、構(gòu)成酶活性基、激活酶活性維持細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)細胞滲透壓控制細胞的氧化還原電位有時可作某些微生物生長的能源物質(zhì)常用：硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物以及含有鉀、鈉、鈣、鎂、鐵等元素的化合物。氮源無機鹽需要注意合適的碳氮比生長因子生長因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物質(zhì)進行合成，而必須另外加入少量的生長需求的有機物質(zhì)。分類：化學結(jié)構(gòu)分成維生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和類脂成分等四類功能：以輔酶與輔基的形式參與代謝中的酶促反應

實驗室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作為各種生長因子的的需要，麥芽汁、米曲汁等天然培養(yǎng)基中本身含有各種生長因子實驗室的常用培養(yǎng)基：細菌：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（或簡稱普通肉湯培養(yǎng)基）；放線菌：高氏1號合成培養(yǎng)基培養(yǎng)；酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基；霉菌：查氏合成培養(yǎng)基；例如枯草芽孢桿菌：一般培養(yǎng)：肉湯培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基；自然轉(zhuǎn)化：基礎培養(yǎng)基；觀察芽孢：生孢子培養(yǎng)基；產(chǎn)蛋白酶：以玉米粉、黃豆餅粉為主的產(chǎn)酶培養(yǎng)基；枯草桿菌BF7658α-淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉8%，豆餅粉4%，磷酸氫二鈉

0.8%，硫酸銨0.4%，氯化鈣0.2%，氯化按0.15%（自然pH）?？莶輻U菌AS1.398中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉4%，豆餅粉3%，麩皮3.2%,

糠1%,磷酸氫二鈉0.4%,磷酸二氫鉀0.03%（自然pH）。黑曲霉糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉10%，豆餅粉4%，麩皮1%（pH4.4～5.0）。地衣芽孢桿菌2709堿性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉5.5%,豆餅4%,磷酸氫二鈉0.4%,磷酸二氫鉀0.03%(pH8.5)。黑曲霉AS3.350酸性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉6%,豆餅粉4%,玉米漿0.6%,氯化鈣0.5%,氯化銨1%,磷酸氫二鈉0.2%(pH5.5)。游動放線菌葡萄糖異構(gòu)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜2%，豆餅粉2%，磷酸氫二鈉0。1%，硫酸鎂0。05%(pH7.2)。桔青霉磷酸二酯酶發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%,硫酸鎂0.05%,氯化鈣0.04%,磷酸氫二鈉0.05%,磷酸二氫鉀0.05%(自然pH)。黑曲霉AS3.396果膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮5%,果膠0.3%,硫酸銨2%,磷酸二氫鉀0.25%,硫酸鎂0.05%,硝酸鈉0.02%,硫酸亞鐵0.001%(自然pH)。枯草桿菌AS1.398堿性磷酸酶發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖0.4%,乳蛋白水解物0.1%,硫酸銨1%,氯化鉀0.1%,氯化鈣0.1mmol/L,氯化鎂1.0mmol/L,磷酸氫二鈉20mol/L(用pH7.4的Tris-HCl緩沖液配制)回本節(jié)2、發(fā)酵條件及控制培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的范圍內(nèi)，以滿足不同類型微生物的生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。為了維持培養(yǎng)基pH的相對恒定，通常在培養(yǎng)基中加入pH緩沖劑，或在進行工業(yè)發(fā)酵時補加酸、堿。通常培養(yǎng)條件：細菌與放線菌：pH7~7.5酵母菌和霉菌：pH4.5~6范圍內(nèi)生長pH值的控制細胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH值與生長最適pH值往往有所不同。細胞生產(chǎn)某種酶的最適pH值通常接近于該酶催化反應的最適pH值。有些細胞可以同時產(chǎn)生若干種酶，在生產(chǎn)過程中，通過控制培養(yǎng)基的pH值，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比例。通常在生物學范圍內(nèi)每升高10℃，生長速度就加快一倍，所以溫度直接影響酶反應，對于微生物來說，溫度直接影響其生長和合成酶。溫度的控制有些細胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度與細胞生長最適溫度有所不同，而且往往低于生長最適溫度。這是由于在較低的溫度條件下，可以提高酶所對應的mRNA的穩(wěn)定性，增加酶生物合成的延續(xù)時間，從而提高酶的產(chǎn)量?？莶輻U菌的最適生長溫度為34～37℃黑曲霉的最適生長溫度為28～32℃溶解氧的控制在酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，處于不同生長階段的細胞，其細胞濃度和細胞呼吸強度各不相同，致使耗氧速率有很大的差別。因此必須根據(jù)耗氧量的不同，不斷供給適量的溶解氧。培養(yǎng)液中溶解氧的量，決定于在一定條件下氧氣的溶解速度。溶氧速率與通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時間、氣液接觸面積以及培養(yǎng)液的性質(zhì)等有密切關(guān)系。一般說來，通氣量越大、氧氣分壓越高、氣液接觸時間越長、氣液接觸面積越大，則溶氧速率越大。培養(yǎng)液的性質(zhì)，主要是黏度、氣泡、以及溫度等對于溶氧速率有明顯影響。調(diào)節(jié)通氣量調(diào)節(jié)氧的分壓調(diào)節(jié)氣液接觸時間調(diào)節(jié)氣液接觸面積改變培養(yǎng)液的性質(zhì)控制溶解氧方法回本節(jié)生產(chǎn)工藝-工藝流程-胞外生產(chǎn)工藝-工藝流程-胞內(nèi)3、提高酶產(chǎn)量的措施添加誘導物對于誘導酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵過程中的某個適宜的時機，添加適宜的誘導物，可以顯著提高酶的產(chǎn)量。例如，乳糖誘導β-半乳糖苷酶，纖維二糖誘導纖維素酶，蔗糖甘油單棕櫚酸誘導蔗糖酶的生物合成等。誘導物一般可以分為3類

酶的作用底物酶的催化反應產(chǎn)物作用底物的類似物控制阻遏物的濃度阻遏作用根據(jù)機理不同，可分為：產(chǎn)物阻遏和分解代謝物阻遏兩種。1.產(chǎn)物阻遏作用是由酶催化作用的產(chǎn)物或者代謝途徑的末端產(chǎn)物引起的阻遏作用。2.分解代謝物阻遏作用是由分解代謝物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物質(zhì)經(jīng)過分解代謝而產(chǎn)生的物質(zhì)）引起的阻遏作用?？刂谱瓒粑锏臐舛仁墙獬瓒?、提高酶產(chǎn)量的有效措施。為了減少或者解除分解代謝物阻遏作用，應當控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源的濃度。采用其他較難利用的碳源，如淀粉等采用補料、分次流加碳源添加一定量的環(huán)腺苷酸（cAMP）對于受代謝途徑末端產(chǎn)物阻遏的酶，可以通過控制末端產(chǎn)物的濃度的方法使阻遏解除。添加表面活性劑表面活性劑可以與細胞膜相互作用，增加細胞的透過性，有利于胞外酶的分泌，從而提高酶的產(chǎn)量。

將適量的非離子型表面活性劑，如吐溫（Tween）、特里頓(Triton)等添加到培養(yǎng)基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的產(chǎn)量增加。由于離子型表面活性劑對細胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性劑（如‘新潔而滅’等）是消毒劑，對細胞的毒性較大，不能在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中添加到培養(yǎng)基中。添加產(chǎn)酶促進劑

產(chǎn)酶促進劑是指可以促進產(chǎn)酶、但是作用機理未闡明清楚的物質(zhì)。例如，添加一定量的植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的產(chǎn)量提高1～20倍；添加聚乙烯醇（Polyvinylalcohol）可以提高糖化酶的產(chǎn)量。產(chǎn)酶促進劑對不同細胞、不同酶的作用效果各不相同，現(xiàn)在還沒有規(guī)律可循，要通過試驗確定所添加的產(chǎn)酶促進劑的種類和濃度。回本節(jié)2.4酶生產(chǎn)過程的動力學1、酶生物合成的模式2、酶生產(chǎn)過程中細胞生長動力學3、酶生產(chǎn)過程中產(chǎn)酶動力學GoGoGo本章目錄1、酶生物合成的模式細胞在一定條件下培養(yǎng)生長，其生長過程一般經(jīng)歷調(diào)整期、生長期、平衡期和衰退期等4個階段通過分析比較細胞生長與酶產(chǎn)生的關(guān)系,可以把酶生物合成的模式分為4種類型。即同步合成型，延續(xù)合成型，中期合成型和滯后合成型。

同步合成型：又稱生長偶聯(lián)型,是指酶合成與細胞生長同步進行，當細胞生長進入對數(shù)期時，酶也大量合成；當細胞進入穩(wěn)定期時,酶的合成也停止。延續(xù)合成型：酶的合成伴隨著細胞生長而開始，但在細胞生長進入穩(wěn)定期后,酶的合成仍將延續(xù)較長一段時間。中期合成型：酶的合成在細胞生長一段時間后才開始，而在細胞生長進入穩(wěn)定期后,酶的合成也終止。滯后合成型：只有當細胞生長進入穩(wěn)定期后才開始酶的合成并大量積累。濃度時間(h)細胞濃度酶濃度細胞濃度酶濃度酶濃度酶濃度細胞濃度細胞濃度A.同步合成型;B.延續(xù)合成型;C.中期合成型;D.滯后合成型ABCD酶生物合成模式同步合成型

酶的生物合成與細胞生長同步進行的一種酶生物合成模式。該類型酶的生物合成速度與細胞生長速度緊密聯(lián)系，又稱為生長偶聯(lián)型。屬于該合成型的酶，其生物合成伴隨著細胞的生長而開始；在細胞進入旺盛生長期時，酶大量生成；當細胞生長進入平衡期后，酶的合成隨著停止。

大部分組成酶的生物合成屬于同步合成型，有部分誘導酶也按照此種模式進行生物合成。例如米曲霉在含有單寧或者沒食子酸的培養(yǎng)基中生長，在單寧或沒食子酸的誘導作用下，合成單寧酶（tanaseEC3.1.1.20）。細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml總細胞濃度活細胞濃度胞外酶濃度胞內(nèi)酶濃度延續(xù)合成型

酶的生物合成在細胞的生長階段開始，在細胞生長進入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成一段較長時間。

屬于該類型的酶可以是組成酶，也可以是誘導酶。例如，在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果膠為單一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以誘導聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）的生物合成。細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml以半乳糖醛酸為誘導物以含有葡萄糖的果膠為誘導物中期合成型

該類型的酶在細胞生長一段時間以后才開始，而在細胞生長進入平衡期以后，酶的生物合成也隨著停止。例如，枯草桿菌堿性磷酸酶（Alkalinephophatase，EC3.1.3.1)的生物合成模式屬于中期合成型。這是由于該酶的合成受到其反應產(chǎn)物無機磷酸的反饋阻遏，而磷又是細胞生長所必不可缺的營養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基中必須有磷的存在。這樣，在細胞生長的開始階段,培養(yǎng)基中的磷阻遏堿性磷酸酶的合成，只有當細胞生長一段時間，培養(yǎng)基中的磷幾乎被細胞用完（低于0.01mmol/L）以后，該酶才開始大量生成。又由于堿性磷酸酶所對應的mRNA不穩(wěn)定，其壽命只有30min左右，所以當細胞進入平衡期后，酶的生物合成隨著停止。細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml滯后合成型

此類型酶是在細胞生長一段時間或者進入平衡期以后才開始其生物合成并大量積累。又稱為非生長偶聯(lián)型。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。

屬于滯后合成型的酶，之所以要在細胞生長一段時間甚至進入平衡期以后才開始合成，主要原因是由于受到培養(yǎng)基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有隨著細胞的生長，阻遏物幾乎被細胞用完而使阻遏解除后，酶才開始大量合成。若培養(yǎng)基中不存在阻遏物，該酶的合成可以轉(zhuǎn)為延續(xù)合成型。該類型酶所對應的mRNA穩(wěn)定性很好，可以在細胞生長進入平衡期后的相當長的一段時間內(nèi)，繼續(xù)進行酶的生物合成。黑曲霉羧基蛋白酶生物合成放線菌素D對產(chǎn)酶的影響細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml酶濃度U/ml酶濃度U/ml30℃22℃不加加入不加加入影響酶生物合成模式的因素