分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

分子生物學(xué)試驗(yàn)報(bào)告Revisedasof23November2023分子生物學(xué)試驗(yàn)命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院專業(yè)：生物科學(xué)〔基地〕班級(jí)： 202301班分子生物學(xué)根底試驗(yàn)分子生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)已成為生物化學(xué)及分子生物學(xué)以及相關(guān)學(xué)科院系教學(xué)科研不行DNA的重組；PCR基因擴(kuò)增等等。試驗(yàn)一質(zhì)粒DNA的小量制備一、試驗(yàn)原理運(yùn)載工具，攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的這種工具就叫載體〔vector〕。載體的設(shè):(1)體細(xì)胞中能大量增殖，只有高復(fù)制率才能使外源基因在受體細(xì)胞中大量擴(kuò)增；〕入；〕載體具有選擇性的遺傳標(biāo)記，如有抗四環(huán)素基因〕，抗霉素基因細(xì)胞中分別篩選出來。細(xì)菌質(zhì)粒具備上述條件，它是基因工程中常用的載體之一。具有雙鏈閉合環(huán)狀構(gòu)造的DNA分子，主要覺察于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中。質(zhì)粒就不能存活，而它掌握的很多生物學(xué)功能也是對(duì)宿主細(xì)胞的補(bǔ)償。1個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子。后者的質(zhì)粒在質(zhì)粒如F因子等，拷貝數(shù)較少，復(fù)制受到嚴(yán)格掌握。小的質(zhì)粒，如ColEⅠ質(zhì)粒〔含有產(chǎn)生大腸桿菌素E1基因〕，拷貝數(shù)較多，復(fù)制不受嚴(yán)格掌握。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑－氯霉素時(shí)，染色體DNA復(fù)制受阻，而松弛型ColEⅠ質(zhì)粒連續(xù)復(fù)制12－16h20多個(gè)拷貝可擴(kuò)增至1000－3000個(gè)拷貝，此時(shí)質(zhì)粒DNA占總DNA的含量由原來的240％－50％。本試驗(yàn)分別提純化的質(zhì)粒:培育細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分別和純化質(zhì)粒DNA。承受溶菌酶可破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基硫酸鈉〔SDS〕可使細(xì)胞壁解，經(jīng)溶菌酶和陰離子去污劑〔SDS〕處理后，細(xì)菌染色體中。用乙醇沉淀、洗滌，可得到質(zhì)粒DNA。DNA的相對(duì)分子量一般在106－107范圍內(nèi)，如質(zhì)粒pBR322的相對(duì)分子cccDNA形式存在，它比其開環(huán)和線狀DNA的泳動(dòng)速度快，因此在本試驗(yàn)中，自DNA在電泳凝膠中呈現(xiàn)3條區(qū)帶。二、試驗(yàn)?zāi)康陌盐兆畛Ｓ玫奶崛≠|(zhì)粒DNA的方法和檢測(cè)方法。了解制備原理及各種試劑的作用。三、試驗(yàn)材料和試劑材料：大腸桿菌，含pBR322質(zhì)粒。試劑：pH至左右。如固體培育基則添加15g/L瓊脂。EDTA。滅菌后存放。LTris-HCl抽提幾次以平衡這一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面掩蓋等體積的mol/LTris-HCl，4℃保存。無水乙醇7.70％乙醇.20μg/mL。儀器：四、操作步驟〔一〕培育細(xì)菌50μg/mL氨芐青霉素(Amp)的LBAmpLB培育基冷卻到50℃左右方可參加?！捕硰木渲锌焖偬崛≈苽滟|(zhì)粒DNA棄上清，參加150μLGET緩沖液，在渦旋混合器上充分混勻，在室溫下放置10min。配制的L〔不要振蕩次，使之混勻，冰上放置4min，最多不能超過5min。15min。離心一次。用()，備用。保存，供下午電泳使用。泳，下面為瓊脂糖凝膠電泳的原理及方法：EBDNA分子后在紫外下顯熒光。而熒光強(qiáng)度正比于DNA的含量，如將濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品表2－1照，只需要5－10ngDNA，就可以從照片上比較鑒別。工程中常常被用做檢測(cè)DNA樣品。片段 堿基對(duì)數(shù)目/kb 相對(duì)分子質(zhì)量含量/(ng/mg)1×1062×1063×1064×10695×1066×1067×10688×106瓊脂糖凝膠板的制備1．瓊脂糖凝膠的制備稱取瓊脂糖，置于錐形瓶中，參加100mLTBE緩沖液，于電爐上加熱，注使其終濃度為1％。膠板的制備個(gè)邊腳模子。留意：將橡皮膏緊貼在有機(jī)玻璃內(nèi)槽兩端邊上，不能留空隙。65℃左右的瓊脂糖凝膠，留神地倒在內(nèi)槽上，掌握灌膠速度，使膠液緩慢地開放，輕拔出樣品槽模板，撕去膠帶紙，膠板上即形成相互隔開的樣品槽?！罷BE電泳緩沖液，以蓋過膠板為宜。膠板內(nèi)的樣品小槽加樣用移液槍將上述樣品分別參加膠板的樣品小槽內(nèi)，每次加完一個(gè)樣品為了避開穿插內(nèi)，防止碰壞樣品槽四周的凝膠面，每個(gè)樣品槽的加樣量不宜過多，本試驗(yàn)加樣為MarkerλDNA/HindⅢ)電泳DNA片段的最大區(qū)分率，電場(chǎng)強(qiáng)度不應(yīng)5V/cm。1～2cm處，停頓電泳。染色將電泳后的凝膠浸入EB染液中，進(jìn)展染色以觀看在瓊脂糖凝膠中的DNA帶。20min后，用大量水沖洗。觀看DNA存在處顯示出紅色熒光條帶。用凝膠自動(dòng)成像儀處理代替。五、留意事項(xiàng)收集菌體提質(zhì)粒前，培育基要去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮。Ⅱ后，溶液變成澄清，并有黏性；參加溶液Ⅲ后，消滅絮狀沉淀。苯酚具有腐蝕性，能造成皮膚的嚴(yán)峻燒傷及衣物損壞，使用時(shí)應(yīng)留意。如不留神皮膚上遇到苯酚則應(yīng)用堿性溶液、肥皂及大量的清水沖洗。苯酚可以用于抽提純化DNA，由于苯酚的氧化產(chǎn)物可以使核酸鏈發(fā)生斷裂。所LTris-HCl進(jìn)展平衡。所以取酚Tris-HCl液隔絕空氣層。酚/氯仿//氯仿/異戊醇抽提后，吸取上清液時(shí)留意不要把中間的白色層吸入，其中含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。部棄用，不回收。。因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)挑單菌落。DNADNA后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，圖譜如下：圖中MMarker，4號(hào)為本人所提取的質(zhì)凝膠電泳的檢測(cè)圖，本人所用的質(zhì)分子條帶較為光明，說明所提取的濃度很高；前面原理局部提到，質(zhì)粒分子的構(gòu)造多樣，包括超螺旋構(gòu)造，泳動(dòng)速度不同，所以在圖譜中顯示有多條不會(huì)單獨(dú)檢測(cè)質(zhì)粒DNA，或者檢測(cè)質(zhì)粒DNAMarker，這主要是由于質(zhì)粒分子構(gòu)造多樣，在電泳圖譜中并不能夠正確顯示其大小。七、思考題裂解細(xì)菌時(shí)需留意的事項(xiàng)有哪些答：首先留意的是SDS-NaOH處理的時(shí)間。質(zhì)粒制備過程中，假設(shè)質(zhì)粒長時(shí)間暴露于NaOH,質(zhì)粒有可能不行逆變性，使得抽提質(zhì)粒中有局部是變性質(zhì)粒。這些變性質(zhì)粒，SDS-KOH5分鐘，最好在冰里處理，Ⅱ與溶液Ⅲ后溶液的混合肯定要嚴(yán)峻，承受上下顛倒的方法，千萬不能在旋轉(zhuǎn)器上猛烈振蕩，否則會(huì)是質(zhì)粒斷裂，影響提取的效果與濃度。質(zhì)粒的根本性質(zhì)有哪些自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄力量；可獨(dú)立游離在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，也可以整合到細(xì)菌染色體中。3．堿裂解法提取質(zhì)粒DNA中各溶液的作用是什么答：溶液Ｉ:GET緩沖液，葡萄糖的作用是使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)很快沉積到管EP的底部，增加溶液的粘度，維持滲透壓及防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。是Ca2＋和Mg2＋等二價(jià)金屬離子的螯合劑，在溶液I中參加EDTA，是要把大腸桿菌細(xì)胞中的二價(jià)金屬離子都螯合掉。從而起到抑制DNase對(duì)DNA的降解和抑制微生物生長的作用。溶液Ⅱ：LNaOH(內(nèi)含1%的SDS)，NaOH是最正確溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是bilayer〔雙層膜〕構(gòu)造向micelle〔微囊〕SDS是離子型外表活性劑。它主要作用質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3

進(jìn)展。溶液Ⅲ：乙酸鉀溶液，的乙酸鉀溶液是為了把抽提液的pH調(diào)至中性，從而使變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性，且穩(wěn)定存在。溶液III參加后的沉淀實(shí)際上是K+置換了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-聚合，后者是由于鹽與SDS－蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鹽形式復(fù)合物。降解作用，由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子外表又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相像相溶，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相，使用酚能有效變性蛋白質(zhì)，抑制的降解作用；氯仿能抑制酚的缺點(diǎn)，加速有機(jī)相與液相分層，去除核酸溶〔酚易溶于氯仿中〕；異戊醇的作用是削減蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生使離心后的上層含質(zhì)粒DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。無水乙醇：乙醇可以以任意比和水相混溶，而DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，DNA四周的水分子，DNA失水聚合。70%乙醇：將質(zhì)粒DNA外表的離子洗去。pHTE緩沖液：由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。酚與水有肯定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中，不致吸取樣品中含有DNA的水分，削減DNA的損失。用Tris調(diào)整至pH8是由于DNA在此條件下比較穩(wěn)定。在中性或堿性條件下RNA比DNA更簡(jiǎn)潔游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。DNA的方法包括哪幾個(gè)步驟裂解細(xì)胞，使蛋白質(zhì)與DNA變性，利用醋酸鹽沉淀基因組DNA、細(xì)胞碎片與蛋白醇與水互溶，而DNA在醇中不行溶而黏在一起，這一步也能除掉鹽分。DNA的產(chǎn)量DNA16小時(shí)的菌液狀態(tài)最好，最適合提取，可以在此根底上擴(kuò)大接種量，等比例擴(kuò)大LB培育基的體積，實(shí)行屢次抽提的方法提高質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量；其次是在提取過程中留神慎重，在參加苯酚/氯仿溶液離心之后留神吸取的同時(shí)盡量吸取完全，削減損失。留意些什么TE緩沖液中含有水分，會(huì)結(jié)成冰晶DNA分子的間隙中，而在4℃條件下不會(huì)消滅這種狀況。假設(shè)是質(zhì)粒DNA分子斷裂，導(dǎo)致得到線性4℃冰箱保存，便利使用，而對(duì)于臨時(shí)-20℃冰箱，長期保存。試驗(yàn)二DNA的含量、純度與分子量的電泳法測(cè)定一、 試驗(yàn)原理測(cè)定核酸通常承受兩種方法：即紫外分光光度法與瓊脂糖凝膠電泳法。紫外分光光度法DNA或RNA定量時(shí)，應(yīng)在260nm280nm兩個(gè)波長下讀數(shù)。依據(jù)計(jì)算在260nm波1ug/mLDNA鈉鹽的A值為，即在A=1時(shí)，雙鏈DNA50ug/mL，單鏈260DNA與RNA40ug/mL，單鏈寡核苷酸的含量為33ug/mL。雙鏈DNA含量＝A×50×稀釋倍數(shù)〔ug/mL〕260×260單鏈DNA含量＝A×33×稀釋倍數(shù)〔ug/mL〕260此外還可以依據(jù)260nm280nm的讀數(shù)間的比值〔A

/A〕估量核酸的純度。瓊脂糖凝膠電泳法

260

280DNA分子量不同，承受外加電場(chǎng)使其分開，用EBDNA分子后在紫外下顯熒光。而熒光強(qiáng)度正比于DNA的含量，如將濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品表2－1作為電泳比照，就可以估量出待測(cè)樣品的濃度。電泳后的瓊脂凝膠糖直接在紫外燈下拍工程中常常被用做檢測(cè)DNA樣品。片段片段相對(duì)分子質(zhì)量含量/(ng/mg)1 2×1063×1064×10695×1066×1067×1068×106100%二、試驗(yàn)?zāi)康?．從以上試驗(yàn)中提取到的質(zhì)粒DNA，為了能作下一步的酶切，連接及轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，必需測(cè)定DNA的純度、含量以及分子量大小。大小。三、試驗(yàn)材料和試劑材料：自制的質(zhì)粒DNA、λDNA/HindⅢ、。試劑：EcoRⅠHindⅢ10X緩沖液馬上用大量的水沖洗干凈。5×TBE母液，6．％瓊脂糖四、試驗(yàn)操作〔一〕質(zhì)粒DNA的酶解1．提的質(zhì)粒，在10uL的體系中用單一酶〔如EcoRⅠ〕進(jìn)展處理，即：質(zhì)粒DNA 5μL10×緩沖液 1μL

coRⅠ LμddHO 4Lμ2備用?！捕抄傊悄z板的制備瓊脂糖凝膠的制備稱取瓊脂糖，置于錐形瓶中，參加100mLTBE緩沖液，于電爐上加熱，注使其終濃度為1％。膠板的制備個(gè)邊腳模子。留意：將橡皮膏緊貼在有機(jī)玻璃內(nèi)槽兩端邊上，不能留空隙。65℃左右的瓊脂糖凝膠，留神地倒在內(nèi)槽上，掌握灌膠速度，使膠液緩慢地開放，輕拔出樣品槽模板，撕去膠帶紙，膠板上即形成相互隔開的樣品槽?！罷BE電泳緩沖液，以蓋過膠板為宜。膠板內(nèi)的樣品小槽加樣用移液槍將上述樣品分別參加膠板的樣品小槽內(nèi)，每次加完一個(gè)樣品為了避開穿插內(nèi)，防止碰壞樣品槽四周的凝膠面，每個(gè)樣品槽的加樣量不宜過多，本試驗(yàn)加樣為MarkerλDNA/HindⅢ)電泳DNA片段的最大區(qū)分率，電場(chǎng)強(qiáng)度不應(yīng)5V/cm。1～2cm處，停頓電泳。染色將電泳后的凝膠浸入EB染液中，進(jìn)展染色以觀看在瓊脂糖凝膠中的DNA帶。20min后，用大量水沖洗。觀看DNA存在處顯示出紅色熒光條帶。用凝膠自動(dòng)成像儀處理代替。五、留意事項(xiàng)吸樣量的正確性，確認(rèn)樣品確實(shí)被參加反響體系。放回－20℃冰箱，不要將酶在冰浴中放置過久，或放在高于0℃以上的環(huán)境中，以防止酶失活。3．酶切加樣次序?yàn)樗⒕彌_液和DNA，然后混勻。酶永久是最終參加的，如將酶直步操作是整個(gè)試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，留意防止錯(cuò)加、漏加。4．為了避開穿插污染，各樣品用不同的吸頭，且每次取酶時(shí)務(wù)必?fù)Q吸頭，以免造成限制酶被污染。5．溴化乙錠是一種猛烈的誘變劑，有毒性，使用含有這種染料的溶液時(shí)，應(yīng)戴手套進(jìn)展操作。勿將溶液滴灑在臺(tái)面或地面上，用后用水徹底沖洗干凈。六、試驗(yàn)結(jié)果與分析如下圖，M為Marker1為被酶EcoRI所切后的質(zhì)粒跑出來的條帶。由于質(zhì)1只有一條條帶。查資料知道pEGFP-N3質(zhì)粒的大小為4729bp，大小根本符合。2號(hào)泳DNA通過瓊脂糖凝膠時(shí)速度不一。由不明顯，說明提取的質(zhì)粒濃度較小。這三種DNA的相對(duì)遷移率主要取決于凝膠濃度，但也受所用電流強(qiáng)度、緩沖液的離子強(qiáng)度及超螺旋度的影響。七、思考題EB顯色的原理。膠中的核酸。是一種核酸染料，常在瓊脂糖凝膠電泳中用于核酸染色，是一種強(qiáng)的誘法使用于一般性的核酸檢測(cè)。EB分子可以嵌入核酸雙鏈的配對(duì)的堿基之DNA或雙股RNA結(jié)合時(shí)，螢光強(qiáng)度會(huì)增加20倍，使得核酸電泳后的膠片可以辨識(shí)核酸的中參加終濃度為μg/ml的EB，可以在電泳過程中隨時(shí)觀看核酸的遷移狀況，這種方法使用于一般性的核酸檢測(cè)。使用溴化乙錠時(shí)應(yīng)留意什么答：不慎與眼睛接觸后，馬上用大量清水沖洗并征求醫(yī)生意見；穿戴適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)服、說明不同電壓對(duì)電泳結(jié)果的影響是什么答：限制性內(nèi)切酶消化后的DNA分子片段，低電壓時(shí)，遷移率與所用電壓成正比。在電場(chǎng)強(qiáng)度增加時(shí)，不同分子量的DNA段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越范圍將縮小。原則上場(chǎng)強(qiáng)度不要超過5V~8V/cm，高電壓可明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)峻時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA50V左右的低電壓可以讓DNA分子片段沉降到膠和小片段樣本〔簡(jiǎn)潔在凝膠中集中消逝，顯色不清〕尤其有利于觀看到清楚結(jié)果。為了提高效率，節(jié)約時(shí)間，在核酸條帶濃縮集中后〔10~20min〕，可以轉(zhuǎn)換高電壓100V~時(shí)，停頓電泳。綜上，兩種電壓交替使用既提高分別效果，又較好節(jié)余時(shí)間。DNA的純度答：DNA純度的推斷依據(jù)OD260/OD280的比值推斷，符合要求純度高的純化DNA其OD260/OD280在之間，低于此范圍說明蛋白質(zhì)含量超標(biāo)，高于此范圍說明樣品中含有RNA。試驗(yàn)三感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化一、試驗(yàn)原理DNA分子。轉(zhuǎn)化是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得的遺傳性形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNADNase的羥基－鈣磷酸混合物粘附于細(xì)胞外表，DNA復(fù)合物，在選擇性培育基平板上培育，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。二、試驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和理解影響細(xì)胞感受態(tài)的因素，把握感受態(tài)細(xì)胞的制備方法。把握質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法。把體外DNA引入受體細(xì)胞，使受體菌具有遺傳性，并從中選擇出轉(zhuǎn)化子。三、試驗(yàn)材料和用具)。試劑：瓊脂平板儀器：蒸汽滅菌鍋。四、操作步驟(一)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備從活化的α菌平板上挑取一單菌落，接種于5mL液體培育基中，37℃振蕩培1：5050mLLB液體培育基中，37℃快速振蕩培育3～4h。離心10min。溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰15～30min。棄上清，參加200μLLCaCl2溶液，留神懸浮細(xì)胞，冰上放置片刻，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液。制好的感受態(tài)細(xì)胞可在冰上放置。(二)細(xì)胞轉(zhuǎn)化搖勻后的感受態(tài)細(xì)胞懸液，進(jìn)展下一步的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化如下〔單位：編號(hào)質(zhì)粒感受態(tài)細(xì)胞無菌水LCaCl2樣品2100//1/1002/22//100μL〕：將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置30min42℃水浴中保溫90s，然后快速在冰上冷卻3～5min。上述各管中分別參加400μLLB液體培育基，使總體積胞恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生抗藥性。(三)平板培育取各樣品培育液100μL分別接種于含卡那霉素和不含卡那霉素的LB平板培育重疊時(shí)停頓培育。質(zhì)粒比照組轉(zhuǎn)化試驗(yàn)組五、留意事項(xiàng)

無菌落長出有大量菌落長出

結(jié)果分析不含雜菌質(zhì)粒進(jìn)入受體菌中產(chǎn)生抗藥性這一個(gè)試驗(yàn)中的全部操作均要為無菌操作，在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)展。制備感受態(tài)細(xì)胞過程中，需要在冰上放置的肯定不要在室溫中放置。六、試驗(yàn)結(jié)果與分析經(jīng)過一夜培育后，其次天上午9點(diǎn)從烘箱中取出培育皿觀看結(jié)果如以下圖所示，試驗(yàn)落長出；比照組1即受體菌比照組不含卡那的平板有大量菌落長出，含卡那的平板沒