干細(xì)胞在骨衰老

項(xiàng)目名稱：干細(xì)胞在骨衰老與再生中的作用及關(guān)鍵信號(hào)分子調(diào)控首席科學(xué)家：金巖中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)起止年限：2011.1至2015.8依托部門(mén)：總后勤部衛(wèi)生部

二、預(yù)期目標(biāo)本項(xiàng)目的總體目標(biāo)：圍繞骨衰老與再生研究的重大科學(xué)問(wèn)題，闡明干細(xì)胞在骨發(fā)育與再生中的作用及相關(guān)的調(diào)控機(jī)制，明確骨增齡、衰老過(guò)程中相關(guān)干細(xì)胞的變化特征及其調(diào)控機(jī)制，明確干細(xì)胞在成骨-破骨平衡中的作用，闡明干細(xì)胞功能異常導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)病的分子機(jī)制，建立相應(yīng)的治療骨質(zhì)疏松和促進(jìn)骨再生的新策略。通過(guò)本項(xiàng)目的研究，搭建骨衰老和再生研究平臺(tái)，培養(yǎng)和建立一支學(xué)術(shù)水平高、創(chuàng)新能力強(qiáng)的研究人才隊(duì)伍，使我國(guó)在相關(guān)領(lǐng)域的研究達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。五年預(yù)期目標(biāo):1.闡明骨發(fā)育、衰老和再生修復(fù)中相關(guān)干細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路調(diào)控，明確干細(xì)胞在骨再生修復(fù)中動(dòng)員、定向分化和歸巢中的作用及其分子機(jī)制，2.明確骨增齡和衰老過(guò)程中相關(guān)干細(xì)胞的生物學(xué)行為變化規(guī)律以及干細(xì)胞在成骨-破骨平衡中的作用及調(diào)控機(jī)制，闡明增齡及衰老中關(guān)鍵信號(hào)通路及微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控。3.明確基因敲除、去勢(shì)骨疏動(dòng)物模型和骨質(zhì)疏松患者相關(guān)干細(xì)胞生物學(xué)行為變化特點(diǎn)及調(diào)控機(jī)理，闡明不同性激素水平對(duì)干細(xì)胞成骨功能的影響，確定干細(xì)胞在骨質(zhì)疏松發(fā)病中的關(guān)鍵作用。4.對(duì)比不同來(lái)源干細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松的效果；建立應(yīng)用小分子化合物預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的方案；應(yīng)用干細(xì)胞與組織工程技術(shù)治療骨質(zhì)疏松狀態(tài)下的骨缺損。5.發(fā)表具有較高影響因子的代表性SCI論文20-40篇；申請(qǐng)發(fā)明專利5～10項(xiàng)；培養(yǎng)博士后10～20人，博士40～60人，碩士20～40人；爭(zhēng)取1～2人獲得全國(guó)百篇優(yōu)秀博士論文；吸引國(guó)外優(yōu)秀的學(xué)者和留學(xué)博士回國(guó)工作。

三、研究方案總體研究思路：骨在發(fā)育、增齡、衰老和受損后的再生過(guò)程中始終保持著組織動(dòng)態(tài)變化的特點(diǎn)，以往研究多側(cè)重于終末分化細(xì)胞的功能研究，缺乏系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究，且主要對(duì)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞這兩種效應(yīng)細(xì)胞展開(kāi)研究，而對(duì)其上游的干細(xì)胞關(guān)注甚少。項(xiàng)目組前期工作顯示干細(xì)胞在上述過(guò)程中扮演了至關(guān)重要的角色，同時(shí)干細(xì)胞功能受到嚴(yán)密的分子調(diào)控，當(dāng)關(guān)鍵分子調(diào)控途徑產(chǎn)生異常時(shí)，常引起干細(xì)胞功能受損從而導(dǎo)致骨組織發(fā)育不良、早衰或由衰老引起的骨質(zhì)疏松、骨損傷愈合與再生修復(fù)能力下降等表型。因此，干細(xì)胞是探討骨組織相關(guān)重大疾病防治策略的重要靶標(biāo)，闡明干細(xì)胞在骨發(fā)育和衰老過(guò)程中的重要角色，及其在骨組織再生修復(fù)中發(fā)揮的作用和機(jī)制，不僅能為深入認(rèn)識(shí)人體器官發(fā)育提供理論依據(jù)，而且將提供新的組織退行性病變的防治策略。本項(xiàng)目擬應(yīng)用模式動(dòng)物，以骨發(fā)育、衰老和再生不同階段的相關(guān)干細(xì)胞研究為切入點(diǎn)，探討干細(xì)胞在上述過(guò)程中關(guān)鍵信號(hào)通路變化規(guī)律及機(jī)制；闡述干細(xì)胞生物學(xué)功能改變?cè)诠琴|(zhì)疏松發(fā)病中的重要作用；在此基礎(chǔ)上建立骨質(zhì)疏松預(yù)警方案及基于調(diào)節(jié)干細(xì)胞功能的治療策略；確定工程化策略在骨折和骨缺損環(huán)境中的再生治療模式。技術(shù)路徑：可行性分析：1.理論和方法可行：干細(xì)胞在骨的發(fā)育、衰老和再生過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色，而在此過(guò)程中干細(xì)胞受到復(fù)雜的各種信號(hào)分子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，是決定其介導(dǎo)的骨生理病理表型的關(guān)鍵因素。本項(xiàng)目組基于基因敲除小鼠的前期研究揭示了老齡性骨質(zhì)疏松與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能不良相關(guān)，證明一些關(guān)鍵基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化中起重要作用，其缺失可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松疾病發(fā)生。在骨修復(fù)再生方面，本組以不同來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，運(yùn)用組織工程技術(shù)成功修復(fù)多種類型的大動(dòng)物骨組織缺損，證明了利用干細(xì)胞進(jìn)行骨質(zhì)疏松性骨損傷的再生修復(fù)的可行性。而現(xiàn)代生物技術(shù)尤其是細(xì)胞、分子生物學(xué)的發(fā)展為我們闡明此調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了成熟有效的方法體系，本組具有的條件性基因敲除/入、RNAi、高通量小分子化合物篩選平臺(tái)等都為本項(xiàng)目的實(shí)施打下基礎(chǔ)。2.擁有多種模式動(dòng)物作研究模型：本項(xiàng)目組成員長(zhǎng)期從事骨發(fā)育再生的研究，已建立一批轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，如Cre-ERT;PtenCO/CO小鼠表現(xiàn)出骨發(fā)育不良，Zmpste24-/-小鼠出現(xiàn)早衰表型，MT1-MMPPRX-CO/PRX-CO小鼠出現(xiàn)骨密度降低和代謝異常，為在分子、細(xì)胞、組織和個(gè)體水平研究關(guān)鍵基因和信號(hào)通路在相關(guān)成骨干細(xì)胞中的作用提供有力工具。此外，本項(xiàng)目組還擁有多種穩(wěn)定的發(fā)育和再生修復(fù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型:如BMP信號(hào)通路(Bmpr1a激活或敲除模型)Bmpr1aCO/CO條件打靶小鼠,低氧誘導(dǎo)因子信號(hào)通路Hif1aCO/CO和VhlhCO/CO條件打靶小鼠，Pten/PI3K信號(hào)通路PtenCO/CO條件打靶小鼠，以及Cre-ERT,OC-Cre,Col2-Cre-ERT,Col2-Cre等工具小鼠。此外，Calponin完全敲除小鼠已拿到嵌合體。另外，還可利用成熟方法制備的去勢(shì)動(dòng)物以及自然增齡衰老的動(dòng)物模型開(kāi)展相關(guān)研究。3.有前期研究工作基礎(chǔ)：在干細(xì)胞分化調(diào)控機(jī)制的研究方面，本組發(fā)現(xiàn)通過(guò)上調(diào)Klotho和胰島素樣受體I使受體鼠的壽命延長(zhǎng)和增齡性變化特征的減弱，從機(jī)制上闡釋了BMSC誘導(dǎo)形成骨髓的功能，并為增齡性疾病的治療提供了新的思路和策略(Blood,2009)。證明利用過(guò)表達(dá)端粒酶基因可增強(qiáng)BMSC體外和體內(nèi)的骨組織形成能力(NatBiotechnol,2002)。在細(xì)胞功能調(diào)控機(jī)制研究方面，本項(xiàng)目組發(fā)現(xiàn)體外敲除beta-catenin基因抑制成骨細(xì)胞的增殖，改變其分化并且減少其在BMP-2處理下的成骨應(yīng)答，表明BMP-2可能在一定程度上通過(guò)調(diào)節(jié)beta-catenin信號(hào)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的功能（JCellBiochem,2009）。發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt通路抑制劑DKK2能促進(jìn)成骨細(xì)胞終末分化并礦化，抑制DKK2后成骨細(xì)胞礦化受阻，表明DKK2在成骨細(xì)胞分化后期起重要調(diào)節(jié)作用（NatGenet,2005）。此外，使用Axin2-lacZknockout(KO)小鼠探索Wnt-beta-catenin信號(hào)在骨形成中的作用，證明在成年小鼠骨形成過(guò)程中Axin2是一種關(guān)鍵的負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過(guò)β-catenin–BMP2/4–Osx信號(hào)通路調(diào)節(jié)成骨分化（JCellSci,2009）。本項(xiàng)目組發(fā)現(xiàn)Smurf2促進(jìn)細(xì)胞成骨分化和軟骨成骨過(guò)程，并證明此作用與beta-catenin水平上調(diào)有關(guān)（JBoneMinerRes,2008）。證明FGFR3獲得性的突變導(dǎo)致骨量的下降，這與p38的磷酸化水平上調(diào)從而導(dǎo)致Erk1/2活性提高有關(guān)，而且是通過(guò)調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的（HumMolGenet,2010）。證明miR-204/211在MSC成脂分化中表達(dá)上升，是Runx2的內(nèi)源性負(fù)調(diào)節(jié)因子，在間充質(zhì)干細(xì)胞中能夠抑制成骨分化并促進(jìn)成脂分化（StemCells,2010）。本項(xiàng)目組證明了炎癥、增齡、細(xì)胞外基質(zhì)等微環(huán)境的變化可以影響干細(xì)胞的生物學(xué)行為，其中Wnt通路可能發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用（Biomaterials,2009,2010,TissueEngineering2004，2006，2007，2008，2009，BiologyoftheCell,2006，2007A，2007B，StemCellDevelopment,2008，2009，CellBiol.Int,2006，2008，JPeriodontalRes,2008A，2008B）。在骨質(zhì)疏松研究方面，本項(xiàng)目組建立了基因敲除小鼠骨骼表型標(biāo)準(zhǔn)化分析平臺(tái)：利用軟X線、骨密度、μCT初步篩查基因敲除小鼠的骨代謝異常；利用組織學(xué)、形態(tài)計(jì)量學(xué)及熒光標(biāo)記分析基因敲除小鼠骨骼的靜態(tài)參數(shù)和動(dòng)態(tài)的骨形成變化。發(fā)現(xiàn)Bgn-/-小鼠出現(xiàn)增齡性骨質(zhì)減少，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Bgn-/-缺失小鼠中BMSC克隆形成能力下降，凋亡活動(dòng)增強(qiáng)，合成I型膠原能力降低（Bone,2006）。發(fā)現(xiàn)Casp3-/-和Casp3+/-小鼠具有骨化延遲和骨密度降低的表型，而且這一過(guò)程是由BMSC骨向分化功能受損造成的，證明caspase-3通過(guò)影響TGF-beta/Smad2通路和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白控制BMSC成骨分化，其表達(dá)異常會(huì)造成骨質(zhì)疏松癥狀（JClinInvest,2004）。本項(xiàng)目組發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞介導(dǎo)的BMSC功能損傷在小鼠卵巢切除后骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制中起重要作用，進(jìn)而證明基于阿司匹林的BMSC干預(yù)可逆轉(zhuǎn)這一過(guò)程實(shí)現(xiàn)新骨形成（PLoSONE，2008）。在骨損傷再生修復(fù)研究方面，本項(xiàng)目組圍繞骨、關(guān)節(jié)、軟組織復(fù)合損傷的修復(fù)與再生開(kāi)展了大量的研究工作，解決了多項(xiàng)骨組織工程技術(shù)從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用過(guò)渡的關(guān)鍵性技術(shù)問(wèn)題，建立了人BMSCs定向誘導(dǎo)成骨的體外培養(yǎng)與大規(guī)模擴(kuò)增體系。在組織工程骨種子細(xì)胞領(lǐng)域，建立了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪源性干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、臍血間充質(zhì)干細(xì)胞等多種成體干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、誘導(dǎo)、鑒定等相關(guān)技術(shù)平臺(tái)（CellsTissuesOrgans,2008;Cryobiolgoy,2008a,b;Biomaterials,2008,2009;TissueEngPartA,2010）。利用骨特異性I型膠原啟動(dòng)子（2.3Col）與GFP結(jié)合示蹤外源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞直接參與骨形成與再生（MolTher.2009）。在支架材料方面，開(kāi)發(fā)了多種具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的可降解骨組織工程生物材料，例如β－磷酸三鈣（β-TCP）、同種異體脫鈣骨、鈣鎂陶瓷等（Biomaterials,2008）。并以BMSCs、ASCs及臍血間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，運(yùn)用組織工程技術(shù)成功修復(fù)多種類型的大動(dòng)物骨組織缺損（Biomaterials,2007;JMaterSciMaterMed,2008;Biomaterials,2009;TissueEngPartA,2010）。項(xiàng)目組還進(jìn)一步開(kāi)展了骨組織工程的初步臨床應(yīng)用研究，并取得了滿意的修復(fù)效果。在小分子化合物篩選研究方面，本組前期的篩選工作著重于從含有五萬(wàn)多種標(biāo)志性小分子化合物文庫(kù)中篩選抑制細(xì)胞衰老的小分子化合物。篩選出的部分小分子化合物在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上可以延緩衰老及骨質(zhì)疏松，表明高通量方法篩選抗骨質(zhì)疏松有效小分子化合物具有可行性。我們將利用此平臺(tái)，以促進(jìn)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化為目的針對(duì)性地篩選抗骨質(zhì)疏松的小分子化合物。上述前期工作為本課題的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)和提供完備的技術(shù)條件。4.實(shí)驗(yàn)條件有保障：本項(xiàng)目組在骨發(fā)育和再生生物學(xué)方面已建立了相應(yīng)的技術(shù)平臺(tái)，在細(xì)胞培養(yǎng)、組織器官重建、基因工程技術(shù)、各種蛋白和分子水平的分析與鑒定、體內(nèi)外分化模型的建立和應(yīng)用研究等與干細(xì)胞、組織工程和再生醫(yī)學(xué)相關(guān)的研究技術(shù)方面積累了非常豐富的經(jīng)驗(yàn)，從而為本項(xiàng)目的完成提供了技術(shù)保障。本項(xiàng)目組由第四軍醫(yī)大學(xué)組織工程研發(fā)中心、全軍骨科研究所、第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所（國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）、組織工程國(guó)家工程研究中心、香港大學(xué)生物化學(xué)系等聯(lián)合組成，擁有完善的實(shí)驗(yàn)設(shè)施和條件，可提供本項(xiàng)目需要的全部大中型設(shè)備。本項(xiàng)目的上述研究成果均基于該研究平臺(tái)，得到了國(guó)內(nèi)外同行的廣泛重視。與美國(guó)南加州大學(xué)、羅徹斯特大學(xué)、英國(guó)利茲大學(xué)等保持密切的合作。這些為本項(xiàng)目的實(shí)施提供了物質(zhì)保障。5.研究隊(duì)伍實(shí)力雄厚：本項(xiàng)目組各課題負(fù)責(zé)人及學(xué)術(shù)骨干均為干細(xì)胞基礎(chǔ)與應(yīng)用、骨發(fā)育再生、衰老研究領(lǐng)域的知名學(xué)者，其中王正國(guó)院士是國(guó)內(nèi)再生醫(yī)學(xué)界權(quán)威專家、羅卓荊教授是骨科界長(zhǎng)江學(xué)者、張文杰研究員是骨再生以及干細(xì)胞分化調(diào)控研究領(lǐng)域?qū)＜?，?xiàng)目組學(xué)術(shù)骨干周中軍教授、劉建教授、施松濤教授、陳棣教授、劉鵬教授等是國(guó)際衰老研究、干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)、骨發(fā)育與再生研究領(lǐng)域的著名學(xué)者，在課題研究和人才培養(yǎng)方面將發(fā)揮重要的作用。創(chuàng)新點(diǎn)和特色：系統(tǒng)闡明相關(guān)干細(xì)胞在骨發(fā)育到衰老變化過(guò)程中的關(guān)鍵作用和調(diào)控機(jī)制，將為其他器官的衰老再生研究提供可借鑒的研究模式。深入探討干細(xì)胞在骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用機(jī)理及關(guān)鍵信號(hào)分子調(diào)控規(guī)律，為骨衰老、骨質(zhì)疏松防治提供新策略。利用本項(xiàng)目組擁有的骨質(zhì)疏松、早衰及發(fā)育缺陷的多種模式動(dòng)物，結(jié)合臨床患者資源開(kāi)展研究，為將基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。課題設(shè)置：各課題間相互關(guān)系本項(xiàng)目圍繞骨發(fā)育、衰老與再生進(jìn)行相關(guān)研究，首先通過(guò)模式動(dòng)物研究明確骨發(fā)育與再生中的重要分子調(diào)控機(jī)制，為指導(dǎo)骨質(zhì)疏松治療和骨再生奠定基礎(chǔ)；其次通過(guò)闡明相關(guān)干細(xì)胞在骨增齡和骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用及調(diào)控機(jī)制，為利用干細(xì)胞進(jìn)行骨質(zhì)疏松治療和骨再生提供理論依據(jù)；同時(shí)探索基于干細(xì)胞的骨質(zhì)疏松治療和骨再生策略和方案。上述各研究是有機(jī)結(jié)合、循序漸進(jìn)的系統(tǒng)，其最終目標(biāo)是明確骨發(fā)育、衰老與再生的機(jī)理并治療骨質(zhì)疏松和骨缺損。課題1：利用模式動(dòng)物研究骨發(fā)育和再生修復(fù)中干細(xì)胞的作用及分子信號(hào)調(diào)控機(jī)制研究目標(biāo)：明確骨發(fā)育和再生修復(fù)中相關(guān)干細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路調(diào)控，明確干細(xì)胞在骨再生修復(fù)中動(dòng)員、定向分化和歸巢中的作用及其分子機(jī)制，闡明干細(xì)胞在骨發(fā)育與再生修復(fù)過(guò)程中生物學(xué)行為變化規(guī)律及相關(guān)的調(diào)控機(jī)制。研究?jī)?nèi)容：重點(diǎn)研究關(guān)鍵信號(hào)通路對(duì)骨發(fā)育相關(guān)干細(xì)胞定向分化的分子調(diào)控；探討關(guān)鍵信號(hào)通路及其相互作用在(成骨)干細(xì)胞分化成熟的不同階段所發(fā)揮的生理功能，在破骨細(xì)胞特異性敲除靶基因，研究關(guān)鍵信號(hào)通路及其分子網(wǎng)絡(luò)對(duì)造血干細(xì)胞向破骨細(xì)胞的發(fā)育、分化、骨形成/吸收藕聯(lián)調(diào)節(jié)過(guò)程中間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化等方面的功能（調(diào)控）；研究重要信號(hào)通路對(duì)骨再生修復(fù)過(guò)程中干細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控。經(jīng)費(fèi)比例：25%承擔(dān)單位：中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)、武漢大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：王正國(guó)學(xué)術(shù)骨干：張波、劉鵬、李磊、翁土軍等課題2：骨增齡過(guò)程中相關(guān)干細(xì)胞生物學(xué)行為變化及調(diào)控機(jī)制研究目標(biāo)：利用早衰動(dòng)物模型，明確骨增齡和衰老過(guò)程中相關(guān)干細(xì)胞的變化特征，闡明增齡變化中關(guān)鍵信號(hào)通路及微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控。研究?jī)?nèi)容：由干細(xì)胞的生物學(xué)變化介導(dǎo)的一系列功能改變是骨生理性或病理性活動(dòng)的基礎(chǔ)，而眾多分子、基因和蛋白信號(hào)通路在調(diào)控成骨相關(guān)干細(xì)胞中發(fā)揮了重要作用。在整體水平研究重要調(diào)控信號(hào)的作用及其相互影響將使我們更深入地認(rèn)識(shí)骨在生理及病理狀態(tài)下的發(fā)育、老化和動(dòng)態(tài)平衡。本研究著眼于骨增齡與衰老過(guò)程中不同信號(hào)通路在調(diào)控干細(xì)胞增殖、分化能力中的相互影響及不同信號(hào)分子發(fā)揮調(diào)控作用的關(guān)鍵途徑，利用基因修飾、微環(huán)境構(gòu)建等技術(shù)研究多種基因與信號(hào)通路在成骨相關(guān)干細(xì)胞中的作用。1.骨增齡和衰老過(guò)程中相關(guān)干細(xì)胞生物學(xué)特性變化的研究2.骨增齡和衰老過(guò)程中相關(guān)干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控機(jī)制研究3.微環(huán)境對(duì)骨增齡和衰老過(guò)程中相關(guān)成骨干細(xì)胞的影響及分子機(jī)制研究經(jīng)費(fèi)比例：25.5%承擔(dān)單位：中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：金巖學(xué)術(shù)骨干：施松濤、陳棣、鄧志宏、金鈁等課題3：干細(xì)胞異常在骨質(zhì)疏松發(fā)生中的作用與機(jī)理研究目標(biāo)：明確基因敲除、去勢(shì)骨疏動(dòng)物模型和骨質(zhì)疏松患者相關(guān)干細(xì)胞生物學(xué)行為變化特點(diǎn)及調(diào)控機(jī)理，闡明不同性激素水平對(duì)干細(xì)胞成骨功能的影響，確定干細(xì)胞在骨質(zhì)疏松發(fā)病中的關(guān)鍵作用。研究?jī)?nèi)容：利用模式動(dòng)物研究骨疏情況下骨損傷再生修復(fù)過(guò)程中骨修復(fù)能力的改變；利用具有骨質(zhì)疏松表型的MT1-MMP-/-基因敲除小鼠模型，結(jié)合Notch信號(hào)通道抑制劑研究MT1-MMP如何影響Notch信號(hào)通路并調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）的自我更新及分化；分別過(guò)表達(dá)及阻斷信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)傳遞分子和效應(yīng)分子，探討骨疏BMSCs對(duì)眾多骨形成信號(hào)反應(yīng)敏感度的改變；探討激素對(duì)BMSCs成骨分化和成脂分化的動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)控；研究骨疏患者中干細(xì)胞功能缺陷的調(diào)控機(jī)制。經(jīng)費(fèi)比例：28.5%承擔(dān)單位：中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)、香港大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：羅卓荊學(xué)術(shù)骨干：周中軍、劉建、陳必良、楊柳等課題4：基于干細(xì)胞的骨質(zhì)疏松治療和相關(guān)骨再生機(jī)理研究目標(biāo)：利用間充質(zhì)干細(xì)胞動(dòng)物移植模型，對(duì)比不同來(lái)源干細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松的效果；建立應(yīng)用小分子化合物預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的方案；應(yīng)用組織工程技術(shù)治療骨質(zhì)疏松狀態(tài)下的骨缺損。研究?jī)?nèi)容：本課題針對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨質(zhì)疏松發(fā)病和骨折愈合中的重要作用，通過(guò)補(bǔ)充外源性干細(xì)胞和調(diào)控干細(xì)胞分化的方式，結(jié)合組織工程技術(shù)，建立大動(dòng)物體內(nèi)骨質(zhì)疏松的治療和骨折后骨再生治療模式，實(shí)現(xiàn)對(duì)骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療。1．比較不同組織來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松的可行性與相關(guān)機(jī)制2.利用成骨誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松3.利用小分子化合物治療骨質(zhì)疏松的可行性與相關(guān)機(jī)制研究4．利用組織工程技術(shù)促進(jìn)骨再生和骨缺損修復(fù)經(jīng)費(fèi)比例：21%承擔(dān)單位：上海交通大學(xué)、香港大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：張文杰學(xué)術(shù)骨干：高一村、周克元、袁捷、謝峰等

四、年度計(jì)劃研究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年研究HIF1ɑ/Vhlh、FGF等信號(hào)通路在HSCs向破骨細(xì)胞定向分化及骨代謝平衡的分子調(diào)控機(jī)制觀察成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞分化過(guò)程中Notch表達(dá)及活性利用模式動(dòng)物比較骨增齡和衰老相關(guān)干細(xì)胞的功能和生物學(xué)行為變化利用基因芯片及microArray技術(shù)研究骨增齡和衰老過(guò)程中分子表達(dá)譜和關(guān)鍵microRNA的改變研究相關(guān)干細(xì)胞的體內(nèi)定位及其周圍微環(huán)境的構(gòu)成在模式動(dòng)物上分別制作不同骨損傷模型，體內(nèi)觀察骨質(zhì)疏松情況下骨損傷修復(fù)能力的改變小鼠、大鼠和成人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定；利用小鼠干細(xì)胞移植模型，研究間充質(zhì)干細(xì)胞的骨髓內(nèi)歸巢能力建立去勢(shì)動(dòng)物（大鼠、綿羊）骨疏模型體外探討不同來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力和免疫學(xué)特性對(duì)前期已篩選出的影響細(xì)胞衰老的關(guān)鍵小分子化合物，評(píng)價(jià)其對(duì)干細(xì)胞的自我更新的影響成功建立若干種單基因或多基因敲除的小鼠動(dòng)物模型，初步闡明HIF1ɑ/Vhlh、FGF等信號(hào)網(wǎng)絡(luò)對(duì)于干細(xì)胞向破骨細(xì)胞定向分化的調(diào)控作用及相關(guān)作用機(jī)制明確干細(xì)胞數(shù)量和功能改變與骨衰老的因果關(guān)系，初步查找干細(xì)胞衰老分子，篩選出3-4種關(guān)鍵microRNA研究骨疏情況下骨損傷再生修復(fù)過(guò)程中骨修復(fù)能力的改變，明確經(jīng)典骨調(diào)節(jié)信號(hào)通路在骨疏損傷修復(fù)中的變化特征建立小鼠、大鼠及成人髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)和破骨細(xì)胞的分離及優(yōu)化培養(yǎng)條件建立骨質(zhì)疏松大動(dòng)物模型，篩選出合適的成骨干細(xì)胞，完成對(duì)已有小分子化合物的評(píng)價(jià)發(fā)表SCI論文2-4篇第二年利用Prx-Cre、Osx-Cre、OC-Cre工具小鼠在成骨細(xì)胞發(fā)育的不同階段剔除靶基因，在模式動(dòng)物整體水平及原代細(xì)胞水平探討關(guān)鍵信號(hào)通路對(duì)干細(xì)胞骨向分化、成熟的不同階段所發(fā)揮的生理功能及對(duì)骨量穩(wěn)態(tài)的影響在成骨細(xì)胞分化中確定notch家族的成員，以及其下游靶基因，分離出GFP+low和GFP+high的細(xì)胞群,進(jìn)行芯片測(cè)定分析Notch強(qiáng)弱條件下其家族基因及靶基因的分布狀態(tài)，以及他們與成骨細(xì)胞分化的相關(guān)性。通過(guò)分析骨增齡和衰老過(guò)程中分子表達(dá)譜的改變，尋找對(duì)于干細(xì)胞功能發(fā)揮重要作用的信號(hào)分子驗(yàn)證篩選出關(guān)鍵microRNA的功能，并探索其在信號(hào)調(diào)控中的靶基因研究骨增齡和衰老過(guò)程中干細(xì)胞微環(huán)境的結(jié)構(gòu)、成分和功能變化獲得條件性MT1-MMP基因敲除小鼠，圍繞MT1-MMP，開(kāi)展其與Notch等信號(hào)通路共同調(diào)節(jié)BMSC的作用的研究破骨細(xì)胞和BMSC共培養(yǎng)體系的建立，鑒定及對(duì)破骨旁分泌效應(yīng)的分析利用干細(xì)胞歸巢機(jī)制，研究提高骨髓內(nèi)干細(xì)胞歸巢效率的方法；動(dòng)物體內(nèi)移植探討不同來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的治療效果運(yùn)用細(xì)胞重編程技術(shù)建立個(gè)體特異性iPS細(xì)胞建立骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成脂分化檢測(cè)平臺(tái)，篩選促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化的小分子化合物建立骨質(zhì)疏松條件下的骨折和骨缺損大動(dòng)物模型，研究相應(yīng)條件下的骨再生修復(fù)機(jī)制明確BMP、Notch、Pten/PI3K、FGF等信號(hào)通路在干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的命運(yùn)抉擇、成骨細(xì)胞的分化成熟中發(fā)揮的功能及對(duì)骨骼代謝的影響及其機(jī)制。初步確定2-3條發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用的信號(hào)通路，在此基礎(chǔ)上深入研究其作用機(jī)制；初步確定關(guān)鍵microRNA，通過(guò)信息學(xué)預(yù)測(cè)確定其調(diào)控的靶基因；初步明確不同微環(huán)境成分對(duì)干細(xì)胞的影響；闡明MT1-MMP介導(dǎo)Notch等信號(hào)對(duì)BMSC的調(diào)節(jié)作用；篩選并建立BMSC/破骨細(xì)胞的共培養(yǎng)體系；明確有效的移植細(xì)胞來(lái)源。建立2-3株大動(dòng)物iPS細(xì)胞株。篩選出2-3種小分子化合物。發(fā)表論文5-10篇。培養(yǎng)博士3-5人，碩士2-3人第三年利用RNAi技術(shù)在間充質(zhì)干細(xì)胞敲降Wnt、Notch、FGF等信號(hào)通路，考察上述信號(hào)通路的改變對(duì)干細(xì)胞骨向分化的影響及介導(dǎo)的表觀遺傳學(xué)改變，采用DNA甲基化芯片、micro-RNA芯片篩查關(guān)鍵靶點(diǎn)體外研究關(guān)鍵信號(hào)分子在相關(guān)干細(xì)胞衰老過(guò)程中發(fā)揮的功能和作用；驗(yàn)證關(guān)鍵microRNA作用的靶基因；通過(guò)體外模擬手段，研究骨衰老過(guò)程中微環(huán)境成分對(duì)干細(xì)胞的作用機(jī)制。在不同BMSC中過(guò)表達(dá)信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)傳遞分子和效應(yīng)分子NICD、Gli1，Gli2等；在BMSC中阻斷信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)傳遞分子和效應(yīng)分子（如上）；激素缺失型骨質(zhì)疏松大鼠BMSC克隆形成能力及群體倍增能力的鑒定分析；激素缺失型骨質(zhì)疏松大鼠BMSC骨向、脂向分化能力的鑒定分析。大動(dòng)物體內(nèi)移植干細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松的長(zhǎng)期觀察。探討誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向間充質(zhì)干細(xì)胞分化，并進(jìn)一步定向?yàn)槌晒羌?xì)胞的方案。研究小分子化合物調(diào)控干細(xì)胞自我更新和分化的機(jī)理，結(jié)合小分子化合物，制備具有高效成骨誘導(dǎo)活性生物材料的研究闡明調(diào)控Wnt、Notch、FGF等信號(hào)通路對(duì)干細(xì)胞骨向分化的作用及表觀遺傳學(xué)變化，為實(shí)現(xiàn)人工控制干細(xì)胞定向分化奠定理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)確定關(guān)鍵信號(hào)分子的作用機(jī)制；驗(yàn)證關(guān)鍵microRNA調(diào)控的靶基因；明確微環(huán)境成分影響干細(xì)胞的作用機(jī)制；明確骨疏BMSC對(duì)眾多骨形成信號(hào)反應(yīng)敏感度的改變；明確激素對(duì)BMSC的調(diào)節(jié)作用機(jī)制；明確干細(xì)胞治療的基本療效。建立干細(xì)胞誘導(dǎo)分化方案。初步闡明小分子化合物的調(diào)控機(jī)制，制備出具有成骨誘導(dǎo)活性的生物材料。培養(yǎng)博士2-4人，碩士2-4人。發(fā)表SCI論文2-4篇；申請(qǐng)專利1-2項(xiàng)第四年利用Prx-Cre及Cre-ERT工具小鼠在發(fā)育的不同階段實(shí)現(xiàn)雙基因剔除，探討關(guān)鍵信號(hào)通路間的相互作用對(duì)干細(xì)胞成骨/成脂肪、成軟骨分化的調(diào)控體內(nèi)改變關(guān)鍵信號(hào)分子的表達(dá)水平，研究其對(duì)骨增齡和衰老過(guò)程中的影響及作用機(jī)制；體內(nèi)上調(diào)或下調(diào)關(guān)鍵microRNA，進(jìn)一步研究其對(duì)骨增齡和衰老過(guò)程中干細(xì)胞的影響及作用機(jī)制；通過(guò)改變局部微環(huán)境中特定成分，進(jìn)一步研究其對(duì)于干細(xì)胞的調(diào)控功能和作用機(jī)制。比較骨質(zhì)疏松模型中信號(hào)網(wǎng)絡(luò)改變的異同；采用基因差異表達(dá)的方法篩選出骨疏中BMSCs骨向分化缺陷中關(guān)鍵基因并進(jìn)行功能驗(yàn)證。大動(dòng)物體內(nèi)移植干細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松的長(zhǎng)期觀察。成骨誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞移植治療骨質(zhì)疏松的研究。應(yīng)用小分子藥物治療骨質(zhì)疏松模型動(dòng)物;新型生物材料的體內(nèi)評(píng)價(jià)。利用組織工程技術(shù)，修復(fù)骨質(zhì)疏松大動(dòng)物體內(nèi)骨組織缺損的研究。闡明不同信號(hào)通路的相互作用對(duì)干細(xì)胞定向分化的調(diào)控作用及機(jī)制。明確關(guān)鍵信號(hào)分子的作用機(jī)制；明確microRNA的作用機(jī)制；闡明干細(xì)胞與特定微環(huán)境的相互作用；比較不同骨質(zhì)疏松模式動(dòng)物中信號(hào)網(wǎng)絡(luò)改變的異同，建立骨質(zhì)疏松癥中信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模型.；闡明激素缺乏引起骨質(zhì)疏松發(fā)病的分子機(jī)理；明確干細(xì)胞治療的長(zhǎng)期療效。初步闡明應(yīng)用iPS細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松的可行性。初步闡明應(yīng)用小分子化合物治療骨質(zhì)疏松的可行性。初步闡明應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)骨缺損的可行性。發(fā)表SCI論文5-10篇；申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利1-3項(xiàng)培養(yǎng)博士2-4人，碩士2-4人第五年利用Cre-ERT工具小鼠實(shí)現(xiàn)在特定時(shí)期（骨折修復(fù)）剔除靶基因，研究關(guān)鍵信號(hào)通路的增強(qiáng)或降低對(duì)干細(xì)胞動(dòng)員、遷移到骨損傷部位及骨折愈合的影響通過(guò)前期研究明確的關(guān)鍵信號(hào)分子、microRNA及干細(xì)胞微環(huán)境成分，探索調(diào)節(jié)或改善骨衰老過(guò)程的相關(guān)干細(xì)胞功能的可能手段骨質(zhì)疏松關(guān)鍵調(diào)控因子的篩選和功能驗(yàn)證；大動(dòng)物體內(nèi)移植干細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松的長(zhǎng)期觀察。iPS細(xì)胞移植治療骨質(zhì)疏松的長(zhǎng)期觀察研究。小分子藥物治療骨質(zhì)疏松模型動(dòng)物長(zhǎng)期觀察。組織工程技術(shù)修復(fù)骨質(zhì)疏松大動(dòng)物體內(nèi)骨組織缺損的長(zhǎng)期觀察。明確FGF、Pten/PI3K、Notch等信號(hào)水平對(duì)骨再生的影響，為通過(guò)調(diào)整關(guān)鍵信號(hào)通路促進(jìn)干細(xì)胞遷移分化、促進(jìn)骨愈合提供候選靶標(biāo)。提出可能的調(diào)節(jié)或改善干細(xì)胞功能的手段和方法；篩選與骨質(zhì)疏松發(fā)病密切相關(guān)的信號(hào)分子，為今后大規(guī)模用于骨質(zhì)疏松篩查奠定基礎(chǔ)；闡明干細(xì)胞治療的可行性，建立相應(yīng)的治療方案。闡明應(yīng)用小分子化合物治療骨質(zhì)疏松的可行性，建立相應(yīng)的治療方案建立應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)骨缺損的治療方案。發(fā)表SCI論文5-10篇；申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利1-2項(xiàng)

一、研究?jī)?nèi)容關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題1.利用模式動(dòng)物與基因干擾技術(shù)，特別是增齡性骨衰老動(dòng)物模型，通過(guò)研究骨發(fā)育和再生修復(fù)關(guān)鍵基因和信號(hào)通路，闡明在骨發(fā)育和再生修復(fù)中干細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制。2.通過(guò)研究骨增齡、衰老及成骨-破骨平衡過(guò)程中干細(xì)胞的生物學(xué)行為及關(guān)鍵基因的變化，闡明干細(xì)胞在骨組織動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程中的作用與調(diào)控機(jī)制。3.利用特定基因剔除骨疏小鼠、去勢(shì)大鼠骨疏模型及骨疏人群等，比較相關(guān)骨干細(xì)胞生物學(xué)行為的改變及調(diào)控機(jī)制，重點(diǎn)研究不同性激素水平對(duì)干細(xì)胞成骨功能的影響，闡述干細(xì)胞在骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用與機(jī)理。4.針對(duì)干細(xì)胞數(shù)量和功能的改變對(duì)骨質(zhì)疏松的影響，建立基于干細(xì)胞的骨質(zhì)疏松預(yù)防及治療策略。