干細胞在骨衰老

項目名稱：干細胞在骨衰老與再生中的作用及關(guān)鍵信號分子調(diào)控首席科學(xué)家：金巖中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)起止年限：2011.1至2015.8依托部門：總后勤部衛(wèi)生部

二、預(yù)期目標本項目的總體目標：圍繞骨衰老與再生研究的重大科學(xué)問題，闡明干細胞在骨發(fā)育與再生中的作用及相關(guān)的調(diào)控機制，明確骨增齡、衰老過程中相關(guān)干細胞的變化特征及其調(diào)控機制，明確干細胞在成骨-破骨平衡中的作用，闡明干細胞功能異常導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)病的分子機制，建立相應(yīng)的治療骨質(zhì)疏松和促進骨再生的新策略。通過本項目的研究，搭建骨衰老和再生研究平臺，培養(yǎng)和建立一支學(xué)術(shù)水平高、創(chuàng)新能力強的研究人才隊伍，使我國在相關(guān)領(lǐng)域的研究達到國際先進水平。五年預(yù)期目標:1.闡明骨發(fā)育、衰老和再生修復(fù)中相關(guān)干細胞分化的關(guān)鍵基因和信號通路調(diào)控，明確干細胞在骨再生修復(fù)中動員、定向分化和歸巢中的作用及其分子機制，2.明確骨增齡和衰老過程中相關(guān)干細胞的生物學(xué)行為變化規(guī)律以及干細胞在成骨-破骨平衡中的作用及調(diào)控機制，闡明增齡及衰老中關(guān)鍵信號通路及微環(huán)境對干細胞成骨分化的調(diào)控。3.明確基因敲除、去勢骨疏動物模型和骨質(zhì)疏松患者相關(guān)干細胞生物學(xué)行為變化特點及調(diào)控機理，闡明不同性激素水平對干細胞成骨功能的影響，確定干細胞在骨質(zhì)疏松發(fā)病中的關(guān)鍵作用。4.對比不同來源干細胞治療骨質(zhì)疏松的效果；建立應(yīng)用小分子化合物預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的方案；應(yīng)用干細胞與組織工程技術(shù)治療骨質(zhì)疏松狀態(tài)下的骨缺損。5.發(fā)表具有較高影響因子的代表性SCI論文20-40篇；申請發(fā)明專利5～10項；培養(yǎng)博士后10～20人，博士40～60人，碩士20～40人；爭取1～2人獲得全國百篇優(yōu)秀博士論文；吸引國外優(yōu)秀的學(xué)者和留學(xué)博士回國工作。

三、研究方案總體研究思路：骨在發(fā)育、增齡、衰老和受損后的再生過程中始終保持著組織動態(tài)變化的特點，以往研究多側(cè)重于終末分化細胞的功能研究，缺乏系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究，且主要對成骨細胞、破骨細胞這兩種效應(yīng)細胞展開研究，而對其上游的干細胞關(guān)注甚少。項目組前期工作顯示干細胞在上述過程中扮演了至關(guān)重要的角色，同時干細胞功能受到嚴密的分子調(diào)控，當關(guān)鍵分子調(diào)控途徑產(chǎn)生異常時，常引起干細胞功能受損從而導(dǎo)致骨組織發(fā)育不良、早衰或由衰老引起的骨質(zhì)疏松、骨損傷愈合與再生修復(fù)能力下降等表型。因此，干細胞是探討骨組織相關(guān)重大疾病防治策略的重要靶標，闡明干細胞在骨發(fā)育和衰老過程中的重要角色，及其在骨組織再生修復(fù)中發(fā)揮的作用和機制，不僅能為深入認識人體器官發(fā)育提供理論依據(jù)，而且將提供新的組織退行性病變的防治策略。本項目擬應(yīng)用模式動物，以骨發(fā)育、衰老和再生不同階段的相關(guān)干細胞研究為切入點，探討干細胞在上述過程中關(guān)鍵信號通路變化規(guī)律及機制；闡述干細胞生物學(xué)功能改變在骨質(zhì)疏松發(fā)病中的重要作用；在此基礎(chǔ)上建立骨質(zhì)疏松預(yù)警方案及基于調(diào)節(jié)干細胞功能的治療策略；確定工程化策略在骨折和骨缺損環(huán)境中的再生治療模式。技術(shù)路徑：可行性分析：1.理論和方法可行：干細胞在骨的發(fā)育、衰老和再生過程中扮演著至關(guān)重要的角色，而在此過程中干細胞受到復(fù)雜的各種信號分子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，是決定其介導(dǎo)的骨生理病理表型的關(guān)鍵因素。本項目組基于基因敲除小鼠的前期研究揭示了老齡性骨質(zhì)疏松與骨髓間充質(zhì)干細胞功能不良相關(guān)，證明一些關(guān)鍵基因在骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨向分化中起重要作用，其缺失可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松疾病發(fā)生。在骨修復(fù)再生方面，本組以不同來源的間充質(zhì)干細胞作為種子細胞，運用組織工程技術(shù)成功修復(fù)多種類型的大動物骨組織缺損，證明了利用干細胞進行骨質(zhì)疏松性骨損傷的再生修復(fù)的可行性。而現(xiàn)代生物技術(shù)尤其是細胞、分子生物學(xué)的發(fā)展為我們闡明此調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了成熟有效的方法體系，本組具有的條件性基因敲除/入、RNAi、高通量小分子化合物篩選平臺等都為本項目的實施打下基礎(chǔ)。2.擁有多種模式動物作研究模型：本項目組成員長期從事骨發(fā)育再生的研究，已建立一批轉(zhuǎn)基因動物模型，如Cre-ERT;PtenCO/CO小鼠表現(xiàn)出骨發(fā)育不良，Zmpste24-/-小鼠出現(xiàn)早衰表型，MT1-MMPPRX-CO/PRX-CO小鼠出現(xiàn)骨密度降低和代謝異常，為在分子、細胞、組織和個體水平研究關(guān)鍵基因和信號通路在相關(guān)成骨干細胞中的作用提供有力工具。此外，本項目組還擁有多種穩(wěn)定的發(fā)育和再生修復(fù)實驗動物模型:如BMP信號通路(Bmpr1a激活或敲除模型)Bmpr1aCO/CO條件打靶小鼠,低氧誘導(dǎo)因子信號通路Hif1aCO/CO和VhlhCO/CO條件打靶小鼠，Pten/PI3K信號通路PtenCO/CO條件打靶小鼠，以及Cre-ERT,OC-Cre,Col2-Cre-ERT,Col2-Cre等工具小鼠。此外，Calponin完全敲除小鼠已拿到嵌合體。另外，還可利用成熟方法制備的去勢動物以及自然增齡衰老的動物模型開展相關(guān)研究。3.有前期研究工作基礎(chǔ)：在干細胞分化調(diào)控機制的研究方面，本組發(fā)現(xiàn)通過上調(diào)Klotho和胰島素樣受體I使受體鼠的壽命延長和增齡性變化特征的減弱，從機制上闡釋了BMSC誘導(dǎo)形成骨髓的功能，并為增齡性疾病的治療提供了新的思路和策略(Blood,2009)。證明利用過表達端粒酶基因可增強BMSC體外和體內(nèi)的骨組織形成能力(NatBiotechnol,2002)。在細胞功能調(diào)控機制研究方面，本項目組發(fā)現(xiàn)體外敲除beta-catenin基因抑制成骨細胞的增殖，改變其分化并且減少其在BMP-2處理下的成骨應(yīng)答，表明BMP-2可能在一定程度上通過調(diào)節(jié)beta-catenin信號調(diào)節(jié)成骨細胞的功能（JCellBiochem,2009）。發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt通路抑制劑DKK2能促進成骨細胞終末分化并礦化，抑制DKK2后成骨細胞礦化受阻，表明DKK2在成骨細胞分化后期起重要調(diào)節(jié)作用（NatGenet,2005）。此外，使用Axin2-lacZknockout(KO)小鼠探索Wnt-beta-catenin信號在骨形成中的作用，證明在成年小鼠骨形成過程中Axin2是一種關(guān)鍵的負調(diào)節(jié)因子，通過β-catenin–BMP2/4–Osx信號通路調(diào)節(jié)成骨分化（JCellSci,2009）。本項目組發(fā)現(xiàn)Smurf2促進細胞成骨分化和軟骨成骨過程，并證明此作用與beta-catenin水平上調(diào)有關(guān)（JBoneMinerRes,2008）。證明FGFR3獲得性的突變導(dǎo)致骨量的下降，這與p38的磷酸化水平上調(diào)從而導(dǎo)致Erk1/2活性提高有關(guān)，而且是通過調(diào)控成骨細胞和破骨細胞的活性來實現(xiàn)的（HumMolGenet,2010）。證明miR-204/211在MSC成脂分化中表達上升，是Runx2的內(nèi)源性負調(diào)節(jié)因子，在間充質(zhì)干細胞中能夠抑制成骨分化并促進成脂分化（StemCells,2010）。本項目組證明了炎癥、增齡、細胞外基質(zhì)等微環(huán)境的變化可以影響干細胞的生物學(xué)行為，其中Wnt通路可能發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用（Biomaterials,2009,2010,TissueEngineering2004，2006，2007，2008，2009，BiologyoftheCell,2006，2007A，2007B，StemCellDevelopment,2008，2009，CellBiol.Int,2006，2008，JPeriodontalRes,2008A，2008B）。在骨質(zhì)疏松研究方面，本項目組建立了基因敲除小鼠骨骼表型標準化分析平臺：利用軟X線、骨密度、μCT初步篩查基因敲除小鼠的骨代謝異常；利用組織學(xué)、形態(tài)計量學(xué)及熒光標記分析基因敲除小鼠骨骼的靜態(tài)參數(shù)和動態(tài)的骨形成變化。發(fā)現(xiàn)Bgn-/-小鼠出現(xiàn)增齡性骨質(zhì)減少，進一步發(fā)現(xiàn)Bgn-/-缺失小鼠中BMSC克隆形成能力下降，凋亡活動增強，合成I型膠原能力降低（Bone,2006）。發(fā)現(xiàn)Casp3-/-和Casp3+/-小鼠具有骨化延遲和骨密度降低的表型，而且這一過程是由BMSC骨向分化功能受損造成的，證明caspase-3通過影響TGF-beta/Smad2通路和細胞周期調(diào)節(jié)蛋白控制BMSC成骨分化，其表達異常會造成骨質(zhì)疏松癥狀（JClinInvest,2004）。本項目組發(fā)現(xiàn)T細胞介導(dǎo)的BMSC功能損傷在小鼠卵巢切除后骨質(zhì)疏松發(fā)病機制中起重要作用，進而證明基于阿司匹林的BMSC干預(yù)可逆轉(zhuǎn)這一過程實現(xiàn)新骨形成（PLoSONE，2008）。在骨損傷再生修復(fù)研究方面，本項目組圍繞骨、關(guān)節(jié)、軟組織復(fù)合損傷的修復(fù)與再生開展了大量的研究工作，解決了多項骨組織工程技術(shù)從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用過渡的關(guān)鍵性技術(shù)問題，建立了人BMSCs定向誘導(dǎo)成骨的體外培養(yǎng)與大規(guī)模擴增體系。在組織工程骨種子細胞領(lǐng)域，建立了骨髓間充質(zhì)干細胞、脂肪源性干細胞、表皮干細胞、臍血間充質(zhì)干細胞等多種成體干細胞的分離、培養(yǎng)、擴增、誘導(dǎo)、鑒定等相關(guān)技術(shù)平臺（CellsTissuesOrgans,2008;Cryobiolgoy,2008a,b;Biomaterials,2008,2009;TissueEngPartA,2010）。利用骨特異性I型膠原啟動子（2.3Col）與GFP結(jié)合示蹤外源性骨髓間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸，發(fā)現(xiàn)干細胞直接參與骨形成與再生（MolTher.2009）。在支架材料方面，開發(fā)了多種具有自主知識產(chǎn)權(quán)的可降解骨組織工程生物材料，例如β－磷酸三鈣（β-TCP）、同種異體脫鈣骨、鈣鎂陶瓷等（Biomaterials,2008）。并以BMSCs、ASCs及臍血間充質(zhì)干細胞作為種子細胞，運用組織工程技術(shù)成功修復(fù)多種類型的大動物骨組織缺損（Biomaterials,2007;JMaterSciMaterMed,2008;Biomaterials,2009;TissueEngPartA,2010）。項目組還進一步開展了骨組織工程的初步臨床應(yīng)用研究，并取得了滿意的修復(fù)效果。在小分子化合物篩選研究方面，本組前期的篩選工作著重于從含有五萬多種標志性小分子化合物文庫中篩選抑制細胞衰老的小分子化合物。篩選出的部分小分子化合物在動物實驗上可以延緩衰老及骨質(zhì)疏松，表明高通量方法篩選抗骨質(zhì)疏松有效小分子化合物具有可行性。我們將利用此平臺，以促進干細胞向成骨細胞分化為目的針對性地篩選抗骨質(zhì)疏松的小分子化合物。上述前期工作為本課題的進一步研究奠定基礎(chǔ)和提供完備的技術(shù)條件。4.實驗條件有保障：本項目組在骨發(fā)育和再生生物學(xué)方面已建立了相應(yīng)的技術(shù)平臺，在細胞培養(yǎng)、組織器官重建、基因工程技術(shù)、各種蛋白和分子水平的分析與鑒定、體內(nèi)外分化模型的建立和應(yīng)用研究等與干細胞、組織工程和再生醫(yī)學(xué)相關(guān)的研究技術(shù)方面積累了非常豐富的經(jīng)驗，從而為本項目的完成提供了技術(shù)保障。本項目組由第四軍醫(yī)大學(xué)組織工程研發(fā)中心、全軍骨科研究所、第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所（國家重點實驗室）、組織工程國家工程研究中心、香港大學(xué)生物化學(xué)系等聯(lián)合組成，擁有完善的實驗設(shè)施和條件，可提供本項目需要的全部大中型設(shè)備。本項目的上述研究成果均基于該研究平臺，得到了國內(nèi)外同行的廣泛重視。與美國南加州大學(xué)、羅徹斯特大學(xué)、英國利茲大學(xué)等保持密切的合作。這些為本項目的實施提供了物質(zhì)保障。5.研究隊伍實力雄厚：本項目組各課題負責(zé)人及學(xué)術(shù)骨干均為干細胞基礎(chǔ)與應(yīng)用、骨發(fā)育再生、衰老研究領(lǐng)域的知名學(xué)者，其中王正國院士是國內(nèi)再生醫(yī)學(xué)界權(quán)威專家、羅卓荊教授是骨科界長江學(xué)者、張文杰研究員是骨再生以及干細胞分化調(diào)控研究領(lǐng)域?qū)＜遥椖拷M學(xué)術(shù)骨干周中軍教授、劉建教授、施松濤教授、陳棣教授、劉鵬教授等是國際衰老研究、干細胞與再生醫(yī)學(xué)、骨發(fā)育與再生研究領(lǐng)域的著名學(xué)者，在課題研究和人才培養(yǎng)方面將發(fā)揮重要的作用。創(chuàng)新點和特色：系統(tǒng)闡明相關(guān)干細胞在骨發(fā)育到衰老變化過程中的關(guān)鍵作用和調(diào)控機制，將為其他器官的衰老再生研究提供可借鑒的研究模式。深入探討干細胞在骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用機理及關(guān)鍵信號分子調(diào)控規(guī)律，為骨衰老、骨質(zhì)疏松防治提供新策略。利用本項目組擁有的骨質(zhì)疏松、早衰及發(fā)育缺陷的多種模式動物，結(jié)合臨床患者資源開展研究，為將基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。課題設(shè)置：各課題間相互關(guān)系本項目圍繞骨發(fā)育、衰老與再生進行相關(guān)研究，首先通過模式動物研究明確骨發(fā)育與再生中的重要分子調(diào)控機制，為指導(dǎo)骨質(zhì)疏松治療和骨再生奠定基礎(chǔ)；其次通過闡明相關(guān)干細胞在骨增齡和骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用及調(diào)控機制，為利用干細胞進行骨質(zhì)疏松治療和骨再生提供理論依據(jù)；同時探索基于干細胞的骨質(zhì)疏松治療和骨再生策略和方案。上述各研究是有機結(jié)合、循序漸進的系統(tǒng)，其最終目標是明確骨發(fā)育、衰老與再生的機理并治療骨質(zhì)疏松和骨缺損。課題1：利用模式動物研究骨發(fā)育和再生修復(fù)中干細胞的作用及分子信號調(diào)控機制研究目標：明確骨發(fā)育和再生修復(fù)中相關(guān)干細胞分化的關(guān)鍵基因和信號通路調(diào)控，明確干細胞在骨再生修復(fù)中動員、定向分化和歸巢中的作用及其分子機制，闡明干細胞在骨發(fā)育與再生修復(fù)過程中生物學(xué)行為變化規(guī)律及相關(guān)的調(diào)控機制。研究內(nèi)容：重點研究關(guān)鍵信號通路對骨發(fā)育相關(guān)干細胞定向分化的分子調(diào)控；探討關(guān)鍵信號通路及其相互作用在(成骨)干細胞分化成熟的不同階段所發(fā)揮的生理功能，在破骨細胞特異性敲除靶基因，研究關(guān)鍵信號通路及其分子網(wǎng)絡(luò)對造血干細胞向破骨細胞的發(fā)育、分化、骨形成/吸收藕聯(lián)調(diào)節(jié)過程中間充質(zhì)干細胞向成骨細胞的分化等方面的功能（調(diào)控）；研究重要信號通路對骨再生修復(fù)過程中干細胞生物學(xué)行為的調(diào)控。經(jīng)費比例：25%承擔(dān)單位：中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)、武漢大學(xué)課題負責(zé)人：王正國學(xué)術(shù)骨干：張波、劉鵬、李磊、翁土軍等課題2：骨增齡過程中相關(guān)干細胞生物學(xué)行為變化及調(diào)控機制研究目標：利用早衰動物模型，明確骨增齡和衰老過程中相關(guān)干細胞的變化特征，闡明增齡變化中關(guān)鍵信號通路及微環(huán)境對干細胞成骨分化的調(diào)控。研究內(nèi)容：由干細胞的生物學(xué)變化介導(dǎo)的一系列功能改變是骨生理性或病理性活動的基礎(chǔ)，而眾多分子、基因和蛋白信號通路在調(diào)控成骨相關(guān)干細胞中發(fā)揮了重要作用。在整體水平研究重要調(diào)控信號的作用及其相互影響將使我們更深入地認識骨在生理及病理狀態(tài)下的發(fā)育、老化和動態(tài)平衡。本研究著眼于骨增齡與衰老過程中不同信號通路在調(diào)控干細胞增殖、分化能力中的相互影響及不同信號分子發(fā)揮調(diào)控作用的關(guān)鍵途徑，利用基因修飾、微環(huán)境構(gòu)建等技術(shù)研究多種基因與信號通路在成骨相關(guān)干細胞中的作用。1.骨增齡和衰老過程中相關(guān)干細胞生物學(xué)特性變化的研究2.骨增齡和衰老過程中相關(guān)干細胞成骨分化的調(diào)控機制研究3.微環(huán)境對骨增齡和衰老過程中相關(guān)成骨干細胞的影響及分子機制研究經(jīng)費比例：25.5%承擔(dān)單位：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)課題負責(zé)人：金巖學(xué)術(shù)骨干：施松濤、陳棣、鄧志宏、金鈁等課題3：干細胞異常在骨質(zhì)疏松發(fā)生中的作用與機理研究目標：明確基因敲除、去勢骨疏動物模型和骨質(zhì)疏松患者相關(guān)干細胞生物學(xué)行為變化特點及調(diào)控機理，闡明不同性激素水平對干細胞成骨功能的影響，確定干細胞在骨質(zhì)疏松發(fā)病中的關(guān)鍵作用。研究內(nèi)容：利用模式動物研究骨疏情況下骨損傷再生修復(fù)過程中骨修復(fù)能力的改變；利用具有骨質(zhì)疏松表型的MT1-MMP-/-基因敲除小鼠模型，結(jié)合Notch信號通道抑制劑研究MT1-MMP如何影響Notch信號通路并調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）的自我更新及分化；分別過表達及阻斷信號通路的關(guān)鍵信號傳遞分子和效應(yīng)分子，探討骨疏BMSCs對眾多骨形成信號反應(yīng)敏感度的改變；探討激素對BMSCs成骨分化和成脂分化的動態(tài)平衡的調(diào)控；研究骨疏患者中干細胞功能缺陷的調(diào)控機制。經(jīng)費比例：28.5%承擔(dān)單位：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)、香港大學(xué)課題負責(zé)人：羅卓荊學(xué)術(shù)骨干：周中軍、劉建、陳必良、楊柳等課題4：基于干細胞的骨質(zhì)疏松治療和相關(guān)骨再生機理研究目標：利用間充質(zhì)干細胞動物移植模型，對比不同來源干細胞治療骨質(zhì)疏松的效果；建立應(yīng)用小分子化合物預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的方案；應(yīng)用組織工程技術(shù)治療骨質(zhì)疏松狀態(tài)下的骨缺損。研究內(nèi)容：本課題針對骨髓間充質(zhì)干細胞在骨質(zhì)疏松發(fā)病和骨折愈合中的重要作用，通過補充外源性干細胞和調(diào)控干細胞分化的方式，結(jié)合組織工程技術(shù)，建立大動物體內(nèi)骨質(zhì)疏松的治療和骨折后骨再生治療模式，實現(xiàn)對骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療。1．比較不同組織來源間充質(zhì)干細胞治療骨質(zhì)疏松的可行性與相關(guān)機制2.利用成骨誘導(dǎo)的iPS細胞治療骨質(zhì)疏松3.利用小分子化合物治療骨質(zhì)疏松的可行性與相關(guān)機制研究4．利用組織工程技術(shù)促進骨再生和骨缺損修復(fù)經(jīng)費比例：21%承擔(dān)單位：上海交通大學(xué)、香港大學(xué)課題負責(zé)人：張文杰學(xué)術(shù)骨干：高一村、周克元、袁捷、謝峰等

四、年度計劃研究內(nèi)容預(yù)期目標第一年研究HIF1ɑ/Vhlh、FGF等信號通路在HSCs向破骨細胞定向分化及骨代謝平衡的分子調(diào)控機制觀察成骨細胞及破骨細胞分化過程中Notch表達及活性利用模式動物比較骨增齡和衰老相關(guān)干細胞的功能和生物學(xué)行為變化利用基因芯片及microArray技術(shù)研究骨增齡和衰老過程中分子表達譜和關(guān)鍵microRNA的改變研究相關(guān)干細胞的體內(nèi)定位及其周圍微環(huán)境的構(gòu)成在模式動物上分別制作不同骨損傷模型，體內(nèi)觀察骨質(zhì)疏松情況下骨損傷修復(fù)能力的改變小鼠、大鼠和成人骨髓基質(zhì)干細胞和破骨細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定；利用小鼠干細胞移植模型，研究間充質(zhì)干細胞的骨髓內(nèi)歸巢能力建立去勢動物（大鼠、綿羊）骨疏模型體外探討不同來源間充質(zhì)干細胞的成骨分化能力和免疫學(xué)特性對前期已篩選出的影響細胞衰老的關(guān)鍵小分子化合物，評價其對干細胞的自我更新的影響成功建立若干種單基因或多基因敲除的小鼠動物模型，初步闡明HIF1ɑ/Vhlh、FGF等信號網(wǎng)絡(luò)對于干細胞向破骨細胞定向分化的調(diào)控作用及相關(guān)作用機制明確干細胞數(shù)量和功能改變與骨衰老的因果關(guān)系，初步查找干細胞衰老分子，篩選出3-4種關(guān)鍵microRNA研究骨疏情況下骨損傷再生修復(fù)過程中骨修復(fù)能力的改變，明確經(jīng)典骨調(diào)節(jié)信號通路在骨疏損傷修復(fù)中的變化特征建立小鼠、大鼠及成人髓基質(zhì)干細胞(BMSC)和破骨細胞的分離及優(yōu)化培養(yǎng)條件建立骨質(zhì)疏松大動物模型，篩選出合適的成骨干細胞，完成對已有小分子化合物的評價發(fā)表SCI論文2-4篇第二年利用Prx-Cre、Osx-Cre、OC-Cre工具小鼠在成骨細胞發(fā)育的不同階段剔除靶基因，在模式動物整體水平及原代細胞水平探討關(guān)鍵信號通路對干細胞骨向分化、成熟的不同階段所發(fā)揮的生理功能及對骨量穩(wěn)態(tài)的影響在成骨細胞分化中確定notch家族的成員，以及其下游靶基因，分離出GFP+low和GFP+high的細胞群,進行芯片測定分析Notch強弱條件下其家族基因及靶基因的分布狀態(tài)，以及他們與成骨細胞分化的相關(guān)性。通過分析骨增齡和衰老過程中分子表達譜的改變，尋找對于干細胞功能發(fā)揮重要作用的信號分子驗證篩選出關(guān)鍵microRNA的功能，并探索其在信號調(diào)控中的靶基因研究骨增齡和衰老過程中干細胞微環(huán)境的結(jié)構(gòu)、成分和功能變化獲得條件性MT1-MMP基因敲除小鼠，圍繞MT1-MMP，開展其與Notch等信號通路共同調(diào)節(jié)BMSC的作用的研究破骨細胞和BMSC共培養(yǎng)體系的建立，鑒定及對破骨旁分泌效應(yīng)的分析利用干細胞歸巢機制，研究提高骨髓內(nèi)干細胞歸巢效率的方法；動物體內(nèi)移植探討不同來源間充質(zhì)干細胞的治療效果運用細胞重編程技術(shù)建立個體特異性iPS細胞建立骨髓間充質(zhì)干細胞成骨、成脂分化檢測平臺，篩選促進干細胞成骨分化的小分子化合物建立骨質(zhì)疏松條件下的骨折和骨缺損大動物模型，研究相應(yīng)條件下的骨再生修復(fù)機制明確BMP、Notch、Pten/PI3K、FGF等信號通路在干細胞向成骨細胞分化的命運抉擇、成骨細胞的分化成熟中發(fā)揮的功能及對骨骼代謝的影響及其機制。初步確定2-3條發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用的信號通路，在此基礎(chǔ)上深入研究其作用機制；初步確定關(guān)鍵microRNA，通過信息學(xué)預(yù)測確定其調(diào)控的靶基因；初步明確不同微環(huán)境成分對干細胞的影響；闡明MT1-MMP介導(dǎo)Notch等信號對BMSC的調(diào)節(jié)作用；篩選并建立BMSC/破骨細胞的共培養(yǎng)體系；明確有效的移植細胞來源。建立2-3株大動物iPS細胞株。篩選出2-3種小分子化合物。發(fā)表論文5-10篇。培養(yǎng)博士3-5人，碩士2-3人第三年利用RNAi技術(shù)在間充質(zhì)干細胞敲降Wnt、Notch、FGF等信號通路，考察上述信號通路的改變對干細胞骨向分化的影響及介導(dǎo)的表觀遺傳學(xué)改變，采用DNA甲基化芯片、micro-RNA芯片篩查關(guān)鍵靶點體外研究關(guān)鍵信號分子在相關(guān)干細胞衰老過程中發(fā)揮的功能和作用；驗證關(guān)鍵microRNA作用的靶基因；通過體外模擬手段，研究骨衰老過程中微環(huán)境成分對干細胞的作用機制。在不同BMSC中過表達信號通路的關(guān)鍵信號傳遞分子和效應(yīng)分子NICD、Gli1，Gli2等；在BMSC中阻斷信號通路的關(guān)鍵信號傳遞分子和效應(yīng)分子（如上）；激素缺失型骨質(zhì)疏松大鼠BMSC克隆形成能力及群體倍增能力的鑒定分析；激素缺失型骨質(zhì)疏松大鼠BMSC骨向、脂向分化能力的鑒定分析。大動物體內(nèi)移植干細胞治療骨質(zhì)疏松的長期觀察。探討誘導(dǎo)iPS細胞向間充質(zhì)干細胞分化，并進一步定向為成骨細胞的方案。研究小分子化合物調(diào)控干細胞自我更新和分化的機理，結(jié)合小分子化合物，制備具有高效成骨誘導(dǎo)活性生物材料的研究闡明調(diào)控Wnt、Notch、FGF等信號通路對干細胞骨向分化的作用及表觀遺傳學(xué)變化，為實現(xiàn)人工控制干細胞定向分化奠定理論與實驗基礎(chǔ)確定關(guān)鍵信號分子的作用機制；驗證關(guān)鍵microRNA調(diào)控的靶基因；明確微環(huán)境成分影響干細胞的作用機制；明確骨疏BMSC對眾多骨形成信號反應(yīng)敏感度的改變；明確激素對BMSC的調(diào)節(jié)作用機制；明確干細胞治療的基本療效。建立干細胞誘導(dǎo)分化方案。初步闡明小分子化合物的調(diào)控機制，制備出具有成骨誘導(dǎo)活性的生物材料。培養(yǎng)博士2-4人，碩士2-4人。發(fā)表SCI論文2-4篇；申請專利1-2項第四年利用Prx-Cre及Cre-ERT工具小鼠在發(fā)育的不同階段實現(xiàn)雙基因剔除，探討關(guān)鍵信號通路間的相互作用對干細胞成骨/成脂肪、成軟骨分化的調(diào)控體內(nèi)改變關(guān)鍵信號分子的表達水平，研究其對骨增齡和衰老過程中的影響及作用機制；體內(nèi)上調(diào)或下調(diào)關(guān)鍵microRNA，進一步研究其對骨增齡和衰老過程中干細胞的影響及作用機制；通過改變局部微環(huán)境中特定成分，進一步研究其對于干細胞的調(diào)控功能和作用機制。比較骨質(zhì)疏松模型中信號網(wǎng)絡(luò)改變的異同；采用基因差異表達的方法篩選出骨疏中BMSCs骨向分化缺陷中關(guān)鍵基因并進行功能驗證。大動物體內(nèi)移植干細胞治療骨質(zhì)疏松的長期觀察。成骨誘導(dǎo)的iPS細胞移植治療骨質(zhì)疏松的研究。應(yīng)用小分子藥物治療骨質(zhì)疏松模型動物;新型生物材料的體內(nèi)評價。利用組織工程技術(shù)，修復(fù)骨質(zhì)疏松大動物體內(nèi)骨組織缺損的研究。闡明不同信號通路的相互作用對干細胞定向分化的調(diào)控作用及機制。明確關(guān)鍵信號分子的作用機制；明確microRNA的作用機制；闡明干細胞與特定微環(huán)境的相互作用；比較不同骨質(zhì)疏松模式動物中信號網(wǎng)絡(luò)改變的異同，建立骨質(zhì)疏松癥中信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模型.；闡明激素缺乏引起骨質(zhì)疏松發(fā)病的分子機理；明確干細胞治療的長期療效。初步闡明應(yīng)用iPS細胞治療骨質(zhì)疏松的可行性。初步闡明應(yīng)用小分子化合物治療骨質(zhì)疏松的可行性。初步闡明應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)骨缺損的可行性。發(fā)表SCI論文5-10篇；申請國家發(fā)明專利1-3項培養(yǎng)博士2-4人，碩士2-4人第五年利用Cre-ERT工具小鼠實現(xiàn)在特定時期（骨折修復(fù)）剔除靶基因，研究關(guān)鍵信號通路的增強或降低對干細胞動員、遷移到骨損傷部位及骨折愈合的影響通過前期研究明確的關(guān)鍵信號分子、microRNA及干細胞微環(huán)境成分，探索調(diào)節(jié)或改善骨衰老過程的相關(guān)干細胞功能的可能手段骨質(zhì)疏松關(guān)鍵調(diào)控因子的篩選和功能驗證；大動物體內(nèi)移植干細胞治療骨質(zhì)疏松的長期觀察。iPS細胞移植治療骨質(zhì)疏松的長期觀察研究。小分子藥物治療骨質(zhì)疏松模型動物長期觀察。組織工程技術(shù)修復(fù)骨質(zhì)疏松大動物體內(nèi)骨組織缺損的長期觀察。明確FGF、Pten/PI3K、Notch等信號水平對骨再生的影響，為通過調(diào)整關(guān)鍵信號通路促進干細胞遷移分化、促進骨愈合提供候選靶標。提出可能的調(diào)節(jié)或改善干細胞功能的手段和方法；篩選與骨質(zhì)疏松發(fā)病密切相關(guān)的信號分子，為今后大規(guī)模用于骨質(zhì)疏松篩查奠定基礎(chǔ)；闡明干細胞治療的可行性，建立相應(yīng)的治療方案。闡明應(yīng)用小分子化合物治療骨質(zhì)疏松的可行性，建立相應(yīng)的治療方案建立應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)骨缺損的治療方案。發(fā)表SCI論文5-10篇；申請國家發(fā)明專利1-2項

一、研究內(nèi)容關(guān)鍵科學(xué)問題1.利用模式動物與基因干擾技術(shù)，特別是增齡性骨衰老動物模型，通過研究骨發(fā)育和再生修復(fù)關(guān)鍵基因和信號通路，闡明在骨發(fā)育和再生修復(fù)中干細胞分化的調(diào)控機制。2.通過研究骨增齡、衰老及成骨-破骨平衡過程中干細胞的生物學(xué)行為及關(guān)鍵基因的變化，闡明干細胞在骨組織動態(tài)平衡過程中的作用與調(diào)控機制。3.利用特定基因剔除骨疏小鼠、去勢大鼠骨疏模型及骨疏人群等，比較相關(guān)骨干細胞生物學(xué)行為的改變及調(diào)控機制，重點研究不同性激素水平對干細胞成骨功能的影響，闡述干細胞在骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用與機理。4.針對干細胞數(shù)量和功能的改變對骨質(zhì)疏松的影響，建立基于干細胞的骨質(zhì)疏松預(yù)防及治療策略。