第七章電子克隆的原理和應(yīng)用

生物信息學(xué)Bioinformatics編號(hào)名稱第一章生物信息學(xué)引論第二章生物信息學(xué)的生物學(xué)基礎(chǔ)第三章生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)資源第四章DNA和蛋白質(zhì)序列分析第五章系統(tǒng)發(fā)生分析第六章基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析第七章電子克隆電子克隆

insilicocloning第七章什么是電子克??？電子克隆的條件和特點(diǎn)；電子克隆的思路和具體例子；電子克隆中最常見的問題及解決辦法；電子克隆中常用的生物信息學(xué)軟件和網(wǎng)站介紹；電子克隆的應(yīng)用前景;內(nèi)容提要：更多的有關(guān)電子克隆:水稻功能基因的電子克隆策略,中國(guó)水稻科學(xué),2002,16:295-298水稻葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因的電子克隆,遺傳學(xué)報(bào),2002,29:1012-1016?????1.什么是電子克??？電子克?。╥nsilicocloning）是近年來(lái)伴隨著基因組和EST計(jì)劃發(fā)展起來(lái)的基因克隆新方法，它的主要原理是利用日益發(fā)展的生物信息學(xué)技術(shù)，借助電子計(jì)算機(jī)的巨大運(yùn)算能力，通過EST或基因組的序列組裝和拼接，利用RT-PCR的方法快速獲得功能基因。基于原理：物種同源蛋白氨基酸序列相似性（保守性）1.什么是電子克??？2.電子克隆的條件和特點(diǎn)：前提條件；研究物種:豐富的核酸序列信息；

比較物種:較多的基因研究；強(qiáng)大的計(jì)算機(jī)分析軟硬件的支持。2.電子克隆的條件和特點(diǎn)：目前已經(jīng)基本完成基因組測(cè)序的常見生物：

人小鼠大鼠線蟲果蠅擬南芥水稻家雞家蠶……各種生物的EST數(shù)目人類基因的電子克隆：

2002年4月16日的第七屆國(guó)際人類基因組學(xué)大會(huì)上，我國(guó)唯一的獲Poster獎(jiǎng)?wù)撐氖恰度祟愋禄虻碾娮涌寺『蛯?shí)驗(yàn)確認(rèn)》。他們發(fā)現(xiàn)電子克隆的4個(gè)人類基因中，有3個(gè)與相應(yīng)的GenBank基因組注解不同，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)確認(rèn)確定為GenBank中的注解錯(cuò)誤。證明了基因組注解中存在著很多問題，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。目前發(fā)表的有關(guān)人類基因克隆的絕大部分都利用了人類的基因組或EST數(shù)據(jù)。人類2/3的基因需要實(shí)驗(yàn)確認(rèn)！植物領(lǐng)域才剛剛開始！電子克隆的特點(diǎn)：

投入低； 速度快； 技術(shù)要求不高； 針對(duì)性強(qiáng)等。2.電子克隆的條件和特點(diǎn)：種子氨基酸序列tBLASTn水稻基因組contig或BAC/PAC外顯子預(yù)測(cè)RT-PCR，克隆，測(cè)序人工計(jì)算機(jī)3.電子克隆的基本思路及具體實(shí)例：EST拼接設(shè)計(jì)PCR引物水稻幼苗提取總RNA合成cDNA第一鏈RT-PCR克隆測(cè)序生物信息學(xué)分析種子氨基酸序列tBLASTn水稻基因組contig或BAC/PAC外顯子預(yù)測(cè)RT-PCR，克隆，測(cè)序人工計(jì)算機(jī)EST拼接3OsG6PDH

的克隆以小麥G6PDH蛋白（BAA97662

）搜索水稻nr數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果3OsG6PDH

的克隆以小麥G6PDH蛋白（BAA97662

）搜索水稻nr數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果4OsG6PDH

的克隆以小麥G6PDH蛋白（BAA97662

）搜索水稻nr數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果3OsG6PDH

的克隆以小麥G6PDH蛋白（BAA97662

）搜索水稻nr數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果3.OsG6PDH

的克隆以獲得的包含OsG6PDH的水稻基因組序列為對(duì)象，進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè):方法一:

通過Softberry網(wǎng)站進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)/berry.phtml方法二:搜索水稻EST數(shù)據(jù)庫(kù)，加以驗(yàn)證（探針序列的選擇？）與玉米6PGDH（AF061837）匹配的部分水稻ESTs3.Os6PGDH的克?。核綩sG6PDH的基因組結(jié)構(gòu)

OsG6PDH基因組序列約5kb，包括15個(gè)外顯子，14個(gè)內(nèi)含子,內(nèi)含子序列完全符合5’GU…AG3’的特征。3.OsG6PDH

的克隆根據(jù)水稻OsG6PDH的基因組結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果,得到預(yù)測(cè)的cDNA序列(包含ORF)設(shè)計(jì)PCR引物.但是選擇什么來(lái)源的cDNA模板呢?如何確定?方法一:方法二:最后通過RT-PCR的方法分離該基因,并進(jìn)行序列測(cè)定.3.OsG6PDH

的克隆設(shè)計(jì)PCR引物水稻各種組織分別提取總RNA合成cDNA第一鏈水稻鋅指蛋白氨基酸序列搜索水稻基因組庫(kù)水稻鋅指蛋白基因序列PCR擴(kuò)增克隆EST拼接OsZFP基因家族的電子克隆流程圖3.OsZFP

基因家族的克?。?.OsZFP

基因家族的克?。篛sZFP家族3.OsZFP

基因家族的克隆：

逐個(gè)對(duì)每個(gè)ZFP基因進(jìn)行完整性分析(有一定的策略)

基因表達(dá)特性分析.

設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增.有時(shí)難以確定5’端完整性：序列比較

Kozak規(guī)則[A/GNNAUGG]

起始密碼子上游的同閱讀框序列中是否存在終止密碼子

Northern雜交

RACE技術(shù)4.電子克隆中最常見的問題及解決辦法有時(shí)候難以確定其表達(dá)的時(shí)期和條件：

EST的表達(dá)時(shí)期

其他類似基因的表達(dá)時(shí)期從多組織進(jìn)行擴(kuò)增（尤其是基因家族的分離）4.電子克隆中最常見的問題及解決辦法常用的序列數(shù)據(jù)庫(kù)--GenBankGenBank

包括了所有已公布的基因組、EST數(shù)據(jù)。

Nr無(wú)冗余數(shù)據(jù)庫(kù)（包括mRNA,DNA...）

dbEST

數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank提供的檢索工具——BLAST

Standardnucleotide-nucleotideBLAST[blastn]Standardprotein-proteinBLAST[blastp]Nucleotidequery-Proteindb[blastx]Proteinquery-Translateddb[tblastn]Nucleotidequery-Translateddb[tblastx]

5.電子克隆中常用的生物信息學(xué)軟件和網(wǎng)站介紹常用的基因組分析軟件：FGENESH:http://

最好的分析軟件，可以預(yù)測(cè)多種生物的基因組結(jié)構(gòu)，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，編碼區(qū)以及轉(zhuǎn)錄終子位點(diǎn)。GenScan:http:///genscan.html

只能進(jìn)行人、擬南芥和玉米的分析國(guó)內(nèi)鏡像：14:8888/RiceGAAS:http://ricegaas.dna.affrc.go.jpRiceHMM:http://rgp.dna.affrc.go.jp/ricehmmSplicePredictor:http://WebGene:http://125.r.it/~webgene/5.電子克隆中常用的生物信息學(xué)軟件和網(wǎng)站介紹常用的基因組分析軟件：?jiǎn)?dòng)子預(yù)測(cè)：http:///

選擇起始密碼子上游2Kb的序列進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)域的預(yù)測(cè)，同時(shí)還可以標(biāo)出轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的位置，可以與softberry的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證比較。5.電子克隆中常用的生物信息學(xué)軟件和網(wǎng)站介紹電子拼接::9090/clone.html5.電子克隆中常用的生物信息學(xué)軟件和網(wǎng)站介紹

毫無(wú)疑問，人類的電子克隆將得到進(jìn)一步的發(fā)展，越來(lái)越多的基因?qū)⑼ㄟ^電子克隆的方法獲得，功能基因組學(xué)的研究將興起。

植物中目前只有擬南芥和水稻公布了基因組序列，將在電子克隆中占據(jù)主要地位。尤其是水稻基因的克隆將越來(lái)越多的利用發(fā)布的序列信息資源。6.電子克隆的應(yīng)用前景

隨著遺傳圖譜與以序列為基礎(chǔ)的物理圖譜的整合，直接將目的基因（或QTL）與連鎖標(biāo)記的遺傳距離轉(zhuǎn)換為物理圖距后的電子克隆有可能成為取代傳統(tǒng)的圖位克隆的重要措施(擬南芥)6.電子克隆的應(yīng)用前景對(duì)于采用抑制差減雜交、差異顯示或基因表達(dá)系列分析等方法得到的EST采取電子克隆的方法獲得具有完整基因的策略，則可成為取代RACE或cDNA文庫(kù)篩選的最佳方案。6.電子克隆的應(yīng)用前景

將更容易的獲得基因的染色體分布，結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的信息，基因的鑒定和功能描述更加容易。

植物中除了擬南芥和水稻，很多EST數(shù)目較多的植物也可以利用EST的策略進(jìn)行電子克隆，同時(shí)也可以間接的利用電子克隆的策略（更方便的文庫(kù)篩選）。

電子克隆同樣是發(fā)現(xiàn)新基因的重要途徑。6.電子克隆的應(yīng)用前景誠(chéng)然，電子克隆的出現(xiàn)可以大大加速基因的分離和鑒定，但功能克?。▓D位克隆、SSH等）的方法仍然是不可替代的，電子克隆可以大大加速和簡(jiǎn)化這些傳統(tǒng)的基因分離途徑。對(duì)于其他物種中已經(jīng)充分鑒定功能的基因，電子克隆對(duì)于功能基因的分離利用，研究基因的結(jié)構(gòu)、起源、分類和進(jìn)化具有非常重要的意義。對(duì)于新基因，電子克隆仍然需要結(jié)合轉(zhuǎn)基因等方法進(jìn)行功能驗(yàn)證。小結(jié)什么是電子克??？電子克隆的條件和特點(diǎn)；電子克隆的思路和具體例子；電子克隆中最常見的問題及解決辦法；電子克隆中常用的生物信息學(xué)軟件和網(wǎng)站介紹；電子克隆的應(yīng)用前景;內(nèi)容提要：?jiǎn)栴}:什么是電子克隆?什么是contig?給你一個(gè)小麥基因的蛋白序列,希望你能分離水稻的同源基因,