第13章+細(xì)胞的增殖和調(diào)控

MathematicalBiosciencesInstitute(OhioStateUniv),2October2003第十三章細(xì)胞的周期與調(diào)控13.1細(xì)胞周期概述13.2MPF13.2.1MPF的發(fā)現(xiàn)13.2.2MPF的成分13.2.2周期蛋白13.2.3CDK13.3細(xì)胞周期控制13.3.1G1/S13.3.2S/G2/M13.3.3M期的調(diào)控13.4細(xì)胞周期的模型

1細(xì)胞周期的簡(jiǎn)介由細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過(guò)程，叫細(xì)胞周期。分為4個(gè)期：–G1期(gap1)，指從有絲分裂完成到期DNA復(fù)制之前的間隙時(shí)間。–S期(synthesisphase)，指DNA復(fù)制的時(shí)期。–G2期(gap2)，指DNA復(fù)制完成到有絲分裂開(kāi)始之前的一段時(shí)間。–M期又稱(chēng)D期(mitosisordivision)，細(xì)胞分裂開(kāi)始到結(jié)束。2001NobelPrizeLelandH.Hartwell1970s“Checkpoint”Yeastgenetics~100CDCgenesStartgeneTimHunt1980sCyclinsSeaUrchinsPaulM.Nurse1970sCDKsyeast13.2MPF(Mphase–promotingfactor),Cyclin,CDK

2.1細(xì)胞促成熟因子（MPF）的發(fā)現(xiàn)2.2MPF的組成周期蛋白(B)CDK(cyclindependentkinase)1970sRao和Johnson發(fā)現(xiàn)與M期細(xì)胞(Hela)融合的間期細(xì)胞染色體發(fā)生凝縮，稱(chēng)為早熟凝集染色體(prematurelycondensedchromosome，PCC)。–G1期PCC為單線(xiàn)狀，因DNA未復(fù)制。–S期PCC為粉末狀，因DNA由多個(gè)部位開(kāi)始復(fù)制。–G2期PCC為雙線(xiàn)染色體，說(shuō)明DNA復(fù)制已完成。甚至不同類(lèi)的M期細(xì)胞也可誘導(dǎo)PCC產(chǎn)生，說(shuō)明M期細(xì)胞具有促進(jìn)間期細(xì)胞進(jìn)行分裂的因子，即成熟促進(jìn)因子(maturationpromotingfactor，MPF)。G1期和M期的銜接2.1MPF的發(fā)現(xiàn)S期和M期的銜接G2期和M期的銜接ManfredLohkaandJimMaller(UCHSC) -usedcellfreeassaytopurifyMPF -testedvariouscytosolicfractionsforMPFactivityMPFisa2subunitproteinkinase -32kDaand45kDaMPFMPFCdkMPF的歷史PCCM-phaseTriggerMPFP32andP45,kinase非洲爪蟾(1988)Cdcgenefoundin

yeast

P34cdc2triggerG2/MP34cdc2bindwithP56cdc13active

Cyclinfoundinurchin,keyfactorForM-phase(1983)

MPFincludeCdkandcyclinp32=P34cdc2=CDKP45=P56cdc13=cyclinB2.2周期蛋白1983年最先發(fā)現(xiàn)G1期:cyclinC,cyclinD,cyclinECln1,Cln2,Cln3(Yeast)M-期:cyclinA,cyclin相對(duì)穩(wěn)定A2DestroyboxCyclinboxB1PEST,G1cyclinrenewalC不同的周期蛋白在不同的細(xì)胞周期表達(dá)，結(jié)合不同的CDK，控制CDK激酶的活性。特點(diǎn)：在細(xì)胞周期中呈周期性變化。含有一段約100個(gè)氨基酸的保守序列，稱(chēng)為周期蛋白框，介導(dǎo)周期蛋白與CDK結(jié)合。有絲分裂中細(xì)胞周期蛋白的調(diào)控在TimHunt的周期蛋白的研究中闡明了MPF的調(diào)控規(guī)律

PSTAIREantibodyBindsALLCDK’s2.3CDK

CyclindependkinaseCDKICDKkinasedomainCdk1=cdc2Cdk3cdk8細(xì)胞周期控制六、細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)（checkpoint）

組成：感受器、信號(hào)傳導(dǎo)通路、效應(yīng)器。?主要檢驗(yàn)點(diǎn)：–G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)：DNA是否損傷？細(xì)胞外環(huán)境是否適宜？細(xì)胞體積是否足夠大？在酵母中稱(chēng)start點(diǎn)，在哺乳動(dòng)物中稱(chēng)R點(diǎn)(restrictionpoint)。–S期檢驗(yàn)點(diǎn)：DNA復(fù)制是否完成？–G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)：DNA是否損傷？細(xì)胞體積是否足夠大？–中-后期檢驗(yàn)點(diǎn)：紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)。3.1TheG1/S檢驗(yàn)點(diǎn)環(huán)境因素生長(zhǎng)因子內(nèi)部因素DNA損傷G1cyclinD(D1,D2,D3),E,AG1CDK,CDK2,4,6cyclinD+CDK4,6cyclinE,A+CDK2cyclinD(D1,D2,D3)iskeyfactorforG1/ScyclinEiskeyfactorforstartups-phaseG1周期蛋白通過(guò)泛素結(jié)合PEST降解Oringinrecognitioncomplex,復(fù)制起始復(fù)合物Orc1-6DNAreplication-licensingfactortheoryMinichromosomemaintenanceprotein,Mcm2-73.2S/G2/M

阻止DNA未完全復(fù)制時(shí)啟動(dòng)M期只有DNA復(fù)制正確完成，方可啟動(dòng)未復(fù)制完成的DNA會(huì)釋放一些信號(hào)。導(dǎo)致細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)受阻

CDC25活性低但Wee1活性高，MPF不能活化

MPF失活3.3M期的調(diào)控MPF的激活M期檢驗(yàn)點(diǎn)MPF和G2檢驗(yàn)點(diǎn)MPF-促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)G2檢驗(yàn)點(diǎn)Thr161Tyr14,15PMPF活化M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的積累。?結(jié)合cyclinB的CDK1被Wee1將Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不斷積累。?在M期，Wee1的活性下降，CDC25使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障礙。?CDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CDKactivatingkinaseCAK)的作用下完成的。Tyr15Inhibitory:AddedbyWee1RemovedbyCdc25Thr160Activating:CDKaddsafterCyclinbindingcyclinB+CDKinactiveWee1/mik1andCDKKinaseActiveCDK14,15amicacidInactivepre-MPFCDK160+p,14.15-pCdc25cWee1/mik1CDKKinaseMPFinducesmultiplenuclearandcytoplasmicchangesattheonsetofMphase,bothbyactivatingotherproteinkinasesandbyphosphorylatingproteinssuchascondensinsandthenuclearlamins.G1SG2MG1G1SG2MG1M期檢驗(yàn)點(diǎn)：檢驗(yàn)染色體是否連接到紡錘體上。后期促進(jìn)復(fù)合物APC與M期調(diào)控APC:AnaphasePromotingComplexM期向后期轉(zhuǎn)換依賴(lài)嚴(yán)格調(diào)控APC1-8APC調(diào)控CyclinB和其他蛋白泛素化降解紡崔體裝配檢驗(yàn)點(diǎn)控制APC活性Mad2Cdc20周期蛋白降解瑞典皇家科學(xué)院6日宣布，將2004年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予以色列科學(xué)家阿龍·切哈諾沃、阿夫拉姆·赫什科和美國(guó)科學(xué)家歐文·羅斯，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了泛素調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)降解。其實(shí)他們的成果就是發(fā)現(xiàn)了一種蛋白質(zhì)“死亡”的重要機(jī)理死亡之吻ProteindegradationNeednotenergy,onlyneedenzymeNeedenergy,certaintime,certainpositionandcertaindirectionproteindegradation一種被稱(chēng)為泛素的多肽在需要能量的蛋白質(zhì)降解過(guò)程中扮演著重要角色。這種多肽由76個(gè)氨基酸組成，它最初是從小牛的胰臟中分離出來(lái)的。它就像標(biāo)簽一樣，被貼上標(biāo)簽的蛋白質(zhì)就會(huì)被運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)的“垃圾處理廠(chǎng)”，在那里被降解。有絲分裂周期蛋白的聚泛素化原來(lái)細(xì)胞中存在著E1、E2和E3三種酶，它們各有分工。E1負(fù)責(zé)激活泛素分子。泛素分子被激活后就被運(yùn)送到E2上，E2負(fù)責(zé)把泛素分子綁在需要降解的蛋白質(zhì)上。但E2并不認(rèn)識(shí)指定的蛋白質(zhì)，這就需要E3幫助。E3具有辨認(rèn)指定蛋白質(zhì)的功能。當(dāng)E2攜帶著泛素分子在E3的指引下接近指定蛋白質(zhì)時(shí)，E2就把泛素分子綁在指定蛋白質(zhì)上。這一過(guò)程不斷重復(fù)，指定蛋白質(zhì)上就被綁了一批泛素分子。HighEnergyThioesterBond,canbetransferredfromE1toE2,E3,orsubstrateUbiquitinisTransferredviaThioesterBondsMitoticCyclinsareDestroyedbyUbiquitin-DependentProteolysisproteosome總結(jié)4細(xì)胞周期模型YeastSizeandMorphologyThroughtheCellCycle酵母的大小和形態(tài)學(xué)在細(xì)胞周期中特征。Thestagesofmitosisandcytokinesisinananimalcell.在動(dòng)物細(xì)胞中有絲分裂和胞質(zhì)分裂的不同階段。出芽酵母Thestagesofmitosisandcytokinesisinananimalcell.

5細(xì)胞周期檢測(cè)方法細(xì)胞周期的時(shí)間長(zhǎng)短與物種的細(xì)胞類(lèi)型有關(guān)。通常G1期持續(xù)時(shí)間差異較大，M期最短約0.5～4.5小時(shí)。標(biāo)記有絲分裂百分率法（percentagelabeledmitoses，PLM）：對(duì)測(cè)定細(xì)胞進(jìn)行脈沖標(biāo)記、定時(shí)取材、利用放射自顯影技術(shù)顯示標(biāo)記細(xì)胞，通過(guò)統(tǒng)計(jì)標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的辦法來(lái)測(cè)定細(xì)胞周期。放射標(biāo)記物為3H或者14C標(biāo)記的TDR。5.1細(xì)胞周期時(shí)間的測(cè)定細(xì)胞周期同步化

細(xì)胞同步化(synchronization)是指在自然過(guò)程中發(fā)生或經(jīng)人為處理造成的細(xì)胞周期同步化。（一）自然同步化1、多核體：如：粘菌、瘧原蟲(chóng)。2、某些水生動(dòng)物的受精卵：如海膽、海參、兩棲類(lèi)。3、增殖抑制解除后的同步分裂：如真菌的休眠孢子移入適宜環(huán)境后，它們一起發(fā)芽，同步分裂。人工同步化

1、選擇同步化1）有絲分裂選擇法：M期細(xì)胞與培養(yǎng)皿的附著性低，振蕩脫離器壁收集。–優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，同步化程度高，細(xì)胞不受藥物傷害。–缺點(diǎn)：獲得的細(xì)胞數(shù)量較少（分裂細(xì)胞約占1%～2%）。2）細(xì)胞沉降分離法：M期細(xì)胞體積大，可用離心分離。–優(yōu)點(diǎn)：可用于任何懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞。–缺點(diǎn)：