核酸分子雜交

姜雨航王雪憶

核酸分子雜交技術(shù)原理及在環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用PRESENTERSNAME摘要

簡要介紹在環(huán)境微生物研究中幾種常見的核酸分子雜交技術(shù)的原理以及其在環(huán)境微生物監(jiān)測、環(huán)境微生物分類和環(huán)境微生物治理污染中的應(yīng)用及案例核酸分子雜交技術(shù)在研究環(huán)境微生物中發(fā)揮重要作用，大大擴(kuò)展了環(huán)境微生物學(xué)的研究空間。引言

核酸分子雜交是一種基于DNA分子堿基互補(bǔ)配對(duì)原則用特異性cDNA探針與待測DNA或RNA形成雜交分子的生物學(xué)技術(shù)核酸分子雜交具有高度特異性及檢測方法的靈敏性

核酸分子雜交技術(shù)一般可分為窄縫雜交法（較少使用）、印跡轉(zhuǎn)移雜交法及原位雜交法CONTENTS熒光原位雜交(FISH)技術(shù)

數(shù)量印跡雜交技術(shù)印跡轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)基因芯片技術(shù)原理及方法

利用一小段用熒光物質(zhì)標(biāo)記過的寡核苷酸序列(一般15～30個(gè)堿基)為探針，將其投加到環(huán)境樣品中，利用與樣品中同源性微生物靶DNA互補(bǔ)配對(duì)特性經(jīng)變性退火復(fù)性形成探針與靶DNA的雜交體，在熒光顯微鏡下直接觀察和檢測特定微生物的數(shù)量與分布。

熒光原位雜交(FISH)技術(shù)熒光原位雜交(FISH)技術(shù)案例FISH技術(shù)的應(yīng)用克服了除磷細(xì)菌和某些硝化細(xì)菌難以用常規(guī)方法培養(yǎng)等困難。應(yīng)用ALFIb、HGC和Bet42a探針檢測出的細(xì)菌量所占比例在10％～64％；應(yīng)用MP2和CF探針探測到的細(xì)菌含量在4％以下。

在除磷細(xì)菌硝化細(xì)菌研究中的應(yīng)用

案例應(yīng)用FISH技術(shù)在EBFR（強(qiáng)化除磷

）工藝中探測到生物除磷的優(yōu)勢(shì)種群Rholocyclus。Wagner和BruceER等研究了一套較完善的對(duì)硝化細(xì)菌檢測的FISH技術(shù)。FISH技術(shù)也被廣泛地應(yīng)用于活性污泥系統(tǒng)、膜生物反應(yīng)器和硝化流化床反應(yīng)器等污水處理系統(tǒng)中。在環(huán)境微生物功能研究中的應(yīng)用

FISH應(yīng)用在對(duì)特定功能菌的發(fā)現(xiàn)和分布研究上，用某一類功能酶的保守序列作探針，則對(duì)環(huán)境中的功能微生物菌群進(jìn)行監(jiān)測。用纖維素酶的保守序列作探針，就可以研究環(huán)境中具有纖維素降解能力的微生物的分布。BetheH等用NS0190或NS01225作探針，可檢測出環(huán)境中的氨氧化細(xì)菌的存在。熒光原位雜交(FISH)技術(shù)數(shù)量印跡雜交技術(shù)由其信號(hào)的比值來反映某類特定微生物菌群的相對(duì)豐度，還可間接反映該類微生物的相對(duì)生理活性。應(yīng)用數(shù)量印跡雜交，可獲得環(huán)境樣品中特定DNA序列的豐度信息。利用通用型探針和專一性探針與環(huán)境樣品中的總DNA和特定類群DNA進(jìn)行雜交Monique等利用MPH一730(通用型探針)和MPHm一994(專一性探針)兩種探針以測定噬甲基菌屬(Methylophaga)和海洋中的噬甲基菌屬的相對(duì)豐度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)噬甲基菌屬在海洋沉積物中廣泛存在

從環(huán)境樣品中提取細(xì)菌總DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶切割、電泳，將條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上與DNA或RNA探針雜交，從雜交條帶的數(shù)量推知功能微生物菌群的豐度

印跡轉(zhuǎn)移雜交包括Southern和Northern印跡雜交技術(shù)，應(yīng)用于樣品中的DNA和RNA樣品，以前者在環(huán)境微生物研究中應(yīng)用較廣

印跡轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)Southern印跡雜交技術(shù)原理從環(huán)境樣品中提取細(xì)菌總DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶切割、電泳，將條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上與DNA或RNA探針雜交，從雜交條帶的數(shù)量推知功能微生物菌群的豐度

印跡轉(zhuǎn)移雜交包括Southern和Northern印跡雜交技術(shù)，應(yīng)用于樣品中的DNA和RNA樣品，以前者在環(huán)境微生物研究中應(yīng)用較廣

印跡轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)Southern印跡雜交技術(shù)原理Northern技術(shù)是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法被測樣品是RNA。經(jīng)甲醛或聚乙二醛變性及電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，進(jìn)行雜交反應(yīng)，以鑒定基中特定mRNA分子的量與大小將耐藥基因?qū)胄∈蠊撬杓?xì)胞

,能使之獲得對(duì)化療藥物的抵抗,骨髓造血和免疫功能得到一定程度的保護(hù)。利用含雙順反子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將醛脫氫酶基因和多藥耐藥基因?qū)爰?xì)胞,并在體外獲得有效表達(dá)。

印跡轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)Northern印跡雜交技術(shù)原理應(yīng)用基因芯片是將大量核苷酸探針以點(diǎn)陣列方式高密度地排列于特定的支持物上．如硅片、玻片、薄膜等，與樣品DNA雜交后通過激光共聚焦等技術(shù)分析靶DNA的存在和相對(duì)含量的現(xiàn)代分子生物學(xué)方法將某一分類單元的特異DNA片段或功能基因的保守片段作為探針整合在芯片上，則可以對(duì)環(huán)境樣品中的微生物結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行監(jiān)測分析，如16sRNA基因芯片?；蛐酒夹g(shù)方法原理基因芯片技術(shù)應(yīng)用一應(yīng)用二應(yīng)用三生化循環(huán)過程關(guān)鍵酶(如去硝化)的功能基芯片，可用于檢測自然環(huán)境中微生物群落的生理地位和功能由含有源于核糖體核酸(rRNA)基因探針的系統(tǒng)發(fā)育的寡核苷酸芯片，應(yīng)用于微生物群落的系統(tǒng)發(fā)育分析構(gòu)建純培養(yǎng)微生物群落基因組芯片，根據(jù)可培養(yǎng)成分反映微生物群落。結(jié)語彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法對(duì)于難以培養(yǎng)環(huán)境微生物研究的缺陷，更為客觀地反映微生物在自然或人工系統(tǒng)中的狀況核酸分子雜交技術(shù)直接在樣品和微生物群落、生理功能特征兩者間構(gòu)建了信息橋梁在包括環(huán)境微生物污染治理和種群監(jiān)測、分類尤其是環(huán)境微生物功能的研究等環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用日益廣泛為環(huán)境監(jiān)測和污染治理提供