RT-PCR及瓊脂糖凝膠電泳原理與結(jié)果

RT-PCR及瓊脂糖凝膠電泳原理與技術(shù)RT-PCR（reversetranscriptional-PCR）RT-PCR原理DNA聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增RT-PCR主要用途檢測特異基因的表達量特異基因的組織定位構(gòu)建cDNA文庫鑒定已轉(zhuǎn)錄序列是否發(fā)生突變RT-PCR反應(yīng)體系10×buffer2ulMg2+4uldNTP2ulRnaseInhibitor0.4ulAMVRnaseXL0.4ulAMV-Taq0.4ulH2O3.8ul引物Ⅰ1ul引物Ⅱ1ulRNA(≤1ug)5ul一步法RT-PCRRT-PCR反應(yīng)體系ComponentsVolume(μl)RNA8(1μg)5xR.T.buffer4dNTPs(10mmol/L)2Primer1Rnasin(50U/μl)0.4AMV-RT((10U/μl)1.0DEPC-H2O3.6Total20兩步法RT-PCRComponentsVolume(μlR.T.Product5.010xPCRbuffer2.5MgCl2(25mmol/L)2.5Primer11Primer21TaqDNApolymerase1ddH2O12Total25cDNAPCR擴增cDNA第一鏈合成反應(yīng)實驗?zāi)康牧私釸T-PCR的基本原理。熟悉RT-PCR的常規(guī)步驟。掌握瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。實驗要求掌握PCR技術(shù)。學(xué)會操作PCR儀。熟悉瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。實驗原理聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。

實驗原理PCR是一種選擇性體外擴增DNA或RNA片段的方法，其特異性是由兩個人工合成的引物序列決定的。在DNA聚合酶催化的一系列合成反應(yīng)中，用兩段寡核苷酸作為反應(yīng)的引物。一般情況下，這兩段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分別與模板DNA兩條鏈上的各一段序列互補；而這兩段模板序列又分別位于待擴增DNA區(qū)段的兩側(cè)。反應(yīng)時，首先是在摩爾數(shù)過量的兩段寡核苷酸及4種dNTP存在下，將模板進行加熱變性。隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，使引物與它的靶序列進行配對，稱為退火。然后，退火引物可在DNA聚合酶作用下進行延伸。上述過程是由溫度控制的。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)。實驗原理PCR是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。PCR按照底物（即模板DNA）的來源和引物的特點可分為經(jīng)典PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和免疫PCR（IM-PCR）。其中，RT-PCR較常用。在這個反應(yīng)體系中，被檢物為RNA，如mRNA，需借助逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄作用，轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的互補鏈DNA（cDNA）才能進行PCR。為此，逆轉(zhuǎn)錄和PCR分兩步進行，先作逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以此為模板作PCR。RT-PCR的準(zhǔn)備--試劑提取細胞或組織中RNA購買RT-PCR試劑盒（一步法或兩步法）RT-PCR的準(zhǔn)備--耗材、儀器超凈臺PCR儀移液器吸頭200ulPCR管EP管架槍頭盒PCR板冰盒RT-PCR過程中cDNA第一鏈合成反應(yīng)所用的槍頭、槍頭盒、PCR管等塑料制品均提前用氯仿進行處理，高壓滅菌后使用。玻璃制品在180℃干烤6-8小時。加樣過程在超凈臺內(nèi)進行，需戴手套與口罩。cDNAPCR擴增的準(zhǔn)備工作同普通PCR反應(yīng)。

RT-PCR反應(yīng)程序(1)42℃30min，(2)94℃3min，(3)94℃變性3min，(4)94℃變性30sec，

(5)52℃退火30sec，

(6)72℃延伸1min。(7)goto(4)repeat29,（8）72℃延伸10min。（9）holdat4℃。RT-PCR操作過程cDNA第一鏈合成反應(yīng)所用槍頭、槍頭盒、PCR管等塑料制品均提前用氯仿進行處理，高壓滅菌后使用。玻璃制品在180℃干烤6-8小時。在超凈臺內(nèi)按試劑盒說明書進行加樣，加樣過程需戴手套與口罩。

cDNAPCR擴增的準(zhǔn)備工作同普通PCR反應(yīng)。在PCR儀上設(shè)定程序進行反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳的原理瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定核酸片段的有效方法，瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶有一定孔隙的固體基質(zhì)的特性，利用電荷效應(yīng)，在電場的作用下及中性pH的緩沖條件下，帶負(fù)電的核酸分子向正極遷移。利用分子篩效應(yīng)可以分離不同片斷大小和不同構(gòu)象的DNA、RNA分子。瓊脂糖凝膠電泳的主要用途分離不同片斷大小和不同構(gòu)象的DNA、RNA分子。鑒定DNA片段，如PCR產(chǎn)物的鑒定。純化DNA分子。瓊脂糖凝膠電泳的準(zhǔn)備--試劑瓊脂糖電泳緩沖液：Tris，冰乙酸，EDTA（TAE）6X載樣緩沖液（Loadbuffer）：溴酚藍，蔗糖染色液：goldviewDNA或RNA樣品DNA分子量marker瓊脂糖凝膠電泳的準(zhǔn)備--儀器、耗材電泳儀電泳槽微波爐三角瓶移液器電子天平槍頭凝膠成像系統(tǒng)瓊脂糖凝膠電泳的操作過程1g瓊脂糖加入100ml1×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到60℃，加入5μl的goldview，并搖勻。）裝好制膠板，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固。充分凝固后，小心垂直向上拔出梳子，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm。瓊脂糖凝膠電泳的操作過程用移液器吸取PCR產(chǎn)物10μl于封口膜上，再加入2μl的6X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔。打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至50-100V，可見