化學生物學第六章 化學物質與蛋白質相互作用

第六章化學物質與蛋白質的相互作用

Chapter6.Interactionsbetweenchemicalsandproteins

第八次課在生物體內，蛋白質（包括酶）占細胞干重的70%以上，種類繁多，在生命活動過程中發(fā)揮著各種各樣的作用。隨著人們對環(huán)境保護和生活質量要求的提高，蛋白質在食品、醫(yī)藥（生化藥物、臨床檢驗、藥物篩選等）、環(huán)保（環(huán)境分析）、農業(yè)、日用化工（化妝品）、精細化工（酶催化合成）等領域的應用日益廣泛。在蛋白質體外的應用中，一般涉及到分離純化、儲存、含量檢測等過程，其中常常發(fā)生化學物質與蛋白質非專一性的相互作用，如沉淀作用、變性作用、穩(wěn)定作用以及化學修飾作用等。

第一節(jié)概述球狀蛋白三級結構的主要特征絕大多數(shù)蛋白質折疊成為近乎球狀的結構。球狀蛋白質一旦具有三級結構后，蛋白質內部變得更為緊密，內部的空間約有75％被原子所充滿。這樣的密集程度遠遠超過在液體中的小分子，可以與某些晶體相比。蛋白質可認為是帶有極性外套的油滴，也就是“非極性在內，極性在外”。大量蛋白質的X射線晶體衍射分析統(tǒng)計結果充分證明了這一規(guī)律。存在于蛋白質內部的主要是一些非極性殘基側鏈，約有63％是丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸等；帶電的殘基，如天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸和精氨酸只有4％。約95％的帶電側鏈分布在蛋白質表面；約14％的亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸在蛋白質分子表面。蛋白質內部存在極少量的親水殘基，表面也常見到一些疏水殘基。這些“異?！狈植嫉臍埢?，致使肽鏈的局部結構發(fā)生“扭曲”，一些鍵的張角與一般正常的值有偏離，蛋白質中這些局部的構象具有相對偏高的能量，相對處于較不穩(wěn)定狀態(tài)，在外界很小的擾動作用下，就能發(fā)生變化。原則上，一些相對規(guī)則的-螺旋和-折疊分布在球狀蛋白內部，且壓積得很緊密，致使球狀蛋白具有致密的結構；那些-螺旋和-折疊疊規(guī)整性相對差一些的二級結構，轉角和環(huán)狀以及特定的“無規(guī)”卷曲，則更多地分布在球狀蛋白外周。值得指出的是在很多蛋白質分子內部還存在著數(shù)量不同的水分子，這些水分子也和一些極性基因或負電性原子形成氫鍵。其中一些也參與蛋白質功能的行使過程。球狀蛋白表面并不是非常光滑的，而是具有很多溝渠，多數(shù)球狀蛋白可及表面的面積約為同樣大小球表面積的兩倍。

球狀蛋白質分子的立體結構具有高度特異性和高度靈敏性。每種蛋白質分子都有特定的高級結構。這種構象特異性，使它區(qū)別于其他蛋白質；但這種高度特異性結構，并非固定不變，在執(zhí)行生物學功能時，常常發(fā)生一系列的構象變化，表現(xiàn)出高度靈敏性。在生物體內，構象變化，往往是該蛋白質分子與配基相互作用引起的，配基包括酶的小分子底物、受體的小分子激素和神經介質、血紅蛋白O2等。因此，生物體內的蛋白質總是處于一種可以相互轉變的多種構象平衡態(tài)。球狀蛋白質分子表面并不光滑，常出現(xiàn)一些“裂隙”或“洞穴”，“裂隙”或“洞穴’’周圍常具有疏水性，這些“裂隙”或“洞穴”可能是蛋白質(酶)的活性部位。硫氧還蛋白的結構緊密結合水親水性殘基疏水性殘基第二節(jié)

化學物質對蛋白質的沉淀作用

由于蛋白質分子量很大，在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質溶液具有膠體溶液的典型性質，如丁達爾現(xiàn)象、布郎運動等。由于膠體溶液中的蛋白質不能通過半透膜，因此可以應用透析法將非蛋白的小分子雜質除去。根據(jù)蛋白質的親水膠體性質，當其環(huán)境發(fā)生改變時，蛋白質會發(fā)生沉淀作用。蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關。改變溶液的條件，將影響蛋白質的溶解性質。在適當?shù)臈l件下，蛋白質能夠從溶液中沉淀出來。

沉淀作用的類型可逆沉淀不可逆沉淀抗體-抗原沉淀在溫和條件下，通過改變溶液的pH或電荷狀況，使蛋白質從膠體溶液中沉淀分離。蛋白質在沉淀過程中結構和性質都沒有發(fā)生變化，在適當?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，又稱為非變性沉淀。在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質的結構和性質，產生的蛋白質沉淀不可能再重新溶解于水由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質的結構和性質的變化，又稱為變性沉淀。抗體和抗原蛋白通過相互識別和結合而發(fā)生的沉淀現(xiàn)象。這種特殊的沉淀作用是生物體免疫功能的基礎。一、無機物沉淀當向蛋白質溶液中逐漸加入無機鹽時，開始蛋白質的溶解度增大，是由于蛋白質的活度系數(shù)降低的緣故，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。但當繼續(xù)加入電解質時，另一種因素起作用，使蛋白質的溶解度減小，稱為鹽析。這是由于電解質的離子在水中發(fā)生水化，當電解質的濃度增加時，水分子就離開蛋白質的周圍，暴露出疏水區(qū)域，疏水區(qū)域間的相互作用，使蛋白質聚集而沉淀，疏水區(qū)域越多，就越易產生沉淀。（1）鹽析牢固結合水大量溶劑水層含高價陰離子的鹽，效果比1價的鹽好。陰離子的鹽析效果有下列次序：檸檬酸鹽>PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-。但高價陽離子的效果不如低價陽離子，例如硫酸鎂的效果不如硫酸銨。對于1價陽離子則有下列次序：NH4+＞K+＞Na+。

因此，最常用的鹽析劑是硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀或磷酸鈉。但硫酸鈉在40C以下溶解度較低，因而僅適用于對熱穩(wěn)定的蛋白質。磷酸鹽在中性范圍內實際上是HPO42-和H2PO4-的混合物，其作用比PO43-差。硫酸銨由于價廉、溶解度大，且能使蛋白質穩(wěn)定,在2-3mol/L(NH4)2SO4中酶可保存幾年。同時由于鹽的濃度高，可防止蛋白酶和細菌作用，故是最常用的鹽析劑。硫酸銨的缺點是水解后變酸，在高pH下會釋放出氨，腐蝕性強；殘留的硫酸銨在食品中雖然量少，也會影響其味，在醫(yī)療上有毒，因此必須除去。（2）金屬離子沉淀法一些高價金屬離子對沉淀蛋白質很有效。它們可以分為三類：第一類為Mn2+，F(xiàn)e2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+和Cd2+能和蛋白質分子表面的羧基，氨基、咪唑基、胍基等側鏈結合。第二類為Ca2+，Ba2+，Mg2+和Pb2+能和蛋白質分子表面的羧基結合，但不和含氮化合物相結合。第三類為Ag+，Hg2+和Pb2+能和蛋白質分子表面的巰基相結合。金屬離子沉淀法的優(yōu)點是它們在稀溶液中對蛋白質有效強的沉淀能力。處理后殘余的金屬離子可用離子交換樹脂或螯合劑除去。在這些離子中，應用較廣的是Zn2+，Ca2+，Mg2+，Ba2+和Mn2+，而Cu2+，F(xiàn)e2+，Pb2+，Hg2+等較少應用，因為它們會使產品損失和引起污染。如Zn2+可用于沉淀桿菌肽(作用于第4個組氨酸殘基上)和胰島素；Ca2+(CaCO3)用于分離乳酸，血清清蛋白等。二、等電點沉淀蛋白質與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點。在等電點時，蛋白質的溶解度最小，在電場中不移動。等電點沉淀法的一個主要優(yōu)點是很多蛋白質的等電點都在偏酸性范圍內，而無機酸通常價較廉，并且某些酸，如磷酸、鹽酸和硫酸的應用能為蛋白質類食品所允許。同時，?？芍苯舆M行其他純化操作，無需將殘余的酸除去。等電點沉淀法的最主要缺點是酸化時，易使蛋白質失活，這是由于蛋白質對低pH比較敏感。pH對-乳球蛋白溶解度的影響

三、有機物沉淀利用和水互溶的有機溶劑使蛋白質沉淀的方法很早就用來純化蛋白質。加入有機溶劑于蛋白質溶液中產生多種效應，這些效應結合起來使蛋白質沉淀。其中主要效應是水活度的降低。當有機溶劑濃度增大時，水對蛋白質分子表面上荷電基團或親水基團的水化程度降低，或者說溶劑的介電常數(shù)降低，因而靜電吸力增大。在疏水區(qū)域附近近有序排列的水分子可以為有機溶劑所取代，使這些區(qū)域的溶解性增大。但除了疏水性特別強的蛋白質外，對多數(shù)蛋白質來說，后者影響較小，所以總的效果是導致蛋白質分子聚集而沉淀。

1.有機溶劑有機溶劑沉淀法的優(yōu)點是溶劑容易蒸發(fā)除去，不會殘留在成品中，因此適用于制備食品蛋白質。而且有機溶劑密度低，與沉淀物密度差大，便于離心分離。有機溶劑沉淀法的缺點是容易使蛋白質變性失活，且有機溶劑易燃、易爆、安全要求較高。一般所選擇的溶劑必須能和水互溶，而和蛋白質不發(fā)生化學反應，最常用的溶劑是乙醇和丙酮，加量在20-50%（V/V）之間。當?shù)鞍踪|的溶液pH接近等電點時，引起沉淀所需加入有機溶劑的量較少。

2.酚類化合物及有機酸沉淀當?shù)鞍踪|溶液pH小于其等電點時，蛋白質顆粒帶有正電荷，容易與酚類化合物或有機酸酸根所帶的負電荷發(fā)生作用生成不溶性鹽而沉淀。這類化合物包括鞣酸（又稱單寧）、苦味酸（即2,4,6-三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水楊酸等。單寧是一種多酚類化合物的寡聚體，它們的酚羥基可以解離而帶有負電荷，而且分子中的苯環(huán)、多個羥基可以與蛋白質發(fā)生非共價相互作用，結合在蛋白質的表面，然后在蛋白質分子之間形成多點交連而成網(wǎng)絡結構，最終導致聚集而沉淀

四、聚合物沉淀許多非離子型聚合物，包括聚乙二醇（PEG）可用來進行選擇性沉淀以純化蛋白質。聚合物的作用認為與有機溶劑相似，能降低水化度，使蛋白質沉淀。此現(xiàn)象和雙水相的形成有聯(lián)系。若使低分子量的蛋白質沉淀，需加入大量PEG；而使高分子量的蛋白質沉淀，加入的量較小。PEG是一種特別有用的沉淀劑，因為無毒，不可燃性且對大多數(shù)蛋白質有保護作用而被廣泛使用。一般PEG的分子量需大于4000，最常用的是6000和20000。所用的PEG濃度通常為20%，濃度再高，會使粘度增大，造成沉淀的回收比較困難。PEG對后繼分離步驟影響較少，因此可以不必除去。1.非離子型聚合物沉淀法2.聚電解質沉淀法

有一些離子型多糖化合物可應用于沉淀食品蛋白質。如羧甲基纖維素，海藻酸鹽，果膠酸鹽和卡拉膠等。它們的作用主要是靜電引力。如羧甲基纖維素能在pH值低于等電點時使蛋白質沉淀。但加入量不能太多，否則會引起膠溶作用而重新溶解。一些陰離子聚合物，如聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸，以及一些陽離子聚合物如聚乙烯亞胺和以聚苯乙烯為骨架的季胺鹽也曾用來沉淀乳清蛋白質。聚丙烯酸能在pH8.8時沉淀90%以上的蛋白質，聚苯乙烯季胺鹽能在pH10.4時沉淀95%的蛋白質。聚乙烯亞胺能與蛋白質的酸性區(qū)域形成復合物，在中性時帶正電，可在污水處理中作絮凝劑，也廣泛用于酶的純化中。第三節(jié)化學物質對蛋白質的穩(wěn)定作用

許多蛋白質在一般緩沖溶液中的穩(wěn)定性相當?shù)停承┟傅鞍兹芤涸?7C放置的半衰期僅幾個小時。這種穩(wěn)定性降低的原因常常是某些物理或化學因素破壞了維持蛋白質結構的天然狀態(tài)，引起蛋白質理化性質改變并導致其生理活性喪失，這種現(xiàn)象稱為蛋白質的變性。

一、蛋白質不可逆失活的化學因素1.強酸和強堿強的無機酸堿及有機酸堿都可以改變蛋白質溶液的pH，引起蛋白質表面必需基團的電離，由于各氨基酸殘基所帶電荷的相互吸引或排斥使蛋白質的空間結構發(fā)生較大變化，造成蛋白質分子聚集，導致不可逆失活。另外，在強酸、強堿條件下，肽鍵也容易被水解斷裂，天冬酰胺和谷酰胺側鏈的酰胺會發(fā)生脫氨作用，改變了原來蛋白質表面的電荷分布，使蛋白質構象重新排布，結果導致蛋白質失去活性。2.氧化劑各種氧化劑能夠氧化芳香族側鏈的氨基酸以及甲硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸殘基。其中酪氨酸側鏈的酚羥基可以被氧化成醌，后者可以與蛋白質表面的巰基、氨基發(fā)生邁克爾加成反應形成交聯(lián)產物。在堿性條件下，半胱氨酸可以被Cu2+氧化成次磺酸或亞磺酸或磺酸半胱氨酸。分子氧、H2O2以及過氧化物（如過氧甲酸）、氧自由基等是最常見的氧化劑，在生物體內，蛋白質的氧化失活主要是通過活性氧（羥基自由基、超氧離子、過氧化氫、過氧化物）來完成的。這些氧化劑的殺菌作用主要也是造成蛋白質失活。3.去污劑和表面活性劑去污劑一般分為離子型和非離子型兩大類，都具有長鏈疏水尾和親水的極性頭。當少量的陰離子去污劑（如十二烷基磺酸鈉，SDS）單體加入到蛋白質溶液中時，去污劑與蛋白質表面的疏水區(qū)域結合，隨著加入量增加，與蛋白質的結合位點達到飽和，這時去污劑則以協(xié)同方式結合于蛋白質其它位點，導致蛋白質伸展，分子內部的疏水性氨基酸殘基暴露，并進一步與去污劑結合，直到達到飽和為止，從而使蛋白質發(fā)生不可逆變性。4.變性劑高濃度脲（8-10mol/L）和鹽酸胍（6mol/L）常常用于蛋白質變性和復性研究，由于脲或鹽酸胍與蛋白質多肽鏈作用，破壞了蛋白質分子內維持其二級結構和高級結構的氫鍵，引起蛋白質不可逆失活。

（1）脲和鹽酸胍（2）有機溶劑水互溶有機溶劑可以使酶、蛋白質失去活性，是因為有機溶劑取代了蛋白質表面的結合水，并通過疏水作用與蛋白質結合，改變了溶液的介電常數(shù)，從而影響維持蛋白質天然構象的非共價力的平衡。（3）螯合劑結合金屬離子的試劑，如EDTA等可以使金屬酶、金屬蛋白失活，這是因為EDTA與金屬離子形成配位復合物，從而使酶失去金屬輔助因子造成的。失去金屬輔助因子的酶或蛋白質可以引起蛋白質構象發(fā)生較大改變，導致蛋白質活力不可逆的喪失。但是，螯合劑可以螯合對蛋白質有害的金屬離子，使那些不需要金屬離子的蛋白質穩(wěn)定。

5.重金屬離子和巰基試劑在金屬離子對蛋白質的沉淀作用中，一些重金屬離子，如Hg2+、Cd2+、Pb2+能與蛋白質分子中的半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基以及色氨酸的吲哚基反應，使蛋白質不可逆沉淀而變性失活。巰基試劑，如巰基乙醇等通過還原蛋白質分子內的二硫鍵而使蛋白質失去活性，但這個過程一般是可逆的。而低分子量的含二硫鍵的試劑可與蛋白質中的巰基作用，形成混合二硫鍵，造成蛋白質結構發(fā)生變化，導致其失活。

LysArg水蛋白質不可逆失活的化學因素

強酸和強堿

強的酸堿可以改變蛋白質溶液的pH引起蛋白質表面必需基團的電離，使蛋白質的空間結構發(fā)生變化，造成蛋白質分子聚集，導致變性。

氧化劑

氧化劑甲硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸殘基。酪氨酸側鏈的酚羥基可以被氧化成醌再與巰基、氨基發(fā)生邁克爾加成反應形成交聯(lián)產物。

表面活性劑變性劑

重金屬離子去污劑與蛋白質表面的疏水區(qū)域結合，導致蛋白質伸展，分子內部的疏水性氨基酸殘基暴露從而使蛋白質發(fā)生不可逆變性。

脲或鹽酸胍與蛋白質多肽鏈作用，破壞了蛋白質分子內維持其二級結構和高級結構的氫鍵。有機溶劑也會引起蛋白質變性失活Hg2+、Cd2+、Pb2+能與蛋白質分子中的半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基以及色氨酸的吲哚基反應，使蛋白質不可逆沉淀而變性失活。

二、化學物質對蛋白質的穩(wěn)定作用

蛋白質的穩(wěn)定性是指蛋白質抵抗各種因素的影響，保持其生物活性的能力。根據(jù)生物體內蛋白質等存在的狀態(tài)，可以利用化學物質或化學方法使蛋白質穩(wěn)定化，以有利于蛋白質在體外的應用。通過研究蛋白質的變性及穩(wěn)定性，可以了解蛋白質的結構功能與穩(wěn)定性的關系等。在蛋白質（酶）分離、純化、儲藏和應用中，可以通過化學方法使蛋白質穩(wěn)定。常用的方法有：固定化：將酶或蛋白質多點連接于載體上（無機載體、高分子載體）；添加劑：保護蛋白質（酶）不受氧化劑氧化、不受變性劑變性等；化學修飾：共價交聯(lián)，使蛋白質構象固化。

穩(wěn)定劑共溶劑

糖類，醇氨基酸及其衍生物無機鹽，甘油，聚乙二醇等常用1-4M濃度共溶劑來穩(wěn)定蛋白質和細胞器?？寡趸瘎?/p>

底物、輔酶金屬離子

化學交聯(lián)劑半胱氨酸，2-巰基乙醇還原谷胱甘肽，二巰基赤蘚醇等巰基試劑可防止巰基氧化植物抗氧化劑如兒茶酚黃酮等也具有保護作用酶可被底物輔酶、競爭性抑制劑及反應產物等所穩(wěn)定。金屬離子不僅可以影響酶的活性，還可以影響酶的穩(wěn)定性如Ca2+多位點結合使得蛋白質分子成為緊密的活性形式。交聯(lián)劑可在相隔較近的兩個氨基酸殘基之間，或蛋白質與其他分子之間（如固定化載體）發(fā)生交聯(lián)反應使蛋白質的構象穩(wěn)定。三、化學物質的共價修飾作用

化學物質與生物大分子的共價作用常常涉及到物質的生理活性（包括藥理、毒理等），如何判斷化合物與蛋白質分子中的哪類基團作用，在體外主要用化合修飾的方法。該方法是研究蛋白質結構與功能的一種重要的基礎手段。1.生物體內蛋白質加合物的形成

許多化學毒物對細胞產生的損害與其親電代謝產物同細胞大分子的親核部位(如蛋白質的巰基)發(fā)生不可逆結合具有密切關系。當外源化合物的活性代謝產物與細胞內重要生物大分子，如核酸、蛋白質、脂質等共價結合，發(fā)生烷基化或芳基化，即導致DNA損傷、蛋白質正常功能喪失，乃至細胞的損傷或死亡、外源化合物與生物大分子相互作用主要有兩種方式：非共價結合和共價結合。

(1)可與蛋白質發(fā)生反應的化合物

除少數(shù)烷化劑外，絕大多數(shù)外源化合物需經體內代謝活化，轉變成親電子的活性代謝物，再與細胞內生物大分子中的親核部位和基團發(fā)生共價結合，例如蛋白質分子中的親核基團、DNA、RNA及一些小分子物質如谷胱甘肽等的親核部位等。

(2)蛋白質分子中的可反應基團

致癌物分子量的大小不同，反應是不同的，分子量較小的，如乙烯、丙烷和苯乙烯的氧化物、尿烷和氯乙烯的環(huán)氧化物、丙烯酰胺等，與蛋白質作用時，所形成的加合物依賴于外源化合物與各種氨基酸反應的相對速率。

試劑類型化合物或前體反應機制烷基化芳香基化鹵代物親核取代環(huán)氧化物硫酸烷基酯活潑的烯烴1,4-加成羰基化合物醛形成希夫堿?；袡C酸酐、酰氯等親核取代或加成磷酰化有機磷親核取代自由基·OH、·CCl3自由基反應具有親電氮化合物芳香胺親核取代2.氨基酸殘基側鏈基團的修飾

蛋白質側鏈基團的修飾是通過選擇性的試劑或親和標記試劑與蛋白質分子側鏈上特定的功能基團發(fā)生化合反應而實現(xiàn)的。其中的一個重要作用是用來探測活性部位的結構。理想情況下，修飾試劑只是有選則地與某一特定的殘基反應，很少或幾乎不引起蛋白質分子的構象變化。在此基礎上，從該基團的修飾對蛋白質分子的生物活性所造成的影響，就可以推測出被修飾的殘基在該蛋白質分子中的功能。

3.巰基的化學修飾

5,5'-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB)，又稱為Ellman試劑，目前已成為最常用的巰基修飾試劑。DTNB可與巰基反應形成二硫鍵，產生的5-巰基-2-硝基苯甲酸陰離子在412nm具有很強的吸收，可以通過光吸收變化監(jiān)測反應程度。有機汞試劑是最早使用的巰基修飾試劑之一，其中最常用的是對氯汞苯甲酸，該化合物溶于水形成羥基衍生物，與巰基相互作用時255nm處光吸收具有較大的增強效應。

4.氨基的化學修飾

有許多化合物都可用來修飾賴氨酸殘基，三硝基苯磺酸(TNBS)就是其中非常有效的一種。TNBS與賴氨酸殘基反應，在420nm和367nm能夠產生特定的光吸收。在蛋白質序列分析中，用于多肽鏈N-末端殘基的測定的化合修飾方法—2,4-二硝基氟苯(DNFD)法、丹磺酰氯(DNS)法和)苯異硫氰酸酯(PITC)法都是常用的氨基修飾方法。

5.羧基的化學修飾

水溶性的碳化二亞胺類特定修飾蛋白質分子的羧基基團，目前已成為一種應用最普遍的標準方法，它在比較溫和的條件下就可以進行。

6.咪唑基的化合修飾

焦碳酸二乙酯(DPC)是最常用的修飾組氨酸殘基的試劑。該試劑在接近中性的情況下表現(xiàn)出比較好的專一性，與組氨酸殘基反應使咪唑基上的1個氮羧乙基化，并且使得在240nm處的光吸收增加。該取代反應在堿性條件下是可逆的，可以重新生成組氨酸殘基。

四、蛋白質光譜探針

蛋白質的定量測定是生物化學和其他生物學科中經常涉及的分析內容，也是臨床診斷和檢驗疾病治療效果的重要指標，還是藥物和食品分析的常見項目。所謂蛋白質光譜探針，就是能與蛋白質發(fā)生相互作用的無機離子、有機小分子或絡合物，這些物質與蛋白質結合生成超分子復合物之后，體系的光譜性質發(fā)生變化，從而可以提供蛋白質濃度或結構方面的信息。蛋白質的定量分析方法很多，但研究最多、應用最廣的還是吸光光度法、熒光分析法和共振光散射等分子光譜探針。

蛋白質吸光探針金屬探針雙縮脲在堿性溶液中與Cu2+生成紫紅色化合物的反應。肽和蛋白質化合物都有雙縮脲反應，生成紫紅色化合物，在540nm具有光吸收。

雙縮脲法Folin-Lowry法

將雙縮脲試劑和Folin酚試劑(磷鉬酸鹽磷鎢酸鹽）結合使用，在蛋白質發(fā)生雙縮脲反應之后，再和Folin酚試劑反應，此試劑在堿性條件下被蛋白質中酪氨酸的酚基還原，生成顏色