2023年自考生物技術(shù)制藥復(fù)習(xí)整理

現(xiàn)代生物技術(shù)涉及?現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)?新型生物反映器?生物技術(shù)藥物分類(lèi)生物技術(shù)藥物的特點(diǎn)生物技術(shù)在制藥中的應(yīng)用基因的概念與特性DNA的復(fù)制與表達(dá)基因工程制藥醫(yī)用活性蛋白和多肽類(lèi)基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)基因工程藥物生產(chǎn)的過(guò)程目的基因的獲得、克隆真核基因常用方法人工化學(xué)合成基因的限制基因篩選的新方法、對(duì)已發(fā)現(xiàn)基因的改造最佳的基因表達(dá)體系適合目的基因表達(dá)的宿主細(xì)胞應(yīng)滿(mǎn)足哪些規(guī)定大腸桿菌中的基因表達(dá)原核細(xì)胞的基因組特點(diǎn)基因克隆載體的定義、特點(diǎn)質(zhì)粒的分類(lèi)真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)載體必須具有條件影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)（菌體的生長(zhǎng)與能量、前體供應(yīng)的關(guān)系）基因工程菌的不穩(wěn)定性（質(zhì)粒、分裂、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定)、其重要機(jī)制常見(jiàn)分裂不穩(wěn)定的兩個(gè)因素、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法基因工程菌的培養(yǎng)方式影響發(fā)酵的因素有高密度發(fā)酵特點(diǎn)、影響因素實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法基因工程藥物的分離純化分離純化的方法、基本原理分離純化工藝應(yīng)遵循的原則基因工程藥物的質(zhì)量控制、保存動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)、生理特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源的藥物的種類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法、特點(diǎn)、培養(yǎng)方式動(dòng)物細(xì)胞生物反映器的類(lèi)型、抱負(fù)反映器的基本規(guī)定動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品純化方法、動(dòng)物細(xì)胞制藥的前景單克隆抗體及其制備基因工程抗體及其制備噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的基本方法、特點(diǎn)基因工程抗體表達(dá)抗體診斷試劑的類(lèi)型抗體治療藥物的種類(lèi)植物組織和器官的培養(yǎng)次級(jí)代謝產(chǎn)物特點(diǎn)、作用植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基的組成、固定化反映器影響植物次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)和累積的因素植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生物反映器的類(lèi)型、性能比較植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)優(yōu)缺陷植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)程序植物生物反映器選擇標(biāo)準(zhǔn)植物細(xì)胞制藥的進(jìn)展與展望酶的特點(diǎn)、來(lái)源酶工程的研究?jī)?nèi)容運(yùn)用微生物生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點(diǎn)固定化酶的特點(diǎn)酶和細(xì)胞固定化方法與制備技術(shù)固定化細(xì)胞的特點(diǎn)固定化細(xì)胞反映器的類(lèi)型和特點(diǎn)模擬酶的的概念及分類(lèi)酶的化學(xué)修飾的目的和意義酶化學(xué)修飾的方法修飾酶的特性酶化學(xué)修飾的應(yīng)用及其局限性酶的化學(xué)修飾的前景有機(jī)相酶反映的優(yōu)點(diǎn)、有機(jī)溶劑、影響酶工程優(yōu)點(diǎn)發(fā)酵工程的研究?jī)?nèi)容優(yōu)良菌種的選育誘變育種的方法和原理營(yíng)養(yǎng)缺陷型的作用發(fā)酵類(lèi)型、特點(diǎn)發(fā)酵工藝控制細(xì)胞破碎的方法及其優(yōu)缺陷抱負(fù)的微生物細(xì)胞生物反映器基本規(guī)定基因工程在發(fā)酵工程中的應(yīng)用基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的兩種重要表現(xiàn)形式是什么?重要機(jī)制是什么?在人胰島素AB鏈分別表達(dá)法中,為什么將AB鏈編碼序列與ｂ-半乳糖苷酶基因融合？闡述基因工程藥物研制有那些重要過(guò)程?對(duì)鼠源性單克隆抗體進(jìn)行改造的目的是什么?鼠源性單克隆抗體改造后的小分子抗體類(lèi)型？抗體治療藥物有哪些?１.現(xiàn)代生物技術(shù)涉及:⑴重組DＮA技術(shù)⑵細(xì)胞和原生質(zhì)體融合技術(shù)⑶酶和細(xì)胞的固定化技術(shù)⑷植物脫毒和快速繁殖技術(shù)⑸動(dòng)物和植物細(xì)胞的大量培養(yǎng)技術(shù)⑹動(dòng)物胚胎工程技術(shù)⑺現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)⑻現(xiàn)代生物反映工程和分離工程技術(shù)⑼蛋白質(zhì)工程技術(shù)⑽海洋生物技術(shù)２.現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)重要體現(xiàn)在下列幾個(gè)方面:①基因操作技術(shù)日新月異,不斷完善。②新技術(shù)、新方法一經(jīng)產(chǎn)生便迅速地通過(guò)商業(yè)渠道出售專(zhuān)項(xiàng)技術(shù),并在市場(chǎng)上加以應(yīng)用。③基因工程藥物和疫苗的研究和開(kāi)發(fā)突發(fā)猛進(jìn)。④新的生物治療制劑的產(chǎn)業(yè)化前景十分光明，2１世紀(jì)整個(gè)醫(yī)藥工業(yè)將面臨全面的更新改造。⑤轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物取得重大突破⑥現(xiàn)代生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的廣泛應(yīng)用將給農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)新的奔騰。⑦闡明生物體基因組及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能是當(dāng)今生命科學(xué)發(fā)展的一個(gè)主流方向，⑧基因治療取得重大進(jìn)展,有也許革新整個(gè)疾病的防止和治療領(lǐng)域。⑨蛋白質(zhì)工程是基因工程的發(fā)展，它將分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，形成一門(mén)高度綜合的學(xué)科。⑩信息技術(shù)的奔騰發(fā)展?jié)B透到生命科學(xué)領(lǐng)域中,形成形成引人注目、用途廣泛的生物信息學(xué)。3新型生物反映器有:1．氣升式生物反映器2.流化床式生物反映器3.固定床式生物反映器４．袋式或膜式生物反映器5.中空纖維生物反映器4.生物技術(shù)藥物分類(lèi)1.重組DNA技術(shù)制造的多肽、蛋白類(lèi)藥物2.基因藥物，涉及基因治療藥、基因疫苗、反義藥物、核酶３.來(lái)自動(dòng)、植物、微生物的天然藥物4.合成與半合成的生物藥物按照醫(yī)學(xué)用途分類(lèi)：１.治療藥物，治療疾病是生物藥物的重要功能。2.診斷藥物，具有速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。3．防止藥物，對(duì)于許多傳染性疾病來(lái)說(shuō),防止比治療更重要。5.生物技術(shù)藥物的特性1．分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜2.具有種屬特異性3．治療針對(duì)性強(qiáng)，療效高４.穩(wěn)定性差5.基因穩(wěn)定性6．免疫原性7.體內(nèi)t1/2短８．受體效應(yīng)9.多效性和網(wǎng)絡(luò)性效應(yīng)10.檢查的特殊性６．生物技術(shù)在制藥中的應(yīng)用(1)基因工程藥物品種的開(kāi)發(fā)；(2）基因工程疫苗；（３)基因工程抗體；（4)基因診斷與基因治療;(5)應(yīng)用基因工程技術(shù)建立新藥的篩選模型；(6)應(yīng)用基因工程技術(shù)改良菌種，產(chǎn)生新的微生物藥物;（7)基因工程技術(shù)在改善藥物生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用;(8）運(yùn)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)類(lèi)藥物。7.基因的概念與特性概念:DNＡ分子中具有特定遺傳信息的一段核苷酸序列,是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。特性:①基因可自我復(fù)制,②基因決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),③基因可突變?；虬垂δ芊譃?①結(jié)構(gòu)基因②調(diào)控基因DNＡ的結(jié)構(gòu)與性能⒈DNA的結(jié)構(gòu)：四種核苷酸(ATCG）連接一級(jí)結(jié)構(gòu)、ＤNＡ二級(jí)結(jié)構(gòu)（α，β）,雙螺旋結(jié)構(gòu)。⒉DNA的性質(zhì)與功能:①吸取光譜２6０②電場(chǎng)中泳動(dòng)③變性、復(fù)性、雜交８．DＮA的復(fù)制與表達(dá)基因表達(dá)⒈轉(zhuǎn)錄:在ＲＮA聚合酶的催化下以ＤNA為模板合成mRNA的過(guò)程。2.翻譯:以mRNA為模板,tRNＡ作為運(yùn)載工具,將活化的氨基酸在核糖體上合成蛋白質(zhì)的過(guò)程。（１)分為三個(gè)階段：①起始②延長(zhǎng)③終止（2)翻譯后的肽鏈加工:①羥基化②糖基化③磷酸化④乙?；?.基因工程制藥醫(yī)用活性蛋白和多肽類(lèi)涉及：①免役性蛋白,如各種抗原和單克隆抗體。②細(xì)胞因子，如各種干擾素、白細(xì)胞介素、集落刺激生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子及凝血因子。③激素,如胰島素、生長(zhǎng)激素、心鈉素。④酶類(lèi),如尿激酶、鏈激酶、葡激酶、組織型纖維蛋白溶酶原激活劑及超氧化物岐化酶等。１０.基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)1.運(yùn)用基因工程技術(shù)可大量生產(chǎn)過(guò)去難以獲得的生理活性蛋白和多肽（如胰島素、干擾素、細(xì)胞因子等)，為臨床使用建立有效的保障。2.可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì),以便對(duì)其生理、生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的研究,從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍。３．運(yùn)用基因工程可以發(fā)現(xiàn)挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)。4．內(nèi)源生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時(shí)，存在局限性之處，可以通過(guò)基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造。5．運(yùn)用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物,擴(kuò)大藥物篩選來(lái)源。11.基因工程藥物生產(chǎn)的過(guò)程（環(huán)節(jié))⒈目的基因的克?、矘?gòu)建DAN重組體⒊DＡN重組體轉(zhuǎn)入宿主菌⒋構(gòu)建工程菌⒌工程菌發(fā)酵⒍表達(dá)產(chǎn)物的分離純化⒎產(chǎn)品的檢查等基因工程藥物制藥的重要程序獲得目的基因→組建重組質(zhì)?！鷺?gòu)建工程菌(或細(xì)胞）→培養(yǎng)工程菌→產(chǎn)物分離純化→除菌過(guò)濾→半成品檢定→成品檢定→包裝12.目的基因的獲得克隆真核基因常用方法:逆轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。①逆轉(zhuǎn)錄法:逆轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行ｃDNＡ的克隆表達(dá)。⒈mＲNA的純化⒉ｃDNA第一鏈的合成⒊cDＮＡ第二鏈的合成⒋cDNA的克?、祵⒅亟M體導(dǎo)入宿主細(xì)胞：⒍cＤNA文庫(kù)的鑒定：抗性基因失活法、噬菌斑顏色改變法⒎目的cDNA克隆的分離和鑒定：核酸探針雜交法、免疫反映鑒定法②化學(xué)合成法：較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以用化學(xué)合成法合成。必須知道目的基因的核苷酸順序或目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序。再按相應(yīng)的密碼子推導(dǎo)出DＮＡ的核甘酸序列。用化學(xué)法合成目的基因ＤＮA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的ＤＮA雙鏈片段,然后將這些雙鏈片段按對(duì)的的順序進(jìn)行退火使連接成較長(zhǎng)的ＤNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。１３.人工化學(xué)合成基因的限制有:⒈不能合成太長(zhǎng)的基因目前DNＡ合成儀所合成的寡核苷酸片段僅為5０～60bp,因此只合用于克隆小分子肽的基因。⒉遺傳密碼的簡(jiǎn)并使選擇密碼子困難,用氨基酸順序推測(cè)核苷酸序列,得到的結(jié)果也許與天然基因不完全一致,易導(dǎo)致中性突變。⒊費(fèi)用高。14．基因篩選的新方法1.編碼序列富集法2.島嶼獲救PCR法3.動(dòng)物雜交法4．功能克隆法5.構(gòu)建cDNA文庫(kù)６.差異顯示技術(shù)的應(yīng)用對(duì)已發(fā)現(xiàn)基因的改造應(yīng)用基因修飾技術(shù)和點(diǎn)突變技術(shù)提高目的基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性、t1／2、提高表達(dá)量，減少毒性或免疫原性。１5.最佳的基因表達(dá)體系：;目的基因的表達(dá)產(chǎn)量高;表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定;生物活性高和表達(dá)產(chǎn)物容易分離純化16.宿主細(xì)胞的選擇適合目的基因表達(dá)的宿主細(xì)胞應(yīng)滿(mǎn)足以下規(guī)定:1．容易獲得較高濃度的細(xì)胞；2.能運(yùn)用易得便宜原料；３.不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；4.發(fā)熱量低、需氧低、適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)；5容易進(jìn)行代謝調(diào)控;6.容易進(jìn)行ＤNA重組技術(shù)操作；7．產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，產(chǎn)物容易提取純化。17．大腸桿菌中的基因表達(dá)載體:是基因工程的目的和基本手段,是選用合適的載體把供體ＤNＡ(外源基因）運(yùn)載到受體細(xì)胞內(nèi),從而復(fù)制擴(kuò)增大量的目的DNA分子或轉(zhuǎn)錄表達(dá)為相應(yīng)的產(chǎn)物。基因工程載體分為:克隆載體,轉(zhuǎn)錄載體，表達(dá)載體;ＤNA(克隆載體)→DNＡ(轉(zhuǎn)錄載體）→RＮA→蛋白質(zhì)→（表達(dá)載體)１8．原核細(xì)胞的基因組特點(diǎn):①染色質(zhì)為環(huán)狀雙股DNA分子②具有操縱子結(jié)構(gòu)③結(jié)構(gòu)基因多為單拷貝④特定區(qū)域分布特異ＤNA順序，因此外源DNＡ分子可以插入原核細(xì)胞DＮＡ復(fù)制體系的特定區(qū)段1９．基因克隆載體定義：基因克隆載體是一類(lèi)可以承載外源基因并將其帶入受體細(xì)胞得以穩(wěn)定維持的DＮＡ分子。2)目前經(jīng)常使用的載體,有質(zhì)粒和病毒兩類(lèi)。各種不同的載體,盡管分子量大小、結(jié)構(gòu)和用途上存在著較大的差異,但是作為載體,它們應(yīng)當(dāng)具有一些共同的特性。特點(diǎn):①具有復(fù)制子②有單一限制內(nèi)切酶切位點(diǎn)或多克隆位點(diǎn)③有選擇性遺傳標(biāo)記如抗藥基因④拷貝數(shù)高⑤生物安全性好20．質(zhì)粒的分類(lèi)⒈按復(fù)制型式①?lài)?yán)緊型②松弛型⒉按基因轉(zhuǎn)移性①傳遞性質(zhì)粒②非傳遞性質(zhì)粒⒊按遺傳性狀產(chǎn)物分類(lèi):①抗生素抗性②限制酶、修飾酶系統(tǒng)21．真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)載體必須具有條件⑴載體可以獨(dú)立復(fù)制。載體自身是一個(gè)復(fù)制子，具有復(fù)制起點(diǎn)。⑵應(yīng)具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記，以利于外源基因的克隆鑒定和篩選。⑶應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能為大腸桿菌RNＡ聚合酶所辨認(rèn)。⑷應(yīng)具有阻遏子，使啟動(dòng)子受到控制,只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才干進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。⑸應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，只轉(zhuǎn)錄克隆的基因，所產(chǎn)生的mRNＡ較為穩(wěn)定。⑹所產(chǎn)生的ｍRＮA必須具有翻譯的起始信號(hào)ＡUG和SD序列，以便轉(zhuǎn)錄后順利翻譯。２2.影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素⑴外源基因的拷貝數(shù)：外源基因是克隆到載體上的,因此載體在宿主菌種的拷貝數(shù)就直接關(guān)系到外源基因的拷貝數(shù)。⑵外源基因的表達(dá)效率①啟動(dòng)子的強(qiáng)弱②核糖體接合位點(diǎn)的有效性③SD序列和起始密碼AＴG的間距④密碼子組成⑶表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性:①組建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白；②運(yùn)用大腸桿菌的信號(hào)肽或某些真核多肽中自身的信號(hào)肽，把真核基因產(chǎn)物搬動(dòng)到胞漿周質(zhì)的空隙中;③采用位點(diǎn)特異性突變的方法，改變真核蛋白質(zhì)中二硫鍵的位置,從而增長(zhǎng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性;④采用蛋白酶缺陷型大腸桿菌，有也許減弱表達(dá)產(chǎn)物的降解。⑷細(xì)胞代謝負(fù)荷：⑸工程菌的培養(yǎng)條件:外源基因的高水平表達(dá),不僅涉及宿主、載體和克隆基因三者之間的互相關(guān)系，并且與其所處的環(huán)境條件息息相關(guān),必須優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)條件，進(jìn)一步提高基因表達(dá)水平。2３．基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)①菌體的生長(zhǎng)與能量的關(guān)系碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的重要成分。碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量，當(dāng)菌體生長(zhǎng)所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時(shí)，菌體會(huì)產(chǎn)生乙酸,導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值下降,從而影響菌體的生長(zhǎng)。提高ｐＨ，可減少乙酸的克制作用。分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源,連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長(zhǎng)，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的克制作用。加入甲硫氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生。大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌體生長(zhǎng)速率。采用磷酸乙?；溉毕葜曜鳛樗拗骷?xì)胞，阻止乙酸產(chǎn)生,可提高產(chǎn)量。②菌體生長(zhǎng)與前體供應(yīng)的關(guān)系在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸(小分子前體)能使菌體比生長(zhǎng)率提高,蛋白合成增長(zhǎng)。基因工程菌質(zhì)粒的表達(dá)需與宿主細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，致工程菌生長(zhǎng)速率減少。質(zhì)粒存在對(duì)菌體代謝的影響：中檔拷貝質(zhì)粒（56拷貝)的工程菌中與前體合成有關(guān)的酶增長(zhǎng)，這些酶的基因大多受終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。如：三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)酰基酶等。高拷貝質(zhì)粒的工程菌(24０拷貝）中，生長(zhǎng)速率和菌體總蛋白合成均減少。這與工程菌大量前體被運(yùn)用引起前體局限性，從而產(chǎn)生“嚴(yán)緊反映”有關(guān)?！皣?yán)緊反映”是當(dāng)氨酰tＲNＡ局限性時(shí),核糖體在密碼子上停留,并合成被稱(chēng)為魔點(diǎn)的pｐGpp的結(jié)果。24.基因工程菌的不穩(wěn)定性、重要機(jī)制質(zhì)粒不穩(wěn)定：基因工程菌在傳代（25代以上)過(guò)程中常出現(xiàn)的現(xiàn)象。分裂不穩(wěn)定:指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變產(chǎn)生機(jī)制：１.受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對(duì)外源重組DNA分子的降解。2.外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長(zhǎng)代謝。3．重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)的不均勻分派,這是重組質(zhì)粒逃逸的基本因素。4.受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排。2５.常見(jiàn)分裂不穩(wěn)定的兩個(gè)因素:⑴含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率（質(zhì)粒丟失率);⑵這兩種菌(含質(zhì)粒菌和不含質(zhì)粒菌)比生長(zhǎng)速率差異的大小。提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法1.合適的宿主:宿主菌2.合適的載體:質(zhì)?？截悢?shù)3．選擇壓力：抗生素４．分階段控制培養(yǎng):⑴先使菌體生長(zhǎng)至一定密度;⑵再誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)5.控制培養(yǎng)條件：溫度、pＨ值、培養(yǎng)基組分、溶氧6．固定化:卡拉膠26.基因工程菌的培養(yǎng)方式：1分批培養(yǎng);2補(bǔ)料分批培養(yǎng);3連續(xù)培養(yǎng);4透析培養(yǎng)；5固定化培養(yǎng)27．影響發(fā)酵的因素有：⒈培養(yǎng)基⒉接種量⒊溫度⒋溶解氧⒌誘導(dǎo)時(shí)機(jī)⒍誘導(dǎo)表達(dá)程序7.pH2８.高密度發(fā)酵特點(diǎn)：菌體高密度,總表達(dá)量高；生物反映器體積小；單位體積生產(chǎn)能力高;生產(chǎn)周期短，分離成本小影響因素1.培養(yǎng)基:C源、N源種類(lèi)和含量；C:Ｎ含量比值；微量元素；無(wú)機(jī)鹽(磷影響表達(dá)質(zhì)粒的復(fù)制速率)２.溶氧濃度:空氣分離系統(tǒng)提高氧分壓；透明顫菌血紅蛋白基因克隆到菌體中，提高氧傳質(zhì)能力;菌體與小球藻混合培養(yǎng)，藻細(xì)胞光合作用產(chǎn)氧供菌體呼吸。3.ｐＨ值:大腸桿菌產(chǎn)酸、ＣＯ２必須加堿調(diào)節(jié)pH值4．溫度:控制菌體生長(zhǎng)，溫控誘導(dǎo)表達(dá)(誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和連續(xù)時(shí)間,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，2miｎ）5.代謝副產(chǎn)物：C源物質(zhì)供應(yīng)超過(guò)三羧酸循環(huán)或電子傳遞鏈能力,產(chǎn)生乙酸，克制菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)。采用流加補(bǔ)料法，或加入甘氨酸、甲硫氨酸克制乙酸生成。29.實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法１．發(fā)酵條件的改善（1)培養(yǎng)基的選擇:（2)建立流加式培養(yǎng)方式;(３）提高供氧能力2.構(gòu)建產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌(1)阻斷乙酸生產(chǎn)的重要途徑：（２)對(duì)碳代謝流進(jìn)行分流：（3）限制進(jìn)入糖酵解途徑的碳代謝流；（4)引入血紅蛋白基因。3.構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌３０.基因工程藥物的分離純化一.細(xì)胞破碎１.物理破碎法(1）高壓勻漿法(2）高速珠磨法（３)超聲破碎法(４）高壓擠壓法2.化學(xué)破碎法(１)滲透沖擊(2)增溶法(3）脂溶法３.生物破碎法:酶溶法二.固液分離１.離心沉淀法2.膜過(guò)濾法3.雙水相萃取三、重組蛋白的分離純化技術(shù)①技術(shù)條件溫和能保持產(chǎn)物生物活性。②選擇性好,能從復(fù)雜的混合物中有效的將目的產(chǎn)物分離，達(dá)成較高的純化倍數(shù)。③收率要高。④兩個(gè)技術(shù)間能直接銜接，不需要對(duì)物料加以解決。⑤純化過(guò)程要快,滿(mǎn)足高生產(chǎn)率的規(guī)定。目的產(chǎn)物的分離純化蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計(jì)根據(jù)其分子的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性來(lái)決定。31.分離純化的方法:色譜分離方法⑴離子互換層析(IEC）離子互換層析的基本原理是通過(guò)帶電的溶質(zhì)分子與離子互換劑中可互換的離子進(jìn)行互換,從而達(dá)成分離的目的。它具有分辨率高容量大操作容易,該法已成為多肽蛋白質(zhì)核酸分離純化的重要方法。⑵反相色譜和疏水色譜反相色譜和疏水色譜是根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的差異來(lái)分離純化的。反相色譜是運(yùn)用溶質(zhì)分子中非極性基團(tuán)與非極性固定相之間互相作用力的大小以及溶質(zhì)分子中極性基團(tuán)與流動(dòng)相中極性分子之間在相反方向作用力的大小差異進(jìn)行分離的。疏水層析的原理與反相色譜的原理相似，重要是運(yùn)用蛋白質(zhì)分子表面上的疏水區(qū)域和介質(zhì)中的疏水基團(tuán)之間的互相作用，無(wú)機(jī)鹽的存在能使互相作用力增強(qiáng)。固定相介質(zhì)表面的疏水性比反相色譜介質(zhì)表面的疏水性弱。為有機(jī)聚合物鍵合相或大孔硅膠鍵合相。⑶親和層析（AC)是運(yùn)用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附。配基:在親和層析中起可逆性結(jié)合的特異性物質(zhì)。載體：與配基結(jié)合的支撐物。親和層析可分三步：①配基固定化②吸附目的物③樣品解吸⑷凝膠過(guò)濾層析凝膠過(guò)濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì),小分子能進(jìn)入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動(dòng)，而大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，快速移動(dòng),運(yùn)用這種移動(dòng)差別可使大分子與小分子分開(kāi)。根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量和蛋白質(zhì)分子的動(dòng)力學(xué)體積的大小差異,可以運(yùn)用凝膠過(guò)濾來(lái)分離純化目的蛋白。重要應(yīng)用兩個(gè)方面：①脫鹽和更換緩沖液②蛋白質(zhì)分子的分級(jí)分離。在產(chǎn)品的形成階段前用于除去產(chǎn)物的多聚體及降解產(chǎn)物。３2.分離純化工藝應(yīng)遵循以下原則:⑴具有良好的穩(wěn)定性和反復(fù)性⑵盡也許減少組成工藝的環(huán)節(jié)⑶各技術(shù)環(huán)節(jié)間要互相適應(yīng)和協(xié)調(diào)⑷工藝過(guò)程中盡也許少用試劑⑸工藝所用時(shí)間要短⑹工藝和技術(shù)必須收率高、易操作、能耗低⑺具有較高的安全性33．基因工程藥物的質(zhì)量控制產(chǎn)品的鑒定、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性。產(chǎn)品的保存⒈液態(tài)保存⑴低溫保存⑵在穩(wěn)定pH條件下保存⑶高濃度保存⑷加保護(hù)劑保存⒉固態(tài)保存:冷凍干燥(預(yù)凍、升華、解吸干燥去除吸附水）３４.動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特點(diǎn)離體培養(yǎng)細(xì)胞類(lèi)型⒈貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)須有貼附的支持物表面，自身分泌或培養(yǎng)基中提供的粘附因子才干在該表面上生長(zhǎng)。兩種形態(tài)：成纖維細(xì)胞型(來(lái)源于中胚層組織的細(xì)胞）;上皮細(xì)胞型（來(lái)源于內(nèi)、外胚層組織的細(xì)胞）⒉懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)不依賴(lài)支持物表面,在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。如淋巴細(xì)胞。⒊兼性貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)不嚴(yán)格依賴(lài)支持物。動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)（⒈）動(dòng)物細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng):（⒉）細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附于基質(zhì),并有接觸克制現(xiàn)象。（⒊）正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的。（4)動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周邊環(huán)境十分敏感:對(duì)理化因素敏感,(⒌）動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基規(guī)定高：必需氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、葡萄糖、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子等。（⒍)動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同。３5.動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源的藥物的種類(lèi)(⒈）動(dòng)物細(xì)胞多肽與蛋白質(zhì)類(lèi)藥物(⒉)動(dòng)物酶與輔酶類(lèi)藥物（⒊)動(dòng)物核酸類(lèi)藥物(⒋)動(dòng)物糖類(lèi)藥物：（⒌)動(dòng)物脂類(lèi)藥物動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的藥物特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):分泌胞外、純化方便、翻譯后修飾蛋白糖基化，與天然產(chǎn)品一致。缺陷:培養(yǎng)條件高、成本貴、產(chǎn)量低，安全性問(wèn)題。３6.動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基細(xì)胞體外培養(yǎng)基本條件:①無(wú)菌②營(yíng)養(yǎng)充足,防止有害物質(zhì)③氧氣④隨時(shí)清除代謝有害物質(zhì)⑤良好的生存外環(huán)境:pH、滲透壓、離子濃度⑥及時(shí)分種,適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基的種類(lèi)和組成⒈天然培養(yǎng)基:血清、羊水、腹水等。成分復(fù)雜、成分不穩(wěn)定,來(lái)源少。2.合成培養(yǎng)基（常用培養(yǎng)基成分及配方）⑴氨基酸⑵維生素⑶糖類(lèi)⑷無(wú)機(jī)鹽⑸其它成分添加小牛血清的作用⑴提供生長(zhǎng)因子和激素⑵提供貼附因子和伸展因子⑶提供結(jié)合蛋白（辨認(rèn)離子、激素、維生素、脂質(zhì)）⑷提供必需脂肪酸和微量元素3.無(wú)血清培養(yǎng)基優(yōu)點(diǎn)：①提高反復(fù)性(細(xì)胞)②減少微生物污染(病毒）③供應(yīng)充足穩(wěn)定④細(xì)胞產(chǎn)品易純化⑤避免血清因素對(duì)細(xì)胞的毒性⑥減少血清中蛋白對(duì)生物測(cè)定的干擾動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法細(xì)胞分離、細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞傳代、細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇3７.動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法１.懸浮培養(yǎng)：懸浮培養(yǎng)即讓細(xì)胞自由地懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)增殖。它合用于一切種類(lèi)的非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞（懸浮細(xì)胞），也合用于兼性貼壁細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)條件均一,傳質(zhì)和傳氧較好,容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模。缺陷是由于細(xì)胞體積較小,較難采用灌流培養(yǎng)，因此細(xì)胞密度一般較低２.貼壁培養(yǎng)：貼壁培養(yǎng)是必須讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)方法。它合用于一切貼附依賴(lài)性細(xì)胞(貼壁細(xì)胞），也合用于兼性貼壁細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)是合用的細(xì)胞種類(lèi)廣,較容易采用灌流培養(yǎng)的方式使細(xì)胞達(dá)成高密度;缺陷是操作比較麻煩,需要合適的貼附材料和足夠的面積,培養(yǎng)條件不均一，傳質(zhì)和傳氧較差。３．貼壁－懸浮培養(yǎng)(假懸浮培養(yǎng)）:微載體培養(yǎng)既可發(fā)明相稱(chēng)大的貼附面積供細(xì)胞貼附生長(zhǎng)增殖,滿(mǎn)足了絕大多數(shù)細(xì)胞的基本規(guī)定,載體體積小，比重較輕,在輕度攪拌下即可攜帶細(xì)胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內(nèi),充足發(fā)揮了懸浮培養(yǎng)的一切優(yōu)點(diǎn)。操作方式1.分批式操作2.半連續(xù)式操作3.灌流式操作:取出、補(bǔ)充培養(yǎng)基,細(xì)胞仍保存在反映器內(nèi)。優(yōu)點(diǎn):1．營(yíng)養(yǎng)好,代謝廢物少。2.細(xì)胞密度高(107～1０８?jìng)€(gè)/mL)產(chǎn)量高。3.產(chǎn)品罐內(nèi)停留時(shí)間短。4.培養(yǎng)基比消耗率低。３8.動(dòng)物細(xì)胞生物反映器的類(lèi)型⒈攪拌罐式生物反映器⒉氣升式生物反映器⒊中空纖維式生物反映器⒋透析袋或膜式生物反映器⒌固定床或流化床式生物反映器基本規(guī)定1.生物反映器的材料無(wú)毒2.生物反映器的結(jié)構(gòu):滿(mǎn)足傳質(zhì)、傳熱、混合的功能３．密封良好,避免污染4.自動(dòng)檢測(cè)、調(diào)節(jié)控制精度高5．長(zhǎng)期連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)6.容器內(nèi)表面光滑,無(wú)死角７.拆裝、連接、清潔方便,能耐高壓蒸汽消毒8．設(shè)備成本低３９．動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品純化方法1.離心2.離子互換層析３.凝膠過(guò)濾4.親和層析5.鹽析和有機(jī)溶劑沉淀６．透析7.高壓液相層析動(dòng)物細(xì)胞制藥的前景(一)、改善表達(dá)載體，提高表達(dá)水平和產(chǎn)量(二)、運(yùn)用代謝工程，改善培養(yǎng)工藝，減少生產(chǎn)成本(三）、克制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)培養(yǎng)周期(四)、采用糖基化工程，提高產(chǎn)品質(zhì)量(五)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究（六）、組織工程的研究單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來(lái)源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)等特點(diǎn),４0.單克隆抗體及其制備制備單克隆抗體(McAｂ）是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無(wú)限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合,通過(guò)有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的?？乖c動(dòng)物免疫制備特定抗原的單克隆抗體,一方面要制備用于免疫的適當(dāng)抗原，再用抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫。有的抗原可以用化學(xué)合成：地高辛。多數(shù)抗原物為混合物須經(jīng)免疫、篩選、克隆化。為使雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定，采用免疫動(dòng)物和骨髓瘤細(xì)胞供體同一品系動(dòng)物進(jìn)行免疫。目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系多來(lái)自BALB／c小鼠和ＬO(píng)U大鼠,因此免疫動(dòng)物也采用相應(yīng)的品系。４1.基因工程抗體及其制備雜交瘤單抗為鼠源性,應(yīng)用人體產(chǎn)生人抗鼠抗體及毒副作用。對(duì)鼠源性的單抗進(jìn)行基因加工和改造。目的：減少免疫源性；減少相對(duì)分子量。人-鼠嵌合抗體、改形抗體、小分子抗體?；蚬こ炭贵w的類(lèi)型:人鼠嵌合抗體、改形抗體、Fab與Ｆv抗體、單鏈抗體、單域抗體和分子辨認(rèn)單位（最小辨認(rèn)單位)4２．抗體工程噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的基本方法①獲取目的基因②抗體庫(kù)技術(shù)的載體（噬菌體ｐhagｅmiｄ）③淘篩④表達(dá)與鑒定特點(diǎn)（⒈)模擬天然全套抗體庫(kù)（⒉)避開(kāi)了人工免疫和雜交瘤技術(shù)(⒊）可獲得高親和力的人源化抗體43.基因工程抗體表達(dá)(⒈)原核細(xì)胞表達(dá)(融合表達(dá),分泌表達(dá)）（⒉）真核細(xì)胞表達(dá)(分泌表達(dá))（⒊)轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)(⒋）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)4４.抗體診斷試劑的類(lèi)型:一、血清學(xué)鑒定用的抗體類(lèi)試劑二、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類(lèi)試劑三、導(dǎo)向診斷藥物四、CD單克隆抗體系列45.抗體治療藥物的種類(lèi)：以抗體為載體的導(dǎo)向治療藥物一、放射性同位素標(biāo)記的抗體治療藥物:抗體作為放射性核素的導(dǎo)向載體，標(biāo)記操作簡(jiǎn)便,用量小。放射性核素標(biāo)記的抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷較大。二、抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物：⒈常用的抗癌藥物氨甲喋呤（MTX)、阿霉素（ADM）、絲裂霉素(MＭC）等。以人血漿白蛋白作為中間載體,可明顯提高每分子抗體所攜帶的MTＸ量，使體外細(xì)胞毒性提高二倍。⒉抗體類(lèi)藥物逆轉(zhuǎn)耐藥性。3．抗體導(dǎo)向酶－前藥療法（antｉｂｏｄｙｄｉreｃｔeｄenｚymeprｏdrugtheraｐy,ＡDEＰT)關(guān)鍵是選擇適當(dāng)?shù)幕罨福八帉?duì)。三、毒素偶聯(lián)的抗體藥物第一代免疫毒素是包具有A、B鏈完整毒素和抗體的交聯(lián)物，其中B鏈非特異性結(jié)合，使其僅在體外應(yīng)用。第二代免疫毒素是運(yùn)用抗體或抗體片段與毒素的A鏈或與A鏈相似的單鏈核糖體失活蛋白的結(jié)合物。因避免了第一代免疫毒素的非特異性，故能在體內(nèi)有一定的抗腫瘤作用。第三代免疫毒素：重組免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗體基因重組表達(dá)。特異性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、滲透性佳、免疫源性低、可大量制備。制備方法：先克隆毒素基因,再運(yùn)用基因重組技術(shù)去除毒素中非特異性細(xì)胞結(jié)合部位基因。經(jīng)改造的毒素基因，再與載體基因重組，轉(zhuǎn)入受體菌中表達(dá),形成融合蛋白，再通過(guò)純化就得到重組免疫毒素。４６.植物組織和器官的培養(yǎng):植物無(wú)菌培養(yǎng)：（1）幼苗及植株的培養(yǎng)(2）愈傷組織培養(yǎng)（外植體,細(xì)胞聚集體）(3)懸浮培養(yǎng)（單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)的液體培養(yǎng)）（４）器官培養(yǎng)(5）胚胎培養(yǎng)初級(jí)代謝產(chǎn)物:核酸、蛋白質(zhì)、糖類(lèi)外植體(脫分化)→愈傷組織(再分化)→生長(zhǎng)點(diǎn)(形態(tài)發(fā)生）→芽、根→小植株４7.次級(jí)代謝產(chǎn)物:1.有明顯的分類(lèi)學(xué)區(qū)域界線(xiàn)2.其生物合成需要在一定條件下才干發(fā)生3.缺少明確的生理功能4.是生命活動(dòng)的多余成分重要有：生物堿、黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、有機(jī)酸、木質(zhì)素、皂苷類(lèi)、多元酚類(lèi)次級(jí)代謝作用是由特異蛋白質(zhì)調(diào)控產(chǎn)生的內(nèi)源化合物的合成、代謝及分解作用的綜合過(guò)程。48．植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基的組成(１）無(wú)機(jī)鹽(2）碳源(3)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（５種天然激素：生長(zhǎng)素、分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯）（4)有機(jī)氮源（5)維生素。固定化反映器：網(wǎng)狀多孔板;尼龍網(wǎng)套；中空纖維膜優(yōu)點(diǎn):細(xì)胞位置固定，易于獲得高密度細(xì)胞群及維持細(xì)胞間理化梯度,利于細(xì)胞組織化，易于控制培養(yǎng)條件及獲得較高含量的次級(jí)代謝產(chǎn)物。49．影響植物次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)和累積的因素:１.生物條件:外植體，季節(jié)，休眠，分化2.物理?xiàng)l件:溫度,光(光照時(shí)間,光強(qiáng)，光質(zhì)），通氣(O2),pH和滲透壓3．化學(xué)條件：無(wú)機(jī)鹽(Ｎ,Ｐ，Ｋ）,碳源,植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，維生素,氨基酸,核酸，抗生素，天然物質(zhì),前體4.工業(yè)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)罐類(lèi)型,通氣，攪拌和培養(yǎng)方法50.植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生物反映器的類(lèi)型、及其性能比較1．機(jī)械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng):根據(jù)植物細(xì)胞的特性,機(jī)械攪拌式生物反映器通常是在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上改善設(shè)計(jì)的。優(yōu)點(diǎn)：易于控制溫度、ｐH、溶氧及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度，混合均勻。2.鼓泡塔生物反映器:反映器底部的噴嘴及多孔板實(shí)現(xiàn)氣體混合分散。優(yōu)點(diǎn):適于對(duì)剪切敏感的細(xì)胞的培養(yǎng)，無(wú)運(yùn)動(dòng)部件，不易染菌，相對(duì)高的熱量和質(zhì)量傳遞,放大相對(duì)容易。缺陷：流體流動(dòng)形式難以擬定,混合不勻，缺少非牛頓流體的流動(dòng)與傳遞特性的數(shù)據(jù)。３．氣升式培養(yǎng)系統(tǒng)是最適合培養(yǎng)植物細(xì)胞的反映器之一。優(yōu)點(diǎn)：低剪切力,較好的混合，較高的氧傳遞效果。無(wú)運(yùn)動(dòng)部件,不易染菌，操作費(fèi)用低。缺陷:高密度培養(yǎng)時(shí)混合不均勻。4.轉(zhuǎn)鼓式生物反映器通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)促進(jìn)反映器內(nèi)氧及營(yíng)養(yǎng)物的混合。優(yōu)點(diǎn):在高密度培養(yǎng)時(shí)有高的傳氧能力。缺陷:放大困難,大規(guī)模操作困難。５.固定化細(xì)胞生物反映器：指固定在載體(惰性基質(zhì))上,在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞。采用固相培養(yǎng)，細(xì)胞有一定限度的分化發(fā)育，從而刺激調(diào)控代謝物合成的基因表達(dá)，促進(jìn)次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。方法:吸附法（共價(jià)交聯(lián)，表面固定化，膜固定化）；包埋法(多孔載體，凝膠包埋）；材料:聚氨基甲酸乙酯泡沫,中空纖維素固定化植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)：平床培養(yǎng)系統(tǒng)立體培養(yǎng)系統(tǒng)51．植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)優(yōu)缺陷:１.可保護(hù)細(xì)胞免受剪切。２.細(xì)胞可長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)使用，更換培養(yǎng)基帶走代謝物。3．易于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高密度培養(yǎng)。４．細(xì)胞間接觸良好,易于分化，有助于次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。５.減少細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定性。6.易于實(shí)現(xiàn)連續(xù)化操作。缺陷:固定化培養(yǎng)的植物細(xì)胞其代謝產(chǎn)物必須分泌到細(xì)胞外,多數(shù)植物細(xì)胞次級(jí)代謝產(chǎn)物存在于細(xì)胞內(nèi)或分泌到液泡中。52.植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)程序：Ⅰ選材：培養(yǎng)器官、組織的選擇:取有藥效成分的部位,且該部位較易成愈傷組織。Ⅱ細(xì)胞株系建立:建立懸浮細(xì)胞繁殖體系（液體培養(yǎng)）。Ⅲ大量培養(yǎng):將選出的優(yōu)良細(xì)胞株擴(kuò)大繁殖后,可作為細(xì)胞工廠(chǎng)化培養(yǎng)的生產(chǎn)“種子”,進(jìn)行大量培養(yǎng)。Ⅳ產(chǎn)品提取與純化：從植物細(xì)胞培養(yǎng)物中提取和純化有用的產(chǎn)品。應(yīng)用:大規(guī)模培養(yǎng)植物細(xì)胞;生產(chǎn)有用物質(zhì)。53.植物生物反映器選擇標(biāo)準(zhǔn)①供氧能力及氣泡分散限度②剪切力大小及對(duì)細(xì)胞的影響③高密度培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液的混合限度④溫度、ｐH及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的控制能力⑤細(xì)胞團(tuán)大小的控制能力⑥易于放大54.植物細(xì)胞制藥的進(jìn)展與展望:①誘導(dǎo)子在植物細(xì)胞工程研究中的應(yīng)用②前體飼喂③兩相法培養(yǎng)④轉(zhuǎn)基因技術(shù)在次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)中的應(yīng)用⑤植物生物轉(zhuǎn)化技術(shù)與生物制藥５5.酶的特性酶是由活細(xì)胞產(chǎn)生的具有特殊催化功能的一類(lèi)蛋白質(zhì)。特點(diǎn)：①催化效率高②專(zhuān)一性強(qiáng)③反映條件溫和④催化活性受到調(diào)節(jié)和控制來(lái)源:（1）化學(xué)合成法,（2）從微生物中提取分離56.酶工程的研究?jī)?nèi)容：（1)酶的分離、純化、大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用（2）酶和細(xì)胞的固定化及酶反映器的研究(傳感器,檢測(cè)器）（3）酶生產(chǎn)中基因工程技術(shù)的應(yīng)用及遺傳修飾酶(突變酶)的研究（4)酶的分子改造與修飾,結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的研究(5）.有機(jī)相中酶反映的研究（6）酶的克制劑、激活劑的研究（７）抗體酶、核酸酶的研究（8）.模擬酶及酶分子的人工設(shè)計(jì)研究5７.運(yùn)用微生物生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點(diǎn):1．微生物種類(lèi)繁多,酶的種類(lèi)齊全2.生長(zhǎng)繁殖快,生產(chǎn)周期短,產(chǎn)量高３.培養(yǎng)方法簡(jiǎn)樸,原料來(lái)源豐富，價(jià)廉經(jīng)濟(jì)效益好4．微生物又較強(qiáng)的適應(yīng)性，可通過(guò)基因工程哺育新的高產(chǎn)菌株５8.固定化酶的特點(diǎn)具有生物催化劑的功能,又有固相催化劑的功能。優(yōu)點(diǎn):①可多次使用。②反映后,酶、底物、產(chǎn)物易分開(kāi),產(chǎn)物中無(wú)殘留酶,易純化，產(chǎn)品質(zhì)量高。③反映條件易控制,可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化反映的連續(xù)化和自動(dòng)控制。④酶的運(yùn)用效率高。⑤比水溶性酶更適合于多酶反映。缺陷:①固定化時(shí)，酶活力有損失。②初始投資較大。③只能用于可溶性底物,并且分子量要小。④胞內(nèi)酶必須通過(guò)酶的分離純化過(guò)程。⑤與完整菌體相比不適宜多酶反映，特別時(shí)需要輔助因子的反映。59.酶和細(xì)胞固定化方法與制備技術(shù)方法:①載體結(jié)合法、②交聯(lián)發(fā)、③包埋法、④選擇性熱變性法制備：⑴吸附法制備固定化酶技術(shù)⑵包埋法制備固定化酶技術(shù)①界面沉降法②界面聚合法⑶交聯(lián)法制備固定化酶技術(shù)⑷共價(jià)結(jié)合法制備固定化酶技術(shù)60．固定化細(xì)胞的特點(diǎn)有細(xì)胞特性，生物催化劑功能，固相催化劑特點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn):①無(wú)須進(jìn)行酶的分離純化②保持酶的原始狀態(tài)，酶回收率高③細(xì)胞內(nèi)酶比固定化酶穩(wěn)定性高④細(xì)胞內(nèi)酶輔助因子可自動(dòng)再生⑤細(xì)胞自身含多酶體系,可催化一系列反映⑥抗污染能力強(qiáng)缺陷：①運(yùn)用的僅是胞內(nèi)酶,酶多副產(chǎn)物多②細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在擴(kuò)散限制作用③載體形成的空隙大小影響高分子底物的通透性61.固定化細(xì)胞反映器的類(lèi)型和特點(diǎn)⒈間歇式攪拌罐反映器:用于游離酶,反映后隨即放料,不回收游離酶。⒉連續(xù)流動(dòng)攪拌罐反映器:連續(xù)進(jìn)料、連續(xù)出料⒊填充床反映器:固定化酶填充于床層內(nèi)。反映器內(nèi)的流體的流動(dòng)形態(tài)為平推流（活塞流)流形。⒋流化床反映器:底物以足夠大的流速向上通過(guò)固定化酶床層,使固體顆粒處在流化狀態(tài)，達(dá)成混合的目的。流速使固定化酶顆粒不下沉又不溢出。⒌循環(huán)反映器：部分反映液流出和新加入底物流入液混合，在進(jìn)入反映床進(jìn)行循環(huán)。⒍連續(xù)流動(dòng)攪拌罐-超濾膜反映器:連續(xù)流動(dòng)攪拌罐的出口處裝有超濾膜，產(chǎn)物和未反映的底物可通過(guò)，酶被截留反復(fù)使用。⒎其它反映器：6２.模擬酶的的概念及分類(lèi)概念：人造的具有酶性質(zhì)的催化劑（分子模擬立體結(jié)構(gòu),化學(xué)結(jié)構(gòu)）特點(diǎn)：相對(duì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)樸，高效,高催化性，蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)分類(lèi):1.主-客體酶模型：2．膠束模擬酶3.肽酶:4.半合成酶:5.印跡酶：制備過(guò)程:1.使蛋白部分變性,擾亂起始蛋白的構(gòu)象2.使印跡分子與之結(jié)合３.用交聯(lián)劑交聯(lián)印跡的蛋白質(zhì)４.透析除去印跡分子63.酶的化學(xué)修飾的目的和意義:發(fā)明天然酶不具有的優(yōu)良特性,擴(kuò)大應(yīng)用領(lǐng)域。提高生物活性,增長(zhǎng)穩(wěn)定性,擴(kuò)展底物范圍６4．酶化學(xué)修飾的方法:1.酶的表面化學(xué)修飾:（1)大分子修飾。（２）小分子修飾。（3）交聯(lián)修飾。（4）固定化修飾。2．酶分子內(nèi)部修飾:⑴非催化活性基團(tuán)的修飾。⑵蛋白主鏈的修飾。(３）催化活性基團(tuán)的修飾(４)與輔助因子有關(guān)的修飾：（5）肽鏈伸展后的修飾：3.結(jié)合定點(diǎn)突變的化學(xué)修飾。65.修飾酶的特性⑴熱穩(wěn)定性提高⑵抗各類(lèi)失活因子能力提高⑶抗原性消除⑷體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)：⑸最適ｐH改變⑹酶學(xué)性質(zhì)變化⑺對(duì)組織分布能力改變。66.酶化學(xué)修飾的應(yīng)用及其局限性１.酶化學(xué)修飾的應(yīng)用(1)酶結(jié)構(gòu)與功能的研究(2）在醫(yī)藥方面的應(yīng)用（3)在工業(yè)方面的應(yīng)用2.酶化學(xué)修飾的局限性（1）某種修飾劑對(duì)某一氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)修飾專(zhuān)一性是相對(duì)的。(2）化學(xué)修飾后酶的構(gòu)象多少有些改變。(3)酶的化學(xué)修飾只能在具有極性的氨基酸殘基側(cè)鏈上進(jìn)行。（4）化學(xué)修飾法可以在酶結(jié)構(gòu)與功能的研究方面提供信息,但是還不夠準(zhǔn)確和系統(tǒng)。6７.酶的化學(xué)修飾的前景1．化學(xué)修飾可以改變天然酶各種活性，擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍?；瘜W(xué)修飾法是改造酶分子的有效方法,并且已有了一定的規(guī)律性和普遍性，具有廣泛的應(yīng)用前景。2.化學(xué)修飾法并不合用于所有的酶，基因工程法，蛋白質(zhì)工程法，人工模擬法,和某些物理修飾法可填補(bǔ)局限性。68.1.有機(jī)相酶反映的優(yōu)點(diǎn):（1）增長(zhǎng)疏水性底物或產(chǎn)物的溶解性。(２）熱力學(xué)平衡向合成方向移動(dòng)，如酯合成、肽合成(蛋白水解酶)。（3)可克制有水參與的副反映,如酸酐的水解等。(4）酶不溶于有機(jī)介質(zhì),易于回收再運(yùn)用。(5)容易從低沸點(diǎn)的溶劑中分離純化產(chǎn)物。（6）酶的熱穩(wěn)定性提高，ｐH的適應(yīng)性擴(kuò)大。(7)無(wú)微生物污染。（8)能測(cè)定某些在水介質(zhì)中不能測(cè)定的常數(shù)。(９）固定化酶方法簡(jiǎn)樸,可以只沉積在載體表面。(1０）酶在非水介質(zhì)中可以催化某些在水中不能進(jìn)行的反映(改變?nèi)軇┠芸刂频孜锏奶禺愋?、區(qū)域選擇性、立體選擇性),如脂肪酶水相催化酯的水解，有機(jī)相中催化酯化、轉(zhuǎn)酯、氨解等。2.有機(jī)相酶反映的溶劑體系(1）水-水溶性溶劑均相體系:乙醇、丙酮、甘油(2）水-水不溶性溶劑兩相體系:三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚(3）反向膠束（油包水酶)（４）單相有機(jī)溶劑體系：酶分子周邊有一層水分子膜（必需水)維持酶催化反映構(gòu)象。３．水和溶劑對(duì)有機(jī)溶劑中酶的影響（1)酶活力：最適含水量。(2)酶選擇性:對(duì)固定的底物有些酶選擇性會(huì)因所處的溶劑不同而變化。（３)酶的穩(wěn)定性：有機(jī)溶劑中酶的熱穩(wěn)定性隨系統(tǒng)水含量增長(zhǎng)而下降，水是酶熱失活的必須參與者。4.有機(jī)相的酶工程(1)酶的固定化：載體吸附法和凝膠包埋法，提高擴(kuò)散效果,增長(zhǎng)穩(wěn)定性，利于回收和連續(xù)化生產(chǎn)(２)酶的化學(xué)修飾和表面活性劑包埋：增長(zhǎng)酶表面疏水性，改善脂溶性和穩(wěn)定性,提高催化效率。６９．酶工程優(yōu)點(diǎn)：工藝簡(jiǎn)樸、效率高、生產(chǎn)成本低、環(huán)境污染小、產(chǎn)品收率高、純度好。70．發(fā)酵工程的研究?jī)?nèi)容：生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)和選育(菌種）培養(yǎng)基制備（培養(yǎng)基）發(fā)酵條件的優(yōu)化與控制(攪拌通氣,溶氧，發(fā)酵過(guò)程參數(shù)控制，反映器的設(shè)計(jì))產(chǎn)物的分離、提取與精制等(純化）菌種→工藝→設(shè)備71.優(yōu)良菌種的選育一、菌種選育的物質(zhì)基礎(chǔ):DＮA二、自然選育：自發(fā)突變（正負(fù))三、誘變育種：人工誘變四、原生質(zhì)體融合：細(xì)胞融合，基因重組72.誘變育種(一)方法和原理1.誘變機(jī)制（1)微小損傷突變：堿基置換，碼組移動(dòng)（2）染色體畸變：易位,逆位,缺失,反復(fù)（3）染色體組突變:數(shù)目變化（單倍體變多倍體）２.誘變劑：物理誘變劑，化學(xué)誘變劑,生物誘變劑（二)誘變和篩選初步篩選是關(guān)鍵環(huán)節(jié)１.自身耐藥突變株:耐受自身分泌的抗生素，提高產(chǎn)量2.結(jié)構(gòu)類(lèi)似物或前體類(lèi)似物的耐受突變株：解除反饋克制3.營(yíng)養(yǎng)缺陷型及其回復(fù)突變株３.營(yíng)養(yǎng)缺陷型及其回復(fù)突變株通過(guò)誘變導(dǎo)致某些基因的突變，而需要添加一些物質(zhì)（氨基酸、核苷酸等）才干生長(zhǎng)的突變體。7３．營(yíng)養(yǎng)缺陷型的作用:1解除末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用。2作為標(biāo)記，在雜交育種作為出發(fā)菌株有助于雜交重組的分析。3作為基因工程的受體菌，檢出克隆基因的表達(dá)。誘變涉及:出發(fā)菌株的選擇→誘變劑種類(lèi)和誘變劑劑量的選擇→合理的使用方法篩選涉及：初篩→反復(fù)篩選→突變株性能檢測(cè)→直到獲得新的優(yōu)良菌株。74．發(fā)酵方式一、分批(間歇)發(fā)酵:物料一次投入反映器中,滅菌、接種、發(fā)酵。特點(diǎn):一次性;發(fā)酵過(guò)程中,營(yíng)養(yǎng)不斷減少，微生物不斷增殖，環(huán)境非穩(wěn)態(tài)；微生物生長(zhǎng)的四個(gè)時(shí)期明顯。應(yīng)用廣泛，需改善（在線(xiàn)檢測(cè),計(jì)算機(jī)控制）。二、補(bǔ)料分批發(fā)酵：補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基。特點(diǎn)：可以解除底物克制、產(chǎn)物克制或克服微生物過(guò)度生長(zhǎng);提高有用產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率；應(yīng)用廣泛,用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工業(yè);三、連續(xù)發(fā)酵：恒化器、恒濁器,連續(xù)進(jìn)料出料平衡，保持恒定的發(fā)酵液密度。優(yōu)點(diǎn)：操作穩(wěn)定;利于機(jī)械、自動(dòng)化；提高設(shè)備的運(yùn)用率;減少滅菌次數(shù);易于過(guò)程優(yōu)化。缺陷：易染菌；微生物易變異；對(duì)產(chǎn)品類(lèi)型的適應(yīng)性不廣;對(duì)設(shè)備及附件規(guī)定高。75.發(fā)酵工藝控制一、培養(yǎng)基的影響及其控制二、溫度的影響及其控制三、溶氧的影響及其控制四、pH的影響及其控制①培養(yǎng)基的影響及其控制1.碳源：糖類(lèi)，脂肪，有機(jī)酸，碳?xì)浠衔?速效碳源葡萄糖;遲效碳源淀粉,乳糖）2.氮源：無(wú)機(jī)氮源，有機(jī)氮源(速效氮源氨基酸,玉米漿;遲效氮源黃豆餅粉，花生餅粉、棉籽餅粉)。速效促生長(zhǎng),遲效利代謝。3.無(wú)機(jī)鹽和微量元素4.水5.發(fā)酵培養(yǎng)基的配制（1）提供必要的營(yíng)養(yǎng)成分（2)配制合適的濃度(3)主成分與其他成分的配比（4)控制合適的pH。培養(yǎng)基的重要成分（１）碳源：①提供能源②菌體成分③產(chǎn)物碳架。（２）氮源①構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)②構(gòu)成產(chǎn)物。(3)無(wú)機(jī)鹽及微量元素:①構(gòu)成菌體成分②激活酶（Mg2＋）③輔酶或輔基的組成部分④參與能量轉(zhuǎn)移反映⑤調(diào)節(jié)滲透壓、ｐH、氧化還原電位。(４）特殊生長(zhǎng)因子：①構(gòu)成輔酶②促進(jìn)生命活動(dòng)。(5)水：①機(jī)體的重要組成成分;②參與一些代謝反映；③良好溶劑(介質(zhì))和熱導(dǎo)體；②溫度的影響及其控制影響發(fā)酵溫度變化的因素（1)生物熱：生長(zhǎng),呼吸,繁殖（2）攪拌熱：摩擦(3）蒸發(fā)熱：（4)輻射熱：罐內(nèi)外溫差③融氧的影響及其控制④ｐH的影響及其控制7６.細(xì)胞破碎的方法及其優(yōu)缺陷一、吸附法:優(yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)樸,成本低,缺陷：吸附不穩(wěn)定,選擇性不高,不能連續(xù)生產(chǎn),影響衛(wèi)生,新型吸附劑（大孔樹(shù)脂）二、沉淀法:抗生素等電點(diǎn)沉淀或與酸、堿、離子形成復(fù)鹽沉淀析出，改變ｐH重新溶解。如土霉素,四環(huán)素,金霉素優(yōu)點(diǎn):設(shè)備簡(jiǎn)樸，節(jié)省溶劑,收率高缺陷:過(guò)濾較困難三、溶劑萃取法:改變pH,改變?nèi)軇?改變?nèi)芙舛?。?yōu)點(diǎn):產(chǎn)品純度高,濃縮倍數(shù)大，能連續(xù)生產(chǎn),周期短缺陷:溶劑耗量大,成本高，設(shè)備規(guī)定高四、離子互換法：帶負(fù)電荷的酸性抗生素用陰離子互換樹(shù)脂:萬(wàn)古霉素,桿菌肽帶正電荷的堿性抗生素用陽(yáng)離子互換樹(shù)脂:鏈霉素,卡那霉素，巴龍霉素,慶大霉素。優(yōu)點(diǎn):設(shè)備簡(jiǎn)樸,節(jié)省溶劑,操作方便缺陷：ｐH變化大，周期長(zhǎng)７7.抱負(fù)的微生物細(xì)胞生物反映器的基本規(guī)定:(１)．生物反映器的材料無(wú)毒，穩(wěn)定性好，一般用不銹鋼制成(2).生物反映器的結(jié)構(gòu):滿(mǎn)足傳質(zhì)、傳熱、混合的功能(３).密封良好，避免污染（4)．自動(dòng)檢測(cè)、調(diào)節(jié)控制精度高（５）.攪拌器轉(zhuǎn)速和通氣應(yīng)適當(dāng)（６）.容器內(nèi)表面光滑,無(wú)死角,利于清潔、滅菌（7).拆裝、連接、清潔方便，能耐高壓蒸汽消毒(8).設(shè)備成本低78．基因工程在發(fā)酵工程中的應(yīng)用①基因工程在抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用克隆抗生素生物合成基因的策略和方法:（1)在標(biāo)準(zhǔn)宿主系統(tǒng)中克隆檢測(cè)單基因產(chǎn)物（鳥(niǎo)槍法）(2）阻斷變株法（３)突變克隆法：基因重組（４)直接克隆法:克隆整套生物合成基因,如頭霉素C（5）克隆抗生素抗性基因法：抗性基因與合成基因連鎖（６)寡核苷酸探針?lè)ǎ?7）同源基因雜交法：結(jié)構(gòu)類(lèi)似的抗生素有同源的生物合成基因。3、提高抗生素產(chǎn)量（1)增長(zhǎng)參與生物合成限速階段基因的拷貝數(shù)(2)通過(guò)調(diào)節(jié)基因的作用(3）增長(zhǎng)抗性基因4、改善抗生素的組分5、改善抗生素生產(chǎn)工藝:克隆血紅蛋白基因到抗生素產(chǎn)生菌中,提高細(xì)胞氧的運(yùn)用率。6、產(chǎn)生雜合抗生素(1)生物合成途徑中某個(gè)酶基因突變(2)引入一個(gè)酶基因(3)運(yùn)用底物特異性不強(qiáng)的酶催化形成新產(chǎn)物7、組合生物合成:微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物合成是多酶體系參與的,特點(diǎn)是:（1)通過(guò)多個(gè)催化功能的組合完畢復(fù)雜化合物的合成（2）化合物為天然產(chǎn)物（3）合用于化學(xué)合成困難的復(fù)雜化合物②在氨基酸生產(chǎn)中的應(yīng)用③在維生素生產(chǎn)中的應(yīng)用79．基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的兩種重要表現(xiàn)形式是什么?重要機(jī)制是什么?

答:基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性重要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性,這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式:１.結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性：重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失，重排,修飾,導(dǎo)致其表觀(guān)生物學(xué)功能的喪失２.分派不穩(wěn)定性：整個(gè)重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸.

基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機(jī)制：1.受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對(duì)外源重組ＤＮA分子的降解2．外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長(zhǎng)代謝3.重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)的不均勻分派，這是重組質(zhì)粒逃逸的基本因素4.受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排

80.在人胰島素AＢ鏈分別表達(dá)法中，為什么將AB鏈編碼序列與b－半乳糖苷酶基因融合？

答:小分子蛋白在大腸桿菌中表達(dá)后不穩(wěn)定,容易被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶降解失活．表達(dá)融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)是基因操作簡(jiǎn)便;在菌體內(nèi)比較穩(wěn)定,不易被細(xì)菌酶類(lèi)所降解，容易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá).人胰島素ＡB鏈分別表達(dá)法中,將Ａ,B鏈編碼序列與ｂ-半乳糖苷酶基因融合,分別表達(dá)出融合蛋白,使表達(dá)的蛋白分子量足夠大,避免被蛋白水解酶分解,提高其穩(wěn)定性及表達(dá)率．?8１．闡述基因工程藥物研制有那些重要過(guò)程??答：基因工程藥物的生產(chǎn)必須一方面獲得目的基因,然后用限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶將所需目的基因插入適當(dāng)?shù)妮d體質(zhì)?；蚴删w中并轉(zhuǎn)入大腸桿菌或其他宿主菌(細(xì)胞)，以便大量復(fù)制目的基因.對(duì)目的基因要進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶和核苷酸序列分析.目的基因獲得后,最重要的就是使目的基因表達(dá).基因的表達(dá)系統(tǒng)有原核生物系統(tǒng)和真核生物化的難易．將目的基因與表達(dá)載體重組,轉(zhuǎn)入合適表達(dá)系統(tǒng)，獲得穩(wěn)定高效表達(dá)的基因工程菌。建立適于目的基因高效表達(dá)的發(fā)酵工藝，以便獲得較高產(chǎn)量的目的基因表達(dá)產(chǎn)物.。建立起一系列相應(yīng)的分離純化,質(zhì)量控制，產(chǎn)品保存等技術(shù)．

82.對(duì)鼠源性單克隆抗體進(jìn)行改造的目的是什么?鼠源性單克隆抗體改造后的小分子抗體類(lèi)型？?答:對(duì)鼠源性的單抗進(jìn)行基因加工和改造，可使人的Ig分子具有鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性?？上庖咴葱?。減少相對(duì)分子量。(1)人-鼠嵌合抗體:將鼠MAb的可變區(qū)和人抗體的恒定區(qū)組成嵌合抗體由于這兩部分在空間結(jié)構(gòu)上相對(duì)獨(dú)立,其獨(dú)特的抗體親和力保持得很好，但因鼠單抗可變區(qū)的存在，應(yīng)用時(shí)仍有較強(qiáng)的排斥反映.?(2)改形抗體:在嵌合抗體的基礎(chǔ)上進(jìn)一步將鼠MAｂ可變區(qū)中相對(duì)保守的ＦＲ替換成人的FR,保存與抗原結(jié)合的ＣDR部位?（3)Fab抗體：Ｆab段由重鏈Ｖ區(qū)及CH1功能區(qū)與整個(gè)輕鏈以二硫鍵形式連接而成，重要發(fā)揮抗體的抗原結(jié)合功能.Faｂ抗體只有完整IgG的1/3.

(4）單鏈抗體:單鏈抗體是由一段彈性連接肽把抗體可變區(qū)重鏈與輕鏈相連而成,是具有親代抗體所有抗原結(jié)合特異性的最小功能結(jié)構(gòu)單位.

(５)單域抗體：只含Ｖ區(qū)基因片段的小分子抗體,即只有VH或VL一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，也能保持原單克隆抗體的特異性．這種小分子的抗體片段就稱(chēng)為單域或單區(qū)抗體,其分子量?jī)H為整個(gè)Ig分子的1/1２.?(6)分子辨認(rèn)單位:只具有一個(gè)CDR多肽的抗體.。８3．抗體治療藥物有哪些？答：以抗體為載體的導(dǎo)向治療藥物一、放射性同位素標(biāo)記的抗體治療藥物:抗體作為放射性核素的導(dǎo)向載體，標(biāo)記操作簡(jiǎn)便，用量小。放射性核素標(biāo)記的抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷較大。二、抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物：⒈常用的抗癌藥物氨甲喋呤、阿霉素、絲裂霉素等。以人血漿白蛋白作為中間載體，可明顯提高每分子抗體所攜帶的MＴX量，使體外細(xì)胞毒性提高二倍。⒉抗體類(lèi)藥物逆轉(zhuǎn)耐藥性。3.抗體導(dǎo)向酶-前藥療法關(guān)鍵是選擇適當(dāng)?shù)幕罨?前藥對(duì)。三、毒素偶聯(lián)的抗體藥物:在導(dǎo)向藥物中，毒素和抗體的交聯(lián)物稱(chēng)為免疫毒素。第一代免疫毒素是包具有Ａ、Ｂ鏈完整毒素和抗體的交聯(lián)物，其中B鏈非特異性結(jié)合，使其僅在體外應(yīng)用。第二代免疫毒素是運(yùn)用抗體或抗體片段與毒素的A鏈或與A鏈相似的單鏈核糖體失活蛋白的結(jié)合物。因避免了第一代免疫毒素的非特異性，故能在體內(nèi)有一定的抗腫瘤作用。第三代免疫毒素:重組免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗體基因重組表達(dá)。特異性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、滲透性佳、免疫源性低、可大量制備。制備方法：先克隆毒素基因,再運(yùn)用基因重組技術(shù)去除毒素中非特異性細(xì)胞結(jié)合部位基因。經(jīng)改造的毒素基因,再與載體基因重組，轉(zhuǎn)入受體菌中表達(dá)，形成融合蛋白,再通過(guò)純化就得到重組免疫毒素。１.生物技術(shù)的四大支柱:基因工程、_細(xì)胞工程、＿酶工程_和發(fā)酵工程。2．據(jù)記錄，人類(lèi)的遺傳病有6000多種，患者約占總?cè)丝诘?5%,近年來(lái)平均每年還要增長(zhǎng)10０多種新探明的遺傳性綜合癥；這些疾病歸根到底都跟＿基因_有關(guān),理論上都可以在基因水平上找到的防止、診斷和治療方法。3.19８２年,世界上第一個(gè)基因工程藥物

＿胰島素投放市場(chǎng)；19９2年,我國(guó)第一個(gè)基因工程藥物

_rＨUＩＦＮαIｂ_上市;目前國(guó)際市場(chǎng)上銷(xiāo)售最佳的基因工程藥物涉及:_促紅細(xì)胞生成素ＥPO、＿粒細(xì)胞集落刺激因子_、_重組白細(xì)胞介素_、_重組人干擾素＿等。4.生物技術(shù)藥物大體上可以分為：蛋白質(zhì)藥物和_多肽藥物＿;5.根據(jù)目的的不同，載體可分為克隆載體_和_表達(dá)載體_;尚有一種載體可以在兩種宿主系統(tǒng)里復(fù)制或表達(dá),稱(chēng)為穿梭載體,如:大腸桿菌－酵母穿梭載體、大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體。６．基因工程菌的培養(yǎng)方式有：補(bǔ)料分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、透析培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)＿。核酸類(lèi)藥物涉及:_抗病毒劑_、_抗腫瘤劑_、干擾素誘導(dǎo)劑_、免疫增強(qiáng)劑等。7.作為一個(gè)表達(dá)載體至少具有的4個(gè)元件:多克隆位點(diǎn)、選擇標(biāo)記、復(fù)制起點(diǎn)和啟動(dòng)子。8．目的基因在大腸桿菌中的表達(dá)方式：包涵體異源蛋白表達(dá),分泌性表達(dá)和融合型異源蛋白表達(dá)三種。9.按照生長(zhǎng)特性,動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞可分為_(kāi)貼壁細(xì)胞_、__懸浮細(xì)胞_、兼性貼壁細(xì)胞；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHＯ)屬于_兼性貼壁細(xì)胞_。10.根據(jù)目的的不同，載體可分為克隆載體_和_表達(dá)載體_;尚有一種載體可以在兩種宿主系統(tǒng)里復(fù)制或表達(dá),稱(chēng)為穿梭載體，如:大腸桿菌-酵母穿梭載體、大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體。11．重要的動(dòng)物生物反映器有:攪拌罐式生物反映器、氣升式生物反映器、固定床式生物反映器;此外,袋式或膜式生物反映器、中空纖維式生物反映器、可同時(shí)制備巨載體和微囊等固定化培養(yǎng)的生物反映器。12.植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生物反映器的類(lèi)型有：機(jī)械攪拌式生物反映器、鼓泡塔生物反映器、氣升式生物反映器、轉(zhuǎn)鼓式生物反映器、固定化細(xì)胞生物反映器。１3.多功能抗體構(gòu)建方法:化學(xué)交聯(lián)法、生物學(xué)方法(雜種－雜交瘤）、基因工程法1４．植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)：成批培養(yǎng)法、半連續(xù)培養(yǎng)法、連續(xù)培養(yǎng)法、固定化培養(yǎng)法1５.酶在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用1.疾病診斷：2.疾病治療:３.藥物生產(chǎn):４.分析檢測(cè):16.固定化細(xì)胞的制備技術(shù)載體結(jié)合法、包埋法、交聯(lián)法、無(wú)載體法１7.細(xì)胞破碎的方法有機(jī)械、生物和化學(xué)等各種方法。

B補(bǔ)料分批培養(yǎng)：是將種子接入發(fā)酵反映器中進(jìn)行培養(yǎng),通過(guò)一段時(shí)間后間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基(溶氧控制、流加補(bǔ)料)，使菌體進(jìn)一步生長(zhǎng)的方法。良好的生長(zhǎng)環(huán)境，延長(zhǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得高密度菌體。C次級(jí)代謝作用:是由特異蛋白質(zhì)調(diào)控產(chǎn)生的內(nèi)源化合物的合成