高效液相色譜儀的原理及應(yīng)用

高效液相色譜儀的原理及應(yīng)用2023/2/5一、高效液相色譜法的定義和分類流動相是液體的色譜稱為液相色譜（LC）。在液相色譜中，采用顆粒十分細(xì)的高效固定相，并采用高壓泵輸送流動相，全部工作通過儀器完成，這種色譜稱為高效液相色譜（HPLC）

。第一節(jié)高效液相色譜法原理2023/2/5一、高效液相色譜法的定義和分類液相色譜：平板色譜和柱色譜。液相色譜：分配色譜、液固色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜。氣相色譜：揮發(fā)性物質(zhì)，不能用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)分析。液相色譜：可分析各種物質(zhì)，熱不穩(wěn)定物質(zhì)，但流動相有毒，運行操作比GC難。能用GC就用GC。2023/2/5二、液相色譜中常用術(shù)語和參數(shù)只針對HPLC特有的，其余術(shù)語與第三章同。粒間體積（V0）：色譜柱填充劑顆粒間隙中流動相所占有的體積?？左w積（Vp）

：色譜柱中多孔填充劑的所有孔洞中流動相所占有的體積。2023/2/5二、液相色譜中常用術(shù)語和參數(shù)柱外體積（Vext）：從進(jìn)樣系統(tǒng)到檢測器之間色譜柱以外的液路部分中流動相所占有的體積。液體總體積（Vtot）

：粒間體積、孔體積和柱外體積之和。淋洗體積（V）：從進(jìn)樣開始計算的通過色譜柱的實際淋洗體積。2023/2/5三、反相高效液相色譜由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱），代表性的流動相是甲醇和乙腈。是當(dāng)今液相色譜的最主要分離模式。溶質(zhì)在填料表面的烴類和流動相之間進(jìn)行分配。溶質(zhì)在吸附于填料表面烴類上的“改良固定相”和流動相之間進(jìn)行分配溶質(zhì)被吸附于填料表面烴類分子上，類似吸附色譜。2023/2/5四、正相高效液相色譜是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動相所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC。溶劑洗脫強(qiáng)度近似地隨溶劑的介電常數(shù)增加而增大，洗脫能力越弱，溶質(zhì)在柱上保留時間越長。2023/2/5第二節(jié)高效液相色譜儀的組成Agilent11002023/2/51.輸液系統(tǒng)2.進(jìn)樣系統(tǒng)3.分離系統(tǒng)4.檢測系統(tǒng)5.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)一高效液相色譜儀系統(tǒng)高壓泵流動相溶劑廢液色譜柱進(jìn)樣口檢測器2023/2/51、輸液系統(tǒng)

貯液裝置脫氣裝置高壓輸液泵梯度淋洗系統(tǒng)輸液系統(tǒng)的功能:

1.提供足夠的驅(qū)動力使流動相通過填充柱2.使流動相流量精確和穩(wěn)定3.使流動相組成精確2023/2/5

分析用高效液相色譜的流動相貯罐，常用1L的錐形瓶加一個電磁攪拌器，在連接到泵入口處的管線上要加一個過濾器。

(1)貯液裝置2023/2/5(2)脫氣裝置用于脫去流動相中的溶解氣體，流動相先經(jīng)過脫氣裝置再輸送到色譜柱。脫氣機(jī)、超聲脫氣、真空脫氣等。

2023/2/5(3)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。μL/min~幾千mL/min應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性2023/2/5(4)梯度淋洗裝置2023/2/5等度洗脫輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測器單一或混合溶劑2023/2/5分析時間長分離度差

MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2等度洗脫怎樣解決呢？2023/2/5梯度洗脫

A泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測器

B泵AB時間B濃度2023/2/595%30%MeOH梯度洗脫優(yōu)點：可提高分離度、縮短分離時間、降低最小檢測量和提高分離精度。2023/2/5

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置：2、進(jìn)樣系統(tǒng)2023/2/5

高效分離柱直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～8mm，柱長5～40cm。3、分離系統(tǒng)2023/2/5色譜柱填料C18色譜柱十八烷基硅基化學(xué)鍵合到多孔硅膠或陶瓷微粒SIL多孔硅膠微粒ZORBAXEclipseXDB-C8辛基硅烷化學(xué)鍵合到多孔硅膠微粒上2023/2/5柱的保養(yǎng)：1.柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動；2.當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時，閥件或管路一定要清洗干凈；3.要注意流動相的脫氣；4.避免使用高粘度的溶劑作為流動相；5.進(jìn)樣樣品要預(yù)先提純；6.嚴(yán)格控制進(jìn)樣量；7.每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品；8.每天分析測定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?.若分析柱長期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉；2023/2/51）柱壓低于150kg/cm2（15cm色譜柱）2）柱溫在40℃左右，最高使用溫度為50℃3）流動相pH使用范圍為2～7.5ODS柱的使用注意點：2023/2/5目前最常用的檢測器主要有：紫外-可見檢測器熒光檢測器電化學(xué)檢測器折光示差檢測器蒸發(fā)光散射檢測器質(zhì)譜檢測器4、檢測系統(tǒng)2023/2/5

a.紫外檢測器應(yīng)用最廣，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。

UV燈光柵流通池參考二極管采樣二極管截止棱鏡氧化鈥濾光片狹縫鏡2鏡12023/2/5b.光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機(jī)快速處理，三維立體譜圖。2023/2/5c.熒光檢測器高靈敏度、高選擇性；對多環(huán)芳烴、維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。2023/2/5d.質(zhì)譜檢測器：2023/2/5二、高效液相液相色譜固定相和流動相

1.固定相（1）全多孔型擔(dān)體

由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；（2）表面多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）

30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；2023/2/5（3）化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣；

c.硅碳鍵型：≡Si—C

d.硅氮鍵型：≡Si—N2023/2/52.流動相

按流動相組成分：單組分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時間。2023/2/5流動相選擇

在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)2023/2/5

1、環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析

固定相：薄殼型硅膠(37～50m)流動相：正己烷流速：1.5mL/min色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)檢測器：折光示差檢測器

可對水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析。第三節(jié)HPLC的應(yīng)用2023/2/52、稠環(huán)芳烴的分析

稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC柱壓：70104Pa

檢測器：紫外檢測器2023/2/5例：液相色譜法測定食品中苯并(a)芘原理：樣品經(jīng)過提取、皂化以及柱層析凈化，除去脂肪類物質(zhì)、色素等雜質(zhì)后，再通過液相色譜儀中的色譜柱，將苯并芘從多環(huán)芳烴物質(zhì)中分離出來。求出樣品中苯并芘的含量。儀器：(1)液相色譜儀：色譜柱：ODS柱，柱長250mm，Φ4mm；

柱溫：30℃；流動相：75％甲醇；流速：2mL／min。(2)檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長369nm，熒光波長405nm。2023/2/5操作步驟：(1)定性測定用微量注射器吸取一定量的苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣液，注入色譜儀內(nèi)，根據(jù)苯并芘的出峰保留時間和樣品中加標(biāo)準(zhǔn)樣產(chǎn)生重疊的情況進(jìn)行定性。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用微量注射器準(zhǔn)確吸取每1mL含1μg的苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、4、5uL按照上述實驗條件進(jìn)行操作，以獲得相應(yīng)的色譜圖。然后，分別測量各個色譜的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)苯并芘量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)樣品的測定：在上述實驗條件下，吸取一定量經(jīng)過柱凈化的樣品提取液，注入液相色譜儀中進(jìn)行分離、分析，測得峰面積，然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)于此面積的苯并芘含量。2023/2/5

Waters515高效液相色譜泵，Wa